Name: 荧光光谱法测定膜蛋白质折叠的热力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学习使用色氨酸荧光光谱法测定膜蛋白质折叠的热力学参数。本实验通过构建小型LAR囊泡环境，结合尿素浓度梯度变性与荧光检测，获取吉布斯自由能数据，为膜蛋白稳定性研究提供可靠方法。

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我们感谢北京吴提供她的数据。本工作得到了J.E.K.获得的美国国家科学基金会CAREER奖的支持。

1. 用于膜蛋白折叠的约50 nm直径小单层囊泡（SUVs）的制备
<ol>
 <li>购买含有1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DMPC）脂质的氯仿溶液，并将每瓶20 mg的等分试样分装至洁净的玻璃小瓶中用于储存。向每个小瓶中通入氮气层以防止脂质氧化，然后用瓶盖和封口膜密封。小瓶储存于-20°C冰箱中，直至使用。</li>
 <li>每次实验使用一个含有20 mg脂质氯仿溶液的单个小瓶。将小瓶内容物用氮气流吹干1小时，直至溶剂完全挥发。</li>
 <li>将干燥的脂质用1 mL 20 mM磷酸钾缓冲液（pH = 7.3）在水浴超声仪中重悬约30秒。此脂质悬浮液呈浑浊状，转移至底部锥形的15 mL塑料离心管中。向原先盛有脂质的空玻璃小瓶中再加入1 mL磷酸缓冲液，重复超声处理，随后将溶液加入同一15 mL离心管中。该过程共重复4次，最终管内体积为4 mL，所得脂质浓度为5 mg/mL，即为储备脂质体溶液。</li>
 <li>将4 mL脂质体溶液置于约30°C的温水浴中，使用超声破碎仪微探头以50%占空比超声处理1小时。水浴的作用有两个：第一，防止超声过程中脂质溶液温度过高；第二，保持水相脂质溶液的温度高于双分子层相变温度，对于DMPC而言，该相变温度约为23°C。</li>
 <li>将超声处理后的溶液通过0.22 μm注射器滤器过滤，以去除来自超声探头的碎片，过滤后的溶液在37°C下平衡过夜。</li>
</ol>
2. 初始荧光去折叠曲线的样品制备
<ol>
 <li>配制含有10 M尿素的20 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.3）储备液。必须将水加入固体中（而非将固体加入水中），因为大量尿素在溶液中占据显著体积。该尿素溶液可通过将溶质加入洁净的空瓶中，并加水至预定最终体积来配制。此溶液可能需要在水浴或加热板上加热并搅拌以溶解溶质。尿素具有吸湿性，因此应通过折光率测定来确定尿素储备液的实际浓度。1</li>
 <li>配制20 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.3）的储备缓冲液。</li>
 <li>制备去折叠蛋白的储备溶液。该蛋白储备液应含有约200 μM蛋白，溶于8 M尿素和20 mM磷酸盐缓冲液中。</li>
 <li>荧光研究样品按以下方式制备：混合适量的蛋白储备液（第2.3节）、脂质储备液（5 mg/mL脂质，第1节）、10 M尿素储备液（第2.1节）和磷酸盐缓冲液储备液（第2.2节），以获得含约4 μM蛋白、1 mg/mL脂质、以及0至8 M尿素（以1 M为增量）的样品。每个样品的总体积为200 μL。附有示例电子表格（表1），列出了使用200 μM蛋白储备液时所需的体积。</li>
 <li>空白样品的制备方法如第2.4节所述，但不添加蛋白。为保持其他组分浓度与第2.4节相同，可加入4 μL的8 M尿素溶液代替蛋白。这些空白样品用于扣除蛋白荧光光谱中出现的散射及其他背景信号。</li>
 <li>第2.4和2.5节的样品在测量荧光光谱前需在37°C下孵育至少2小时，以确保蛋白完全折叠并达到平衡。</li>
</ol>
3. 荧光光谱的测量
使用稳态荧光光谱仪测量每个样品及空白样的色氨酸荧光。为避免激发酪氨酸残基，荧光光谱应在290 nm激发波长下记录，并扫描305至500 nm范围。通常入口和出口狭缝宽度为3 nm。波长步进和积分时间可根据信噪比进行优化。典型的波长步进和积分时间分别为1 nm/步和0.5秒/步。膜蛋白通常仅在温度高于双分子层相变温度时才能正确折叠进入合成脂质中。因此，在本实验使用DMPC的情况下，样品温度保持恒定在30 °C。实验中采用容量为160 μL的微体积熔融石英比色皿。
4. 生成初始去折叠曲线并估算膜蛋白去折叠的吉布斯自由能
<ol>
 <li>以 x-y 数据集形式的荧光光谱被导入 Igor Pro、Matlab、Origin 或 Excel 等软件中。</li>
 <li>必须使用以下步骤扣除尿素和脂质囊泡背景的信号： 
 光谱 A = 蛋白质在脂质体存在及特定浓度尿素条件下的原始荧光光谱。 
 光谱B = 对应空白样品的原始荧光光谱，该空白样品含有脂质囊泡及与光谱A相同的尿素浓度；空白样品中不含蛋白质。 
 校正光谱 = 光谱A - C×光谱B。C为标量，通常等于1.0。在某些情况下，由于散射问题导致在约305–320 nm区域附近出现过度或不足扣除，C可能小于或大于1.0。</li>
 <li>最大荧光发射波长，λ最大值，根据每种尿素浓度的校正光谱进行列表。完全去折叠膜蛋白的典型值为350 nm，而折叠蛋白的典型值约为330 nm。将列表中的波长通过将λ的范围转换为去折叠分数来换算最大 值（约330至约350 nm）归一化至0.0到1.0范围，以关联λ最大 值对应未折叠群体的比例。例如，一个λ最大值 330 nm 处的值对应于未折叠分数 0.0，350 nm 处对应于 1.0，340 nm 处对应于 0.5。将蛋白质的未折叠分数对尿素浓度作图。如上所述，尿素浓度应通过测量折射率来实验确定。</li>
 <li>我们假设该蛋白质可以处于两种状态之一：折叠态或去折叠态。去折叠分子所占比例的曲线图， f，相对于尿素浓度， C，可拟合到以下方程：2 
 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq2.jpg" alt="配体结合公式，\(f = \frac{e^{-m(\frac{C_m-C}{RT})}}{1+e^{-m(\frac{C_m-C}{RT})}}\)，方程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 2"> 
