Name: 高通量测量和环境样品中的有机磷分类 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学习利用酶水解和钼蓝比色法对土壤或粪便样品中的有机磷进行分类。该方法可在标准实验室中高通量分析正磷酸盐、单酯磷和双酯磷，为环境化学和养分管理研究提供经济高效的土壤肥力评估工具。

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感谢美国地质调查局（USGS）和佛蒙特州水资源与湖泊研究中心提供资金支持。

1. 磷的提取
<ol>
 <li>配制1 L的0.25 M氢氧化钠（NaOH，40.00 g/mol）+ 0.05 M乙二胺四乙酸（EDTA，292.24 g/mol）溶液。</li>
 <li>在50 mL锥形管中，将30 mL NaOH + EDTA溶液加入2 g湿土或干燥样品中。</li>
 <li>在室温下振荡孵育16小时。</li>
 <li>以3000 ×g离心3分钟。</li>
</ol>
2. 样品提取液 pH 值调节
<ol>
 <li>取0.1 mL样品转移至1.5 mL微量离心管中。</li>
 <li>加入0.017 mL 2.5 M乙酸、0.144 mL 0.4 M醋酸盐缓冲液（含70.5%醋酸钠 [CH3COONa, 82.03 g/mol] 和29.5%乙酸，pH 5.0）以及0.739 mL去离子水。</li>
 <li>调节后提取液的终体积为1 mL，终pH值为5.0。</li>
</ol>
3. 酶母液的配制
<ol>
 <li>配制 1 L 0.1 M 醋酸钠（CH3COONa，82.03 g/mol）溶液，pH 5.0。</li>
 <li>在步骤3.1制备的醋酸钠缓冲液中，配制2份各10 mL的酸性磷酸酶储备液，使终浓度均为0.5单位/毫升。 
 I型酸性磷酸酶来自 Triticum aestivum （小麦胚芽；GP，通常为0.5 U mg-1 固体，EC 3.1.3.2） 
 IV-S型酸性磷酸酶 Solanum tuberosum （马铃薯；PP，通常为 4.6 U mg-1 固体，EC 3.1.3.2） 
 * 活性单位由供应商规定，其中1单位定义为每小时在溶液中释放1微摩尔正磷酸盐的量 37°C.</li>
 <li>重组冻干的核酸酶 P1（EC 3.1.30.1） Penicillium citrinum （真菌；NP1，通常为 500 U mg-1 固体）溶于1 mL去离子水中——此后可于 4°C 以备将来使用。</li>
 <li>将NP1移液至3.2步骤中准备的10 mL离心管之一，使终浓度为2.5 Units/mL NP1；通过反复倒置数次轻轻混匀。</li>
 <li>将两份10 mL酶溶液在3000 xg条件下离心30分钟。</li>
</ol>
4. P 标准曲线与对照
<ol>
 <li>配制 1 L 的 1 mM 磷酸钾（K2HPO4，174.18 g/mol）储备液。</li>
 <li>取 1 mL 上述 1 mM 磷酸钾储备液加入 1.5 mL 离心管中，并进行七次 0.5 mL 的连续稀释。</li>
 <li>弃去第一支试管中的溶液，使剩余 7 个稀释梯度的磷含量范围为 20 nmol–0.625 nmol P。</li>
 <li>将每支试管中的溶液各取 80 μL，重复加样至标准 96 孔板的 B–H 行。</li>
 <li>向第 11 和 12 列的 A 行各加入 80 μL 醋酸钠缓冲液（第 3.1 节），作为 0 nmol P 的校准点。</li>
 <li>此时第 11 和 12 列各包含 8 个无机磷酸盐参考样品，浓度范围为 0 nmol 至 20 nmol。</li>
 <li>第 10 列将包含以下对照：
 <ol>
 <li>向第 10 列的前三个孔中各加入 40 μL PP+GP 酶溶液和 40 μL 醋酸钠缓冲液（第 3.1 节）。</li>
 <li>向接下来的三个孔中各加入 40 μL PP+GP+NP1 酶溶液和 40 μL 醋酸钠缓冲液。</li>
 <li>向其中一个孔加入含 10 nmol 葡萄糖-6-磷酸（C6H11Na2O9P • xH2O，304.1 g/mol）的醋酸钠溶液 40 μL 和 PP+GP 酶溶液 40 μL；向第 10 列最后一个孔中加入醋酸钠溶液代替酶溶液。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. 样品与酶孵育
<ol>
