Name: 使用全血刺激试验的促炎性细胞因子IL -1β的精确和简单的测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-01T18:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 学习使用全血刺激试验精确测量促炎性细胞因子IL-1β的方法。该技术通过脂多糖刺激细胞，利用多重免疫检测分析上清液，适用于自身免疫炎症疾病的诊断研究，尤其在血样量有限时具有重要价值。

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本研究由美国国立卫生研究院下属的关节炎与肌肉骨骼及皮肤病研究所的院内研究计划资助。

1. 全血采集
<ol>
	<li>从受累个体以及年龄和性别匹配的健康对照中采集至少 10 mL 外周血。静脉血应收集至含肝素钠的真空采血管中，避免使用 EDTA 等其他抗凝剂，并轻轻倒置数次以确保血液与肝素钠充分混匀。需注意，本检测中每个样本需设复孔，因此至少需要 10 mL 全血作为最低起始体积。</li>
	<li>为获得最佳结果，样本应在采集后尽快处理。然而，经肝素抗凝的血液可在室温、避光条件下保存最多 24 小时，待后续处理（2）。</li>
</ol>
2. 全血的制备
<ol>
	<li>将所有血液样本在室温下以3000 rpm（关闭刹车）离心10分钟。在不干扰白膜层的情况下，可从上层收集血浆，并储存以用于其他实验目的。血浆样本可暂时储存在-20°C或长期储存在-80°C</li>
	<li>收集血浆后，通过将红细胞（RBC）沉淀和白膜层用无血清（不完全）RPMI 1640培养基（在环境温度下）重悬来洗涤样本。轻轻吹打收集管中的混合物，并转移至50 mL锥形管中。</li>
	<li>用不完全RPMI 1640培养基定容至50 mL，并轻轻颠倒混匀以形成均匀的混合液。在3000 rpm（关闭刹车）下离心10分钟。确保有明显的分层后，小心吸除上清液，注意不要扰动白膜层。重复此步骤2-4次，以确保在刺激前去除所有污染物和结合的细胞因子。</li>
	<li>最后一次洗涤后，用不完全RPMI 1640培养基重悬红细胞沉淀和白膜层，使总体积为20 mL（初始采集10 mL全血时）。可根据初始采集的血量按比例调整总体积。</li>
	<li>使用Cellometer Vision仪器时，可通过选择吖啶橙（AO）白细胞计数模式，在不裂解红细胞的情况下对稀释后的血液进行计数。将一份稀释血液与一份AO混合，取20 μL的1:1混合液加入一次性计数板中。稀释后AO的最终浓度应为1μg/mL。</li>
	<li>用不完全RPMI 1640培养基调整至最终细胞浓度为2.0 × 106 cells/mL。</li>
</ol>
3. 全血刺激
<ol>
	<li>该实验至少需要设置四个条件（每个条件设复孔）：未刺激组、仅添加LPS组、仅添加ATP组，以及LPS与ATP联合添加组。将1 mL已稀释至2.0 × 106 cells/mL的全血加入24孔细胞培养板的相应孔中。</li>
	<li>在开始刺激实验前，应将刺激剂复溶并恢复至室温。冻干的LPS和ATP应按照生产商说明书进行复溶。复溶后，可使用不完全RPMI 1640培养基将LPS和ATP进一步稀释至适当储存浓度。</li>
	<li>向仅含LPS组以及LPS与ATP联合组的孔中加入LPS，使LPS的终工作浓度为1 μg/mL。总刺激时间为3小时，其中全血样本先在37°C、5% CO2培养箱中仅用LPS刺激2小时40分钟。</li>
	<li>在3小时刺激期的最后20分钟加入ATP。向仅ATP组和LPS+ATP组孔中加入ATP，随后将样本放回培养箱。ATP的终工作浓度为2 mM。</li>
	<li>3小时孵育结束后，将各孔中的上清液转移至1.5 mL微量离心管中，于室温下以10000 rpm离心2分钟，收集上清液并转移至另一组1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>样本可立即进行检测，或暂时储存在-20°C，长期储存建议置于-80°C。</li>
</ol>
4. 细胞因子检测
<ol>
	<li>冷冻样品在分析前需平衡至室温。IL-1β 的细胞因子浓度可通过多种方法进行检测。我们采用 Bio-Rad 公司的 Bio-Plex Pro 人细胞因子 x-plex 检测试剂盒，结合 Bio-Plex 200 系统，按照制造商提供的说明进行操作。在本方案中，我们重点检测 IL-1β；然而，我们使用该多重细胞因子检测试剂盒的优势在于，可在一次检测中同时测定多种细胞因子，并且仅需少量样品体积。</li>
</ol>
5. 典型结果
在成功使用LPS和ATP刺激后，IL-1β的产生分析显示，其剂量反应依赖于被刺激细胞的数量。我们发现，2.0 x 106 个细胞/mL的浓度足以产生最佳且可测量的IL-1β浓度以及其他细胞因子（图2）。
全血检测在研究表现为自身炎症性疾病的患者时具有重要价值。这些患者可能表现出先天免疫系统的缺陷，在仅用LPS刺激后，其IL-1β的产生量较对照组明显升高（图3），由此可对缺陷进行表征。
<img src="/files/ftp_upload/2662/2662fig1.jpg" alt="显示蛋白质定位分析的荧光显微镜图像；绿色荧光表示靶标。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 用于测定稀释全血样本中细胞浓度的有核白细胞AO染色代表性图像。
<img src="/files/ftp_upload/2662/2662fig2.jpg" alt="LPS和ATP刺激后IL-1β水平与细胞浓度的柱状图，数据单位为pg/mL。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 在不同细胞浓度下，健康供体全血上清液经LPS刺激后IL-1β产生的检测结果。样品均设三个复孔进行检测。
<img src="/files/ftp_upload/2662/2662fig3.jpg" alt="刺激人细胞中IL-1β水平；柱状图比较对LPS、ATP、LPS+ATP的反应。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 在两名健康正常对照者以及两名表现为IL-1β相关自身炎症症状的患者全血上清液中测得的IL-1β分泌的代表性结果。