 系数 m 对应于自由能随变性剂浓度的变化率，以及 Cm 对应于折叠群体与去折叠群体相等时的中间尿素浓度。这些值是由数据分析软件通过最小二乘法拟合得到的拟合参数。 R （0.001987 kcal/mol • K）为气体常数，且 T 温度（303 K）。</li>
 <li>拟合所得的系数用于确定在无尿素条件下蛋白质解折叠的吉布斯自由能（kcal/mol）： <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq3.jpg" alt="化学变性研究中用于蛋白质稳定性分析的热力学方程 ΔG°H2O = mCm" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 3">.</li>
</ol>
5. 优化去折叠曲线以更精确测定去折叠吉布斯自由能。
<ol>
 <li>上述去折叠曲线揭示了导致λmax发生最大变化的尿素浓度范围。该范围通常较小，大部分去折叠过程均发生在此狭窄区间内。为了精确测定去折叠的自由能，需在此区域内进一步分析额外样品，以获得包含足够多数据点的曲线，从而实现优化的最小二乘法拟合。例如，若蛋白质在2至4 M尿素之间发生去折叠，则可制备尿素浓度以0.2 M为增量、从2 M至4 M的系列样品，以更精确地揭示去折叠曲线中这一关键区域的形状。无需在每个尿素浓度下测量空白光谱，通常每约0.5 M间隔测量一次空白光谱即可。</li>
 <li>由此图所得的去折叠自由能可能与原始去折叠曲线中的结果略有差异，但能反映更为精确的数值。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>样品</td>
 <td>终浓度 [尿素], M</td>
 <td>蛋白储存液 (μL)</td>
 <td>脂质储存液 (μL)</td>
 <td>10 M 尿素储存液 (μL)</td>
 <td>缓冲液储存液 (μL)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>~ 0.16</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>0</td>
 <td>156</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>1</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>20</td>
 <td>136</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>2</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>40</td>
 <td>116</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4</td>
 <td>3</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>60</td>
 <td>96</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5</td>
 <td>4</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>80</td>
 <td>76</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6</td>
 <td>5</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>100</td>
 <td>56</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>7</td>
 <td>6</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>120</td>
 <td>36</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8</td>
 <td>7</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>140</td>
 <td>16</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
表1. 制备荧光样品所需的储备液体积
<img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig1.jpg" alt="荧光强度与波长关系图；光学发射分析，光谱结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 含单个色氨酸残基的约5 μM代表性膜蛋白的色氨酸荧光光谱。(A) 蛋白质的原始荧光光谱（来自4.2节的光谱A）；(B) 空白样的原始荧光光谱（来自4.2节的光谱B）；(C) 来自4.2节的校正后光谱。
<img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig2.jpg" alt="荧光光谱图，尿素对蛋白质稳定性的影响，强度与波长关系。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 图1中膜蛋白在不同尿素浓度下的校正色氨酸荧光光谱。
<img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig3.jpg" alt="蛋白质变性，S形曲线，尿素浓度 vs. 解折叠分数，ΔG=6.2 kcal/mol，图表。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 根据图2数据获得的解折叠曲线，拟合至4.4节中的方程。吉布斯自由能根据4.5节计算得出。