 <li>每个待测样品将占据标准96孔板中1行的前9个孔。</li>
 <li>将第2节中pH调节后的样品提取液各40 μL分配至最多8行的1–9号孔中。</li>
 <li>所有样品分配完成后*，使用多通道移液器将PP+GP酶溶液加入1–3列，PP+GP+NP1加入4–6列，醋酸钠缓冲液（第3.1节配制）加入7–9列。 
 *此步骤必须迅速完成，以确保所有样品的孵育时间相等。</li>
 <li>用盖子盖好96孔板，将样品与酶溶液、对照组及标准曲线在37°C下准确孵育1小时。</li>
</ol>
6. 释放的和背景无机磷的比色法测定
<ol>
 <li>用去离子水分别配制以下每种溶液各 50 mL： 
 溶液 A*：0.1 M 抗坏血酸（C6H8O6，176.12 g/mol）+ 0.5 M 三氯乙酸（Cl3CCOOH，163.39 g/mol） 
 溶液 B：0.01 M 钼酸铵（(NH4)2MoO4，196.01 g/mol） 
 溶液 C：0.1 M 柠檬酸钠（HOC(COONa)(CH2COONa)2 2H2O，294.10 g/mol）+ 0.2 M 亚砷酸钠（NaAsO2，129.91 g/mol）+ 5% 冰醋酸 （CH3CO2H，60.05 g/mol）
 * 溶液 A 必须每日新鲜配制。</li>
 <li>使用多通道移液器迅速向 96 孔板的所有孔中加入 25 μL SDS 溶液、100 μL 溶液 A、20 μL 溶液 B 以及 50 μL 溶液 C。</li>
 <li>盖上板子，在室温下孵育 30 分钟。</li>
 <li>使用任意可调的微量板读数仪在 850 nm 处测定吸光度。</li>
</ol>
7. 磷化合物的分类
<ol>
 <li>将原始数据导入电子表格应用程序（例如 Microsoft Excel）。</li>
 <li>绘制无机磷标准曲线：以 x 轴表示 0 至 40 nmol P，y 轴表示吸光度重复测定值的平均值。</li>
 <li>进行线性回归，求得最佳拟合直线的方程。</li>
 <li>第 1–3 列：直接应用标准曲线——此为背景无机磷。</li>
 <li>第 4–6 列：取样品三份测定值的平均值，并从总吸光度中减去对照组（酶溶液 + 背景无机磷）——此为来自可水解磷单酯的磷。</li>
 <li>第 7–9 列：与第 5 步相同，但减去第 4–6 列的吸光度值——此为来自可水解磷二酯的磷。</li>
 <li>利用标准曲线方程将吸光度数据转换为释放的 nmol P。</li>
 <li>释放的 nmol P 可换算为原始土壤中每千克所含的 mg P。或者，分析各类磷所占比例也是数据分析的一种有效方法。</li>
</ol>
8. 代表性结果：
在比色反应完成后，对96孔板进行快速的目视检查，可为判断实验操作是否正确提供线索。首先通过观察酶标板侧面的液面高度，检查每个孔中的液体体积。所有孔中的试剂体积应恰好为275 μL。接下来，目视检查样品三复孔和标准品双复孔的颜色，这些技术复孔的颜色应为完全相同的蓝色色调。然后将标准曲线应用于含有葡萄糖-6-磷酸的两个孔，并确认其释放出全部10 nmol的无机磷。在使用ICP-OES或其他替代方法测定总提取磷含量后，需确保根据本方案计算出的总磷值不超过实际提取出的磷量。 
注意：在电子表格中仔细管理数据有助于避免定量错误。由于需要同时处理大量数值，建立一个模板将是非常值得投入的时间。
<img src="/files/ftp_upload/2660/2660fig1.jpg" alt="ELISA 板检测结果，比色检测，酶活性分析，蛋白质定量。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 96 孔板显示 8 个样品（A-H 行）的结果以及标准曲线（第 11 和 12 列）。对照设在第 10 列。 
第 1–3 列与第 4–6 列之间颜色强度的增加是由于单酯 P 化合物水解所致，第 4–6 列与第 7–9 列之间颜色强度的增加是由于二酯 P 化合物水解所致。
<img src="/files/ftp_upload/2660/2660fig2.jpg" alt="磷形态柱状图：正磷酸盐、单酯磷、二酯磷；浓度单位为 mg/kg DM。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 利用高通量酶解法分析佛蒙特州土壤样品的 0.25 M NaOH-0.05 M EDTA 提取液中磷形态的分布。误差线表示标准偏差，n = 3。

