Name: 制备和使用艾滋病毒感染主的CD4 + T细胞作为靶细胞，自然杀伤细胞的细胞毒性检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 学习利用HIV-1感染CD4+ T细胞制备靶细胞并评估自然杀伤细胞细胞毒性的方法。该技术通过流式细胞术和铬释放实验检测NK细胞对HIV感染细胞的应答反应，为研究HIV免疫治疗策略提供重要实验手段。

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无利益冲突声明。

若操作得当，本实验方案所述检测方法应能准确反映自然杀伤细胞（NK细胞）对HIV-1感染细胞的脱颗粒能力及裂解能力（见图5）。NK细胞在HIV感染细胞刺激下发生的脱颗粒反应，与其对HIV感染细胞的裂解作用应呈正相关10. 获得两种自然杀伤细胞功能检测中针对HIV感染细胞的细胞毒反应的可靠结果，依赖于高度纯化的NK细胞以及高度纯化的感染细胞群体的分离。获得纯化的NK细胞和HIV-1感染细胞对于实现较为准确的效应细胞与靶细胞比例至关重要。同样，在进行检测前，从靶细胞群体中去除死亡和凋亡细胞也非常重要 51Cr标记或与效应细胞共孵育。 51在同位素标记步骤中，若存在死亡或凋亡细胞，铬（Cr）可能被正在凋亡的细胞摄取，导致自发释放率显著升高，从而影响计算所得的特异性裂解百分比。此外，死亡或凋亡细胞的存在可能诱发自然杀伤（NK）细胞脱颗粒，引起CD107a表达水平异常升高。在NK细胞与靶细胞共孵育后，吸取无细胞上清液时需精确移液。 51Cr 释放实验，因为从每个重复孔中移取的上清液体积不同会导致标准差较大。可通过修改这些方案来评估特定 NK 受体在介导 NK 细胞裂解 HIV 感染细胞中的作用，方法是在效应细胞或靶细胞共培养前，用针对特定受体或配体的拮抗性抗体进行预孵育。 6,11经细胞因子处理的NK细胞（如IL-2、IL-15）可用于评估刺激后NK细胞的功能活性 12同样，可利用这些方案进行抗体依赖性细胞毒性试验。可将抗HIV抗体（例如抗gp120）加入靶细胞，以供自然杀伤细胞的低亲和力Fc受体CD16识别。 13这些检测方法虽然旨在测量自然杀伤细胞对HIV感染细胞的细胞毒反应，但也可经修改用于检测自然杀伤细胞在识别HIV感染细胞后产生细胞因子的能力。尽管本方案中描述了使用 体外 以感染细胞作为靶细胞，我们近期描述了从HIV感染者体内生成靶细胞的方法。该方法需要分离CD4+ T细胞，然后在含有白细胞介素-2的条件下，通过有丝分裂原刺激，对细胞进行为期两周的扩增。 11经过两周的扩增后，采用本文所述的方案分离目标细胞。

<table><tbody><tr><td>真空采血管（肝素钠）</td><td>BD Biosciences</td><td>367874</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep CD4+ T细胞分离试剂盒</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>无钙镁PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>淋巴细胞分离液</td><td>Cellgro</td><td>25-072-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640培养基</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Cellgro</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>T细胞扩增试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-441</td><td></td></tr><tr><td>无钙镁HBSS（1×）</td><td>Hyclone</td><td>SH30588.01</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td></td><td>46-034-Cl</td><td></td></tr><tr><td>NK细胞阴性分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-657</td><td></td></tr><tr><td>IMDM培养基</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>CD4+阳性分离试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>113.31D</td><td></td></tr><tr><td>死细胞去除试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PacificBlue</td><td>BD Biosciences</td><td>558117</td><td></td></tr><tr><td>CD14 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>325616</td><td></td></tr><tr><td>CD20 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>302328</td><td></td></tr><tr><td>CD56 APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD69 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555531</td><td></td></tr><tr><td>CD107a FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;51&lt;/sup&gt;铬</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEZ030002MC</td><td></td></tr><tr><td>γ计数管</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1270-401</td><td></td></tr><tr><td>2470自动γ计数器</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>2470-0050</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td>643629</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FJ-9-1YR</td><td></td></tr></tbody></table>