<ol><li>Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasomes%3A+guardians+of+the+body%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The inflammasomes: guardians of the body.</a> Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).</li>
<li>Thurm, C. W., Halsey, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cytokine+production+using+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Measurement of cytokine production using whole blood.</a> Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 Forthcoming.</li>
<li>Mariathasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopyrin+activates+the+inflammasome+in+response+to+toxins+and+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP.</a> Nature. 440, 228-232 (2006).</li>
<li>Gabay, C., Lamacchia, C., Palmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1+pathways+in+inflammation+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">IL-1 pathways in inflammation and human diseases.</a> Nat Rev Rheumatol. 4, 232-241 (2010).</li>
<li>Franchi, L., Elgenbrod, T., Muñoz-Planillo, R., Nuñez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat Immunol. 3, 241-247 (2009).</li>
<li>Sims, J. E., Smith, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-1+family%3A+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The IL-1 family: regulators of immunity.</a> Nat Rev Immunol. 2, 89-102 (2010).</li>
<li>Haug, R., Joø, G. B., Westvik, A. B., Kierulf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+production+and+pattern+recognition+receptor+%28PRR%29+expression+in+whole+blood+stimulated+with+pathogen-associated+molecular+patterns+%28PAMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Chemokine production and pattern recognition receptor (PRR) expression in whole blood stimulated with pathogen-associated molecular patterns (PAMPs.</a> Cytokine. 32, 304-315 (2005).</li>
<li>Netea, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirement+for+the+activation+of+the+inflammasome+for+processing+and+release+of+IL-1bin+monocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1bin monocytes and macrophages.</a> Blood. 113, 2324-2335 (2009).</li>
<li>Latz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasomes%3A+mechanisms+of+activation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immnol%22%5BJournal%5D)">The inflammasomes: mechanisms of activation and function.</a> Curr Opin Immnol. 22, 28-33 (2010).</li>
<li>Masters, S. L., Simon, A., Aksentijevich, I., Kastner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horror+autoinflammaticus%3A+the+molecular+pathophysiology+of+autoinflammtory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammtory disease.</a> Annu Rev Immunol. 27, 621-668 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