<ol><li>Turner, B. L., Frossard, E., Baldwin, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurner%2C+BL+%22Organic+phosphorus+in+the+environment%22">Organic phosphorus in the environment</a>. , Cabi Publishing. Wallingford. (2005).</li>
<li>Murphy, J., Riley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+single+solution+method+for+determination+of+phosphate+in+natural+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A modified single solution method for determination of phosphate in natural waters.</a> Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).</li>
<li>Dick, W. A., Tabatabai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+orthophosphate+in+aqueous+solutions+containing+labile+organic+and+inorganic+phosphorus+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Qual%22%5BJournal%5D)">Determination of orthophosphate in aqueous solutions containing labile organic and inorganic phosphorus compounds.</a> J. Environ. Qual. 6, 82-85 (1977).</li>
<li>He, Z., Toor, G. S., Honeycutt, C. W., Sims, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+hydrolysis+approach+for+characterizing+labile+phosphorus+forms+in+dairy+manure+under+mild+assay+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">An enzymatic hydrolysis approach for characterizing labile phosphorus forms in dairy manure under mild assay conditions.</a> Bioresour. Technol. 97, 1660-1668 (2006).</li>
<li>He, Z., Honeycutt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+molybdenum+blue+method+for+orthophosphate+determination+suitable+for+investigating+enzymatic+hydrolysis+of+organic+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Soil+Sci.+Plant+Anal%22%5BJournal%5D)">A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates.</a> Commun. Soil Sci. Plant Anal. 36, 1373-1383 (2005).</li>
<li>Cade-Menun, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+phosphorus+in+environmental+and+agricultural+samples+by+31P+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Characterizing phosphorus in environmental and agricultural samples by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Talanta. 66, 359-371 (2005).</li>
<li>Johnson, N. R., Hill, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorus+species+composition+of+poultry+manure-amended+soil+using+high-throughput+enzymatic+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Sci.+Soc.+Am.+J%22%5BJournal%5D)">Phosphorus species composition of poultry manure-amended soil using high-throughput enzymatic hydrolysis.</a> Soil Sci. Soc. Am. J. 74, 1786-1791 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

由于该方法本身具有使用小体积样本快速操作的特点，因此需要格外小心。其中最关键的步骤是将溶液移液至板上的操作。准确且最重要的是保持一致的移液技术，这对于本检测的成功至关重要。
NaOH-EDTA 提取法可将许多样品中的大部分磷分为三类：正磷酸盐、单酯磷和二酯磷。含有 NaOH-EDTA 可提取性磷的土壤、粪肥、沉积物或任何其他环境样品均可采用该方法进行表征。环境样品中的磷形态不一定稳定，该技术可在样品降解前完成表征，且无需投入大量研究人员。
当需要处理大量样品时，该检测方法尤为适用。试剂用量和空间需求已缩减至可管理的水平（例如，使用1.5 mL微量离心管而非50 mL玻璃烧瓶）。这种改进还可减少废物的产生。

<table><tbody><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>小麦酸性磷酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3627</td><td></td></tr><tr><td>马铃薯酸性磷酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1146</td><td></td></tr><tr><td>核酸酶 P1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8630</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖-6-磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7250</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>TCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>钼酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1343</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>砷酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9663</td><td></td></tr></tbody></table>

环境样品中有机磷的高通量测定与分类

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

环境样品中存在多种有机磷（P）分子1。传统的磷测定方法无法检测这些有机磷化合物，因为它们不与比色试剂发生反应2,3。酶促水解（EH）是一种新兴方法，可用于准确定性环境样品中的有机磷形态4,5。在准确性方面，该方法仅逊于磷-31核磁共振波谱法（31P-NMR），但后者成本高昂且需要专门的技术培训6。我们已将一种可测定三类磷（磷酸单酯P、磷酸二酯P和无机P）的酶促水解方法适配至微孔板读数系统7。该方法为研究人员提供了一种快速、准确、经济且操作简便的手段，可用于测定土壤、沉积物、粪肥中的磷形态，以及经浓缩后的水体样品。这是目前唯一可在常规实验室中进行的、用于测定有机磷形态及其酶可降解性的高通量方法。所得数据有助于科学家研究系统的养分含量及富营养化潜力。