hiv-1 感染的原代 cd4+ t 细胞的制备及其作为自然杀伤细胞毒性实验中靶细胞的应用

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

自然杀伤细胞（NK细胞）是先天免疫系统应对病毒感染细胞的重要组成部分。了解NK细胞识别和裂解HIV-1感染细胞的能力至关重要，因为发现NK细胞在应对HIV感染细胞时的任何功能异常，都可能为增强其细胞溶解活性的治疗策略提供依据。在细胞毒性实验中，有必要使用HIV感染的原代T细胞母细胞作为靶细胞，而非感染的T细胞系。T细胞系即使未被感染，也极易被NK细胞裂解。此外，必须使用自体原代细胞，以避免靶细胞与效应细胞之间主要组织相容性复合体I类分子（MHC I）不匹配而导致的非特异性裂解。早期评估NK细胞对原代HIV感染细胞细胞溶解反应的研究未能显示出对感染细胞的显著杀伤作用1,2。然而，由于HIV-1感染的原代T细胞中常混有未感染细胞，将这类细胞用于NK细胞功能实验存在困难3。这种感染细胞与未感染细胞比例的不一致，会导致不同样本间NK细胞杀伤活性的差异，而该差异可能并非源于供体NK细胞功能本身的变异。因此，若能获得纯化的感染细胞群体，将有助于在不同实验间标准化效应细胞与靶细胞的比例3,4。本文展示了如何利用HIV-1能够下调感染细胞表面CD4分子的特性，以及商用试剂盒对死亡或濒死细胞的清除能力，从而分离出高度纯化的HIV-1感染细胞群体3-6。纯化后的HIV-1感染原代T细胞母细胞可作为靶细胞，用于以纯化NK细胞为效应细胞的脱颗粒实验或细胞毒性实验5-7。在脱颗粒实验中，以NK细胞作为效应细胞，可评估其释放特异性溶酶体中裂解物质的能力8，这些溶酶体被称为“细胞溶解性颗粒”。通过使用荧光染料标记的抗CD107a抗体进行染色——CD107a是一种溶酶体膜蛋白，当细胞溶解性颗粒与细胞膜融合时会暴露于NK细胞表面——我们可以测定在识别靶细胞后发生脱颗粒的NK细胞所占的百分比。另一种方法是通过细胞毒性实验评估NK细胞的裂解活性，该实验通过检测在NK细胞存在下，靶细胞内51Cr的释放量，来确定被裂解的靶细胞百分比。

由于靶细胞纯度的限制，目前用于测量自然杀伤细胞对 HIV 感染细胞裂解反应的细胞毒试验存在局限性。本文通过利用 HIV-1 能够下调 CD4 表达的特性，展示了分离出高纯度的 HIV-1 感染初级 T 细胞母细胞群体的方法。