<ol><li>Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShirley%2C+BA+%22Protein+Folding+and+Stability%22">Protein Folding and Stability</a>. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li>
<li>Lau, F. W., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Assessing+the+Stability+of+a+Membrane+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein.</a> Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).</li>
<li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li>
<li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+scene+investigation%3A+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li>
<li>Hong, H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+coupling+of+integral+membrane+protein+stability+to+lipid+bilayer+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).</li>
<li>Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Tryptophan+Microenvironment%2C+Soluble+Domain%2C+and+Vesicle+Size+on+the+Thermodynamics+of+Membrane+Protein+Folding%3A+Lessons+from+the+Transmembrane+Protein+OmpA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA.</a> Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本方案描述了含有色氨酸残基的膜相关蛋白和肽的去折叠曲线的生成方法。此处假设色氨酸荧光信号能够反映蛋白是否处于折叠状态并插入合成脂质囊泡中，或是在溶液中处于去折叠状态。本报告中还采用了其他假设，例如两态折叠模型以及自由能与变性剂浓度呈线性关系；若修改这些假设，则需使用不同的方程。2 实验方案可轻松调整，以采用其他光谱学可观测量，如圆二色性、吸收光谱或外源染料的荧光信号，3 也可结合凝胶电泳技术。4 此外，可选用不同的变性剂，如盐酸胍、酸性溶液或温度变化，以及不同类型的脂质/囊泡，例如带负电荷的脂质、大单层囊泡或胶束。5,6 最后，该方案适用于任何满足可逆折叠条件、并具有光谱学或其他可观测标记以区分不同构象状态的膜蛋白、膜相关肽段以及可溶性蛋白/肽段。对于可溶性蛋白，显然无需在方案中加入囊泡。
去折叠的吉布斯自由能提供了关于稳定生物大分子的非共价相互作用的信息。在本实验室中，我们测定了外膜蛋白A（OmpA）突变体的去折叠曲线，这些突变体在不同位置含有单个色氨酸残基，并报道了与含有五个天然色氨酸残基的...

<table><tbody><tr><td>DMPC</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>MP Biomedicals</td><td>04821527</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285</td><td></td></tr></tbody></table>

荧光光谱法测定膜蛋白折叠的热力学

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

膜蛋白折叠是一个具有基础科学意义和健康相关性的新兴研究领域。细胞中膜蛋白的丰富性凸显了对这一普遍存在的蛋白家族折叠过程进行全面研究的必要性。此外，我们在表征与错误折叠蛋白相关疾病方面的能力不断进步，推动了蛋白质折叠领域大量的实验和理论研究工作。然而，由于膜蛋白本身固有的挑战性以及折叠机制的复杂性，这一重要领域的快速发展受到了限制。本文概述了一种实验方法，用于测定来自大肠杆菌（E. coli）的一种典型整合膜蛋白在无变性剂条件下的解折叠吉布斯自由能（ΔG°H2O）这一热力学参数。该实验方案重点利用荧光光谱法，通过检测不同变性剂浓度下折叠态与解折叠态的平衡分布来确定其相对比例。文中强调了合成脂质囊泡制备过程中的实验注意事项，以及数据分析流程中的关键步骤。该技术具有良好的通用性，可适用于不同类型的变性剂（如温度和pH）以及多种折叠环境（如脂质双分子层和胶束）。本方案可推广应用于任何满足下文所述标准的膜蛋白或可溶性蛋白。

