环境样品中有机磷的高通量测定与分类

本实验的总体目标是对土壤或粪便样品提取物中经酶水解的有机磷进行分类。首先使用氢氧化钠-EDTA溶液提取样品，并调节提取物的pH值，然后将调节后的提取物分别与两种不同的酶溶液进行孵育。

在96孔板上，最后一步是采用钼蓝比色法测定酶释放的正磷酸盐。最终，大多数天然的正磷酸单酯磷和二酯磷形态可根据酶水解法释放正磷酸盐的差异，对土壤或粪肥样品中的磷进行分类。该方法可在任何标准实验室中以较低成本完成。

与现有的磷-31核磁共振波谱法相比，其主要优势在于能够测量土壤中天然酶从有机磷化合物中释放正磷酸盐的潜力，从而预测土壤肥力或土壤释放对藻类具有危害性水平的可利用正磷酸盐的潜力。在50毫升锥形管中，向2克湿或干样品加入30毫升0.25摩尔的氢氧化钠溶液。

在室温下振荡孵育16小时。将样品以3000 × g离心30分钟，然后取100 µL转移至已含有乙酸盐缓冲液的1.5 mL微量离心管中。调整后的样品总体积为1 mL，pH为5.0。

配制两种酸性磷酸酶储备液，每种含0.5单位/毫升酸性磷酸酶，溶于10毫升新配制的0.1摩尔/升乙酸钠缓冲液（pH 5）中。向其中一份10毫升酸性磷酸酶储备液中加入经重悬的冻干核酸酶NP1（来自青霉菌Citron），使其终浓度为2.5单位/毫升NP1，通过反复倒置轻柔混匀。将两种酶溶液在3000 × g离心30分钟。为建立标准曲线，首先取1毫升1毫摩尔/升磷酸钾储备液加入1.5毫升离心管中，随后进行七次0.5毫升系列稀释，弃去第一管，使最终磷浓度范围为20 µM至0.625 nM。

现在将正磷酸盐标准品加入到板的最后两列中，从第10列第A行开始，依次加入0 nM正磷酸盐，至第H行加入20 nM正磷酸盐，每列前三个孔各加一种浓度。向第10列接下来的三个孔中加入40微升PP加GP酶溶液。再向随后三个孔中加入40微升PP加GP加NP一种酶溶液。

最后，向所有六个孔中加入 40 微升 100 毫摩尔的醋酸盐缓冲液。现在，第 10 列的前六个孔中每个孔应含有 80 微升溶液，接着向接下来的两个孔中加入 40 微升含有 10 M 葡萄糖、六磷酸和 40 微升 PP 加 GP 酶溶液的醋酸钠溶液。

对于每个待测样品，在所有样品分配完毕后，将40微升pH调整后的样品提取物分配至最多八行的第1至第9孔。使用多通道移液器将PP加GP酶溶液加入第1至第3列，将PP加GP加NP加入第4至第6列，将0.1摩尔醋酸钠缓冲液加入第7至第9列。此步骤需迅速操作，以确保所有样品获得相同的孵育时间。

将96孔板盖上盖子，于去离子水中37摄氏度下孵育样品、酶溶液、对照组及标准曲线，精确孵育1小时。使用多通道移液器快速配制四种储备溶液，每种各50毫升，溶液A必须每日新鲜配制。

向96孔板的所有孔中加入25 µL的SDS、100 µL溶液A、20 µL溶液B和50 µL溶液C，用盖板密封后在室温下孵育30分钟。最后，使用可调式酶标仪在850纳米波长下测定吸光度，并通过电子表格应用程序进行数据记录与分析。

首先，绘制无机磷标准曲线，以 0 至 20 纳摩尔磷为横轴（x 轴），以吸光度测定值的重复样平均值为纵轴（Y 轴），进行线性回归，并求出最佳拟合直线的方程。接着，通过计算第 1 至第 3 列数值的平均值来确定背景无机磷含量，然后将该标准曲线应用于数据集。接下来，为确定来源于水解的磷酸单酯的磷含量，取第 4 至第 6 列样品的三份重复测定值的平均值，减去对照酶溶液及背景无机磷的贡献。

然后，为了计算水解磷中的磷含量，DERs 对第七至第九列的三个重复样本值取平均，并从第四至第六列中减去对照酶溶液、背景无机磷以及水解单酯磷的含量。一个典型的96孔板显示了八个样本的结果和一条标准曲线。对照组位于第十列。

第一列到第三列与第四列到第六列之间的颜色强度增加是由于第四列到第六列之间存在水解的单酯磷化合物，而第七列到第九列的颜色变化则是由于二醚磷化合物的水解所致。此处采用高通量酶促水解方法，成功分析了佛蒙特州土壤样品经0.25摩尔氢氧化钠和0.05摩尔EDTA提取液中各类磷化合物的分布情况。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用酶促水解法测定土壤或粪肥提取物中的天然正磷酸盐、单酯磷和二酯磷化合物。

该技术可能有助于环境化学和养分管理领域的研究人员探索土壤或粪肥体系中有机磷的行为。