HIV-1 感染的原代 CD4+ T 细胞的制备及其作为自然杀伤细胞毒性实验中靶细胞的应用

自然杀伤（NK）细胞是机体对病毒感染细胞产生先天免疫应答的重要组成部分。了解NK细胞识别和清除病毒感染细胞的能力至关重要……

本实验的总体目标是评估自然杀伤细胞对感染人类免疫缺陷病毒1型细胞的细胞毒性反应。首先从静脉血中分离并感染CD4阳性T细胞，然后从同一供体中分离自然杀伤细胞，以此实现上述目标。接下来，将未感染的 CD4 阳性 T 细胞从感染细胞中分离出来。最后，将感染的细胞和 NK 细胞分别作为靶细胞和效应细胞，用于两种检测方法之一，以评估 NK 细胞的细胞毒性。最终可获得结果，表明 NK 细胞能够通过 CD107a 表达上调响应 HIV-1 感染的细胞，该表达通过流式细胞术分析确定，或通过伽马计数器检测的铬-51 释放来确认。该方法可解答HIV-1领域中的关键问题，例如：NK细胞是否对HIV-1感染的细胞产生应答？在NK细胞与T细胞相互作用中，哪些受体-配体相互作用具有重要意义？HIV-1病毒蛋白是否会调控NK细胞对HIV-1感染细胞的应答？在分离人外周血中的CD4阳性T细胞后，使用抗CD3和抗CD28偶联磁珠刺激72小时。通过血细胞计数板计数所得T细胞群体，随后将培养物分为两组：取约2×10⁶个T细胞置于15毫升锥形管中，作为未感染对照组；将剩余的CD4阳性T细胞悬液转入50毫升锥形管中，用于感染组。将两组样品在22摄氏度下以300 ×g离心10分钟，然后吸除上清液。将50毫升试管中的CD4阳性T细胞直接重悬于含有病毒颗粒的培养液中，并加入polybrene，使其终浓度为10毫克/毫升。随后在20至25摄氏度下以1200 ×g旋转感染细胞2小时。此处将细胞以5的感染复数（MOI）感染DHIV-3。离心感染完成后，移除上清液，并将感染的细胞重悬于RPMI完全培养基中，细胞密度为每毫升3×10⁶个，在含100单位/毫升IL-2的培养基中培养。随后，在六孔板中将未感染的细胞和新感染的细胞培养72小时。如果使用的是复制缺陷型病毒，则培养72小时；如果使用的是复制能力完整的病毒，则培养5至7天。收集含有感染的CD4阳性T细胞培养物的上清液，于22°C以300 × g离心10分钟（开启刹车），吸除上清液并重悬细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于2毫升含2% FBS和2 mmol/L EDTA的PBS中，使用血细胞计数板结合CD4阳性细胞分离试剂盒对细胞进行计数。去除CD4阳性未感染的T细胞。按照试剂盒说明书操作分离CD4阳性T细胞，但使用1:1的抗CD4抗体与细胞比例。然后使用死细胞去除试剂盒从纯化的携带病毒的细胞群体中去除死细胞。根据制造商说明书，收集活的T细胞群体，将纯化的细胞在300 G条件下离心10分钟。开启刹车后，移除上清液，重悬细胞沉淀。用1毫升完全RPMI培养基重悬细胞并计数。外周血NK细胞首先从与CD4阳性T细胞相同的供体中分离获得。经过过夜培养后，使用血细胞计数板计数NK细胞，以300 ×g离心10分钟（开启刹车），然后将细胞重悬于完全RPMI培养基中，调整终浓度至每毫升10⁶个细胞。接着，收集经纯化、感染及未感染的对照T细胞悬液，以300 ×g离心10分钟（开启刹车），弃去上清液，重悬细胞沉淀。以每毫升2×10⁶个细胞的浓度将细胞重悬于完全RPMI培养基中作为阳性对照，本实验使用对NK细胞裂解敏感的K562细胞。在本视频中，将K562细胞以300×g离心10分钟（刹车开启），随后弃去上清液，并将沉淀重悬于完全RPMI培养基中，调整浓度至每毫升2×10⁶个细胞。将所有细胞群体洗涤并重悬至实验所需浓度后，将NK细胞分别与K562细胞、未感染的T细胞或HIV感染的T细胞共同孵育。在96孔V型底板的各个独立孔中，每种靶细胞类型仅使用一个复孔来检测NK细胞的非特异性脱颗粒。向其中一个孔中加入100 µL NK效应细胞和100 µL仅含培养基的溶液。向每个孔中加入10微升体积的荧光染料偶联抗CD107a FITC抗体，然后在22摄氏度下以20 × g离心2分钟，离心时开启刹车。随后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育4小时。孵育结束后，在22摄氏度下以400 × g离心5分钟，离心时开启刹车，然后使用配有P200吸头的2毫升移液器吸走上清液。接下来，向每个孔中加入 100 µL 流式缓冲液，然后在冰上用抗 CD3、CD14、CD20 Pacific Blue 抗体和抗 CD56 APC 抗体对细胞染色 20 分钟。细胞染色完成后，向每个孔中加入 200 µL 流式缓冲液，以 400 ×g 离心 5 分钟。在 22 °C 制动开启的条件下，小心吸去每个孔中的流式缓冲液。使用带有200微升微量移液吸头的2毫升吸液移液器，注意不要扰动沉淀，再次洗涤细胞，然后将沉淀重悬于200微升含1%多聚甲醛的无钙、无镁PBS溶液中。