所述全血检测方法是一种简便的技术，与其他需要细胞分离及大量样本处理和操作的技术相比，该方法能更接近地模拟生理条件。本方法利用配备AO（乙酰丙酮）的Cellometer Vision对全血中的白细胞进行计数，从而提供了一种基于细胞数量准确标准化样本的方法。
需要注意的是，本实验应将全血采集至含钠肝素的采血管中，因为其他抗凝剂是已知的钙螯合剂，可能影响实验结果。应使用无血清培养基，因其可能影响细胞因子浓度。样本采集后立即处理也至关重要。尽管本方法采用LPS和ATP刺激全血并检测IL-1β浓度，但也可使用其他病原体和刺激物来测定不同细胞因子和趋化因子的应答；然而，刺激时间和条件可能需要相应调整。最后，反复冻融循环可能影响细胞因子浓度。
利用所述全血刺激实验检测IL-1β为其他方法提供了一种替代方案，是一种有效的免疫检测方法，可用于研究伴有炎症相关病理特征的疾病。

<table><tbody><tr><td>钠肝素血液收集管</td><td>BD Biosciences</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21870-100</td><td></td></tr><tr><td>吖啶橙</td><td>Invitrogen</td><td>A3568</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td>请联系公司获取仪器信息</td></tr><tr><td>Cellometer 细胞计数板</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td>24 孔组织培养板</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>超纯 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; K12 LPS</td><td>Invitrogen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>腺苷-5&amp;#180;-三磷酸二钠盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Bio-plex 200 系统</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>请联系公司获取仪器信息</td></tr><tr><td>Bio-Plex Pro 人细胞因子 x-plex 检测试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>x-plex 检测试剂盒根据指定的感兴趣细胞因子定制</td></tr></tbody></table>

准确且简便地利用全血刺激实验检测促炎性细胞因子 il-1β

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

免疫细胞分泌可溶性介质引发的炎症过程，会导致皮肤、关节及其他组织出现多种表现，并引起细胞因子稳态的改变。先天免疫系统在识别病原体及其他内源性危险刺激信号中发挥关键作用。先天免疫细胞释放的主要细胞因子之一是白细胞介素（Interleukin, IL）-1。因此，我们采用全血刺激实验，以检测炎症细胞因子的分泌情况，特别是促炎细胞因子IL-1β的分泌1, 2, 3。
先天免疫系统存在遗传性功能障碍并导致自身炎症性综合征的患者，在单独受到脂多糖（LPS）刺激时，会表现出成熟IL-1β的过度释放。为了评估伴有炎症相关病理表现患者的先天免疫功能状态，我们采用一种特异性免疫检测方法，以检测细胞对病原体相关分子模式（PAMPs）的免疫应答，例如革兰氏阴性菌内毒素脂多糖（LPS）。这些PAMPs可被病原体识别受体（PRRs）识别，而PRRs存在于先天免疫系统细胞表面4, 5, 6, 7。激活炎性小体（一种将前体IL-1β加工为成熟、具有生物活性形式的多蛋白复合物）需要两个信号：第一信号为LPS，第二信号为ATP4, 5, 6, 8, 9, 10。
与需要耗费大量人力分离和培养特定细胞群的其他方法相比，全血检测法仅需对样本进行 minimal 的操作即可评估细胞因子的产生。该方法与其他全血刺激检测法有所不同：我们并非以 RPMI 培养基按比例稀释样本，而是直接从稀释后的全血中进行白细胞计数，从而在培养中刺激已知数量的白细胞2。本项特定全血检测的结果展示了一种新颖的技术，可用于阐明表现为自身炎症性病理生理特征的患者群体。

我们描述了一种简单的免疫测定方法，用于检测表现为自身炎症表型的患者体内促炎性细胞因子（如IL-1β）的产生。通过使用病原体相关分子模式（特别是脂多糖）激活全血培养中的细胞，可在全血上清液中方便地评估细胞因子的分泌情况。

