高灵敏度检测Balb/C小鼠脑组织中的5-羟甲基胞嘧啶

以下实验的总体目标是分析并定量基因组DNA特定基因座中的五种甲基胞嘧啶和五种羟乙基胞嘧啶。该目标通过封闭五羟乙基胺的羟基实现，从而将可切割的MSP1位点转化为不可切割的位点。第二步，利用限制性内切酶MSP1和HPA2对基因组DNA进行消化，这两种酶通过其对甲基化的差异敏感性，识别与葡萄糖相关的五羟乙基胞嘧啶位点。

接下来使用PCR来检测该位点。获得的结果显示，在特定基因座中存在5-羟乙基胞嘧啶。qPCR可用于定量5-甲基胞嘧啶和5-羟乙基胞嘧啶的含量。

该技术相较于其他方法（如亚硫酸氢盐测序）的主要优势在于，能够区分5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。今天进行实验的研究人员是Romas Vice Villa，Romas是新英格兰生物实验室（New England Biolabs）该试剂盒的主要研发者之一。在本实验方案开始前，已按照书面流程从B型海兔脑组织中提取并纯化了基因组DNA，并置于1.5毫升反应管中。将基因组DNA、UDP-葡萄糖、NEB缓冲液4以及无核酸酶水混合，使总体积达到310微升。

将该反应混合物均分为两份，每份155微升，分装至两个离心管中。然后向其中一管加入30单位或3微升T4 β-葡糖基转移酶。通过轻轻吹打充分混匀。

第二个试管为对照反应，不要加入T四BGT，但务必加入三微升水。将两个试管在37摄氏度孵育12至18小时，在此期间BGT会将葡萄糖添加到样品中五个羟乙基胞嘧啶基团的羟基上。开始限制性内切酶消化时，将50微升反应混合物分装到三个标号为1至3的0.2毫升PCR条状管中。

然后将对照混合物各50 µL分装到标记为4至6的三个PCR条状管中。向1号和4号管中各加入100单位的msp。接着向2号和5号管中各加入50单位的HPA two，并通过轻轻吹打充分混匀。

不要向第三管和第六管中添加任何物质，因为它们是对照组。将全部六个管在37摄氏度下孵育至少四小时。然后向每管中加入1微升蛋白酶K，并在40摄氏度下孵育30分钟。

最后，将蛋白酶K在95摄氏度孵育10分钟以使其失活。本步骤以NEB的LongAmp Taq进行终点PCR为例进行演示。然而，也可使用其他PCR试剂和流程，替换为在冰上进行的0.2毫升PCR反应管操作。

加入5 μL长片段扩增TAC反应缓冲液、dNTPs、正向和反向引物、先前获得的模板DNA、长片段扩增Taq DNA聚合酶以及足够量的无核酸酶水，使终体积达到50 μL。必要时轻轻混匀反应体系，并通过短暂离心将所有液体收集至管底。将PCR管从冰上转移至预热至94 °C的PCR仪中，启动常规三步法PCR循环程序。

应进行一次初始变性步骤，在94摄氏度下持续30秒，随后进行30个循环：94摄氏度变性15秒，55至65摄氏度退火30秒，以及65摄氏度延伸20秒或每kb 50秒。最后应在65摄氏度下进行一次终末延伸，持续5分钟。也可通过实时PCR定量检测5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的含量。

有关具体信息，请参考 nb.com 上提供的产品说明书。在 Locus 12 处，使用终点 PCR 和实时 PCR 对五种羟乙基胺含量进行了比较，分析了四种不同的小鼠 BSY 组织样本，包括脑、肝、心和脾。

为便于比较，五种羟乙基胞嘧啶的差异在终点PCR样本的加框凝胶泳道中清晰可见。实时PCR数据经未切割DNA归一化处理，并使用标准曲线确定拷贝数。通过将各样本的拷贝数除以未消化对照的拷贝数，对样本进行归一化处理。

通过比较黄色柱状图，可以观察到五种羟乙基胞嘧啶的差异。关于该技术的操作，有几点注意事项：所有酶促反应必须进行完全。对于BGT反应，必须过夜孵育，以确保能够完全标记Ms.P1的所有DNA位点；而对于HEPA2，则至少需要反应四小时，以确保反应完全。

最后，我们提供 DNA 对照和引物对照，以便您可以同时进行对照反应。