最后，将细胞悬液转移至流式管中，并向每管中加入约100微升含1%多聚甲醛的无钙、无镁PBS溶液，使总体积达到300微升。随后使用FACSDiva软件通过流式细胞术检测两万个NK细胞事件，并使用FlowJo软件分析数据。将HIV-1感染与未感染的T细胞靶标用每10⁶个细胞125微居里的⁵¹铬生理盐水溶液标记，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育2小时，置于15毫升锥形管中作为阳性对照；同时将10⁶个K562细胞用100微居里的⁵¹铬标记2小时。在相同的培养条件下，使用完全 RPMI 培养基将每种细胞群体的染色溶液终体积调整至 500 微升。在靶细胞标记的同时，使用 PerkinElmer 网站提供的通用放射性衰变计算器计算加入靶细胞的铬 51 的体积。取出先前分离的NK细胞，进行计数，以300 G离心10分钟（开启刹车），弃上清后将细胞沉淀重悬于完全RPMI培养基中，将所得细胞悬液分装至三个15毫升锥形管中。第一管调整细胞密度至每毫升10的5次方，第二管调整至每毫升2.5×10⁵，第三管调整至每毫升5×10⁵。第三管中的NK细胞将分别以1:1、2.5:1和5:1的比例作为效应细胞用于铬51释放实验。从培养箱中取出已标记的靶细胞，向每根试管中加入 4.5 毫升完全 RPMI 培养基。在 300 ×g 条件下离心 10 分钟。然后小心地将上清液倒入放射性液体废物容器中，注意不要扰动沉淀物。再洗涤靶细胞两次，以去除所有未吸附的铬51。第三次洗涤的上清液可弃于非放射性液体废物容器中。现在将靶细胞重新悬浮于RPMI完全培养基中，调整细胞密度至每毫升10的5次方个细胞，此为例行铬51释放实验的典型设置示例。注意，每组实验均需设置三个复孔，将100微升标记的靶细胞分别加入96孔V型底培养板中指定的孔内，使每孔最终含有10的4次方个靶细胞。接着，向相应孔中加入100微升NK细胞悬液，与靶细胞按指定的效应细胞与靶细胞比例共同孵育。然后，向未添加效应细胞的相应孔中加入100微升靶细胞，用于设置最大释放组和自发释放组。向自发释放组中额外加入 100 微升完全 RPMI 培养基，将培养板在 20 ×g 条件下离心 2 分钟（开启刹车），随后将培养板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳环境中孵育 4 小时。4 小时孵育结束后，向除最大释放孔以外的每个孔中加入 5 微升用完全 RPMI 培养基按 1:10 稀释的人红细胞悬液，向最大释放孔中加入 100 微升 10% 十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS），然后将培养板在 400 ×g 条件下离心 5 分钟。为收集细胞，需为每个实验孔和对照孔分别标记一个γ计数管。在96孔板中，从每个孔收集100微升无细胞上清液，并将各孔的上清液转移至预先标记的离心管中。使用PerkinElmer 2470自动γ计数器测量每根试管中铬51的含量。以下散点图展示了一种典型的流式细胞术设门策略，用于分析CD107a实验结果。脱颗粒检测实验。首先在FSCA与FSCH的散点图上对单细胞进行设门，排除细胞团块或双联体。接着，在FSCA与SSC的散点图中对单细胞门控群体进行淋巴细胞群体设门，该群体由粉红色共价圈出。随后绘制淋巴细胞门，以CD3 14 20与CD56进行设门，圈选CD56阳性且CD3 14 20阴性的细胞群，如垂直的粉红色椭圆所示。此处NK细胞活化（NK GA）以CD107a与CD56作图，以显示已脱颗粒的NK细胞。接下来的两幅图展示了评估自然杀伤细胞对HIV-1感染细胞的细胞毒反应的代表性结果。通过检测表达表面CD107a的NK细胞百分比，评估NK细胞在无靶细胞、以及在K562细胞、原代CD4阳性T细胞和HIV感染的原代T细胞刺激下的脱颗粒能力。本图中每个象限中的数字代表该象限内NK细胞占总NK细胞的百分比。通过铬51释放实验，在效应细胞与靶细胞比例为2.5:1、5:1和7.5:1的条件下，评估NK细胞对未感染的CD4阳性T细胞、K562细胞以及HIV-1感染的T细胞的裂解能力。该技术的建立为HIV-1生物学领域的研究人员探索自然杀伤细胞在HIV感染者体内对HIV-1感染细胞的应答机制铺平了道路。

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免疫学与感染

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本文介绍了一种基于流式细胞术的体内杀伤实验方法，可用于研究细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对模型肿瘤抗原应答中的免疫优势现象。我们提供了该精巧实验方法在机制研究和药物疗效评估中应用的示例。...

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