准确且简便地利用全血刺激实验检测促炎性细胞因子 IL-1β

免疫细胞分泌可溶性介质引发的炎症过程，可导致皮肤、关节及其他组织出现多种表现……

本实验的总体目标是检测全血刺激实验中产生的促炎性细胞因子。首先，通过离心将全血中的细胞成分与血浆分离，并使用橙黄G染色对白细胞进行计数。随后，将细胞接种并用LPS刺激，接着加入TP，以激活携带微生物模式识别受体的细胞产生细胞因子。刺激开始后，在特定时间点收集细胞培养上清液。最后，在96孔板多重检测中测定上清液中的细胞因子浓度。通过这一简单方法，可快速评估不同供体来源的刺激后细胞所产生的促炎细胞因子浓度差异。该方法特别适用于诊断表现为病理性抗炎症状的患者是否存在I型介导的炎症性疾病，尤其在可获取的血液体积有限的情况下更为实用。与现有方法相比，该技术在检测细胞因子浓度时的主要优势在于，基于Luminex的技术能够在仅使用少量样本的情况下，同时检测多种细胞因子。采集来自患者的静脉血样本以及来自健康、年龄和性别匹配的对照个体的静脉血样本，每份样本应含有10毫升或更多的血液。确保样本采集于含钠肝素的真空采血管（Vacutainer）中，不得添加EDTA或其他抗凝剂，因为这些物质会干扰检测。样本采集后应尽快进行处理。如有必要，样本可在弱光条件下于室温保存，最长不超过24小时。将血液样本在室温下以3000 RPM离心10分钟，离心时关闭刹车。样本离心后，小心吸取管内上层血浆，注意不要扰动含有单个核细胞的白膜层。随后，用室温无血清RPMI培养基重悬白膜层及下方的红细胞沉淀，以轻柔吹打混合液的方式洗涤细胞。然后将细胞从收集管转移至一个50毫升离心管中。用RPMI补足体积至50毫升，并轻轻颠倒混匀每根离心管。再次以3000 RPM离心10分钟。然后吸去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。为去除污染物并清除细胞结合的细胞因子，重复此洗涤步骤两到四次。细胞洗涤完成后，用无血清的RPMI重悬细胞，定容至总体积20毫升。细胞计数时，取20微升样品与碘化丙啶橙（Aine orange）的1:1混合液，加入一次性Soter视觉计数室中。Aine orange的工作浓度为每毫升1微克，仅对有核白细胞进行染色，从而可将其与红细胞区分开来。获得细胞计数后，仅对D阳性细胞进行计数。将样品重悬于无血清RPMI培养基中，调整至终浓度为每毫升200万个细胞。针对每个样品，用待检测的实验条件标记24孔板中的复孔。在此情况下，实验条件包括未刺激组、单独使用LPS组、单独使用a TP组，以及LPS联合a TP组。向每个孔中加入一毫升稀释后的细胞，并向相应孔中加入LPS，使其终浓度为每毫升一微克。将样品在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育两小时四十分钟。初始孵育结束后，在单独使用a TP组和LPS联合a TP组的孔中加入a TP，使其终浓度为二毫摩尔。随后将培养板继续在37摄氏度孵育二十分钟。第二次孵育完成后，将每个孔中的细胞转移至预先标记好的独立的1.5毫升微量离心管中，在室温下以10,000 ×g离心2分钟，然后将每根离心管中的上清液转移至新的预标记EOR管中。上清液可立即用于细胞因子检测，或冻存以用于后续检测IL-1β或其他细胞因子的浓度。在本实验中，我们采用Bio-Plex Pro人类细胞因子Xplex试剂盒，结合Bio-Plex 200系统进行检测。根据制造商的说明。本图显示，在用LPS、ATP或两种刺激物共同刺激正常全血细胞后，分析IL-1β的产生情况，结果显示LPS与ATP联合刺激可诱导反应，其强度取决于被刺激细胞的数量。与健康对照相比，表现出自身炎症性病理特征的患者全血检测在仅使用LPS刺激时即显示出增强的IL-1β产生，无需外源添加ATP。请注意，操作血液等人体体液具有极高危险性，进行该实验时必须始终采取通用防护措施。

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