本方案描述了一种利用微孔板读数仪测量并分类土壤磷的高通量酶解法，可将土壤磷分为单酯磷、二酯磷和无机磷。在标准实验室中，可同时测定多达96个样品。

环境样品中存在多种有机磷（P）分子1。由于传统磷检测方法无法识别这些有机磷化合物，因此……

本实验的总体目标是对土壤或粪便样品提取物中经酶水解的有机磷进行分类。首先使用氢氧化钠-EDTA溶液提取样品，并调节提取液的pH值，然后将调节后的提取液分别与两种不同的酶溶液进行孵育。在96孔板上，最后一步是使用钼蓝比色法测定酶释放的正磷酸盐。最终，大多数天然的正磷酸单酯磷和二酯磷形态可根据酶水解法释放正磷酸盐的差异，对土壤或粪肥样品中的磷进行分类。该方法可在任何标准实验室中以较低成本完成。与现有的磷-31核磁共振波谱法相比，其主要优势在于能够测量天然土壤酶在未来从有机磷化合物中释放正磷酸盐的潜力。因此，通过该方法获得的数据有助于预测土壤肥力，或预测土壤释放对藻类具有危害性水平的可利用正磷酸盐的潜力。在50毫升锥形管中，向两克湿样或干样样品中加入30毫升0.25摩尔的氢氧化钠溶液。在室温下振荡孵育16小时。将样品以3000 × g离心30分钟，然后取100 µL转移至已含有乙酸盐缓冲液的1.5 mL微量离心管中。调整后的样品总体积为1 mL，pH为5.0。配制两种储备液，每种均含有0.5单位/毫升的酸性磷酸酶，溶于10毫升新配制的0.1摩尔醋酸钠缓冲液（pH 5）中。然后将从青霉菌（Penicillium Citron）中重组复溶的冻干核酸酶NP one加入其中一支10毫升酸性磷酸酶储备液中，使其终浓度为2.5单位NP one/毫升，通过反复倒置数次轻轻混匀。将两种酶溶液在3000 × g下离心30分钟。为建立标准曲线，首先取1毫升1毫摩尔磷酸钾储备液加入1.5毫升离心管中，随后进行七次0.5毫升系列稀释，弃去第一管，使最终磷浓度范围为20 µL至0.625 nmol磷。现在将正磷酸盐标准品加入到酶标板的最后两列中，从第10列第A行开始，依次加入0 nm正磷酸盐，至第H行加入20 nm正磷酸盐，每列前三个孔各加一种浓度。向第10列接下来的三个孔中加入40 µL PP与GP酶溶液。再向随后的三个孔中加入40 µL PP、GP与NP1酶溶液。最后，向所有六个孔中各加入 40 微升 100 毫摩尔的醋酸盐缓冲液。现在，第 10 列的前六个孔中每个孔应含有 80 微升溶液，接着向接下来的两个孔中各加入 40 微升含有 10 M 葡萄糖、六磷酸和 40 微升 PP 加 GP 酶溶液的醋酸钠溶液。对于每个待测样品，在所有样品分配完毕后，将40微升pH调整后的样品提取物分配至最多八行的第1至第9孔。使用多通道移液器将PP加GP酶溶液加入第1至第3列，将PP加GP加NP加入第4至第6列，将0.1摩尔醋酸钠缓冲液加入第7至第9列。此步骤需迅速操作，以确保所有样品获得相同的孵育时间。将 96 孔板盖上盖子，于去离子水中 37 摄氏度下孵育样品、酶溶液、对照组及标准曲线，精确孵育 1 小时。每种四种储备溶液各配制 50 毫升。溶液 A 必须每天使用多通道移液器快速配制。向96孔板的所有孔中加入25 µL 10% SDS、100 µL 溶液A、20 µL 溶液B和50 µL 溶液C，用封板膜覆盖后，在室温下孵育30分钟。最后，使用可调式酶标仪在850 nm波长处测定吸光度，并通过电子表格应用程序进行数据读取。首先，以 0 至 20 纳摩尔的无机磷为横坐标（x 轴），以每个浓度下重复测定吸光度的平均值为纵坐标（Y 轴），绘制无机磷标准曲线，进行线性回归分析，并求出最佳拟合直线的方程。接着，通过计算第 1 至第 3 列数值的平均值来确定背景无机磷含量，然后将该标准曲线应用于数据集以校正背景。随后，为确定由磷酸单酯水解产生的磷含量，取第 4 至第 6 列样品的三份重复测定值的平均值，并减去对照酶溶液和背景无机磷的贡献值。然后，为了计算水解磷中的磷含量，DERs 对第七至第九列的三个重复样本值取平均，并从第四至第六列中减去对照酶溶液、背景无机磷以及水解单酯磷的含量。一个典型的96孔板显示了八个样本的结果和一条标准曲线。对照组位于第十列。第一列到第三列与第四列到第六列之间的颜色强度增加是由于第四列到第六列之间水解的单酯磷化合物所致，而第七列到第九列的颜色变化则是由于二酯醚磷化合物的水解。此处采用高通量酶促水解方法，成功分析了佛蒙特州土壤样品经0.25摩尔氢氧化钠和0.05摩尔EDTA提取液中各类磷化合物的分布情况。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用酶促水解法测定土壤或粪肥提取物中的天然正磷酸盐、单酯磷和二酯磷化合物。该技术可能有助于环境化学和养分管理领域的研究人员探索土壤或粪便系统中有机磷的行为。

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