本视频文章详细介绍了通过色氨酸荧光法测定膜蛋白折叠吉布斯自由能的实验步骤。

膜蛋白折叠是一个具有基础科学意义和健康相关重要性的新兴研究领域。细胞中膜蛋白的丰度……

以下实验的总体目标是测量与膜蛋白折叠相关的热力学参数。首先组装小型LAR囊泡，为膜蛋白提供折叠环境。构建完成后，利用这些囊泡制备含有蛋白质且尿素浓度系统性变化的样品。接下来，测量每个样品的色氨酸荧光光谱，以收集生成膜蛋白去折叠曲线所需的数据。结果表明，可根据色氨酸荧光光谱生成的去折叠曲线获得膜蛋白去折叠的吉布斯自由能。大家好，我叫Judy Kim，是加州大学圣地亚哥分校的助理教授。您即将观看的方法揭示了膜蛋白的一个重要特性。具体而言，我们将向您展示如何测量一种已正确折叠并插入脂双层中的蛋白质的稳定性。我叫Diana Ottinger，是加州大学圣地亚哥分校化学系的一名研究生。今天，我们将以一种典型的膜蛋白为例来演示该方法。然而，此技术具有普适性，也可应用于其他生物体系，如膜相关肽和可溶性蛋白。现在，让我们开始吧。在本方案开始之前，购买含有二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DMPC）的氯仿溶液，并将其加入洁净的玻璃小瓶中。每瓶加入20毫克脂质，然后向每瓶中通入一层氮气以防止脂质氧化，并密封小瓶。每次实验使用一个含有20毫克脂质的氯仿溶液小瓶。制备储备囊泡溶液时，首先使用氮气流吹扫小瓶内容物约一小时，配合聚四氟乙烯（Teflon）隔垫和针头，直至溶剂完全挥发。向干燥的脂质中加入1毫升20毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH 7.3），并在水浴中涡旋振荡约30秒使其充分重悬。将所得乳白色悬浮液转移至带有锥形底部的塑料15毫升离心管中，使用移液器操作。向最初盛有脂质的空玻璃小瓶中再加入一毫升磷酸盐缓冲液，并重复超声处理。将所得悬浮液加入同一支15毫升离心管中。重复此步骤共四次，以获得最终体积为四毫升、脂质浓度为五毫克每毫升的溶液。将脂质囊泡悬浮液置于温水浴中，使用超声破碎仪的微探头以50%占空比超声处理一小时。水浴的作用是防止脂质溶液过热，并保持水相脂质溶液的温度高于双分子层相变温度。将超声处理后的溶液通过0.22微米的一次性注射器滤器过滤，以去除探头尖端的碎屑，并将滤过的溶液在37摄氏度下平衡过夜。为准备初始荧光去折叠实验的样品，配制含有10摩尔尿素的20毫摩尔磷酸盐缓冲液作为储备液，同时配制20毫摩尔磷酸盐缓冲液作为储备缓冲液。根据书面实验方案，应通过折光仪测量溶液的折射率，并与已知数值进行比较，从而实验确定尿素浓度。接下来，配制变性蛋白的储备液，其中蛋白浓度约为 200 微摩尔/升，溶于 8 摩尔/升尿素和 20 毫摩尔/升磷酸盐缓冲液中。在本视频中，膜蛋白 OPA A 用于演示该实验流程：通过混合适量的蛋白储备液、脂质储备液、10 摩尔/升尿素储备液和磷酸盐缓冲液储备液，制备用于荧光研究的样品，使最终样品中含有约 4 微摩尔/升蛋白、1 毫克/毫升脂质，并含有 0 至 8 摩尔/升尿素（以 1 摩尔/升为增量），总体积为 200 微升。空白样品以相同方式制备。然而，用四微升八摩尔的尿素溶液代替蛋白质。制备这些空白样品的目的是为了扣除蛋白质荧光光谱中出现的散射和背景信号。在测量荧光光谱前，需将蛋白质样品在空白溶液中于37摄氏度孵育至少两小时。为确保完全折叠，测量前一小时开启荧光分光光度计。膜蛋白通常只有在温度高于双分子层相变温度时，才能折叠到合成脂质中。因此，对于DMPC，荧光分光光度计样品池的温度设定为30摄氏度。在稳态荧光光谱仪上设置荧光实验，测量每个样品在空白条件下的色氨酸荧光。激发波长应设置为290纳米，以避免激发酪氨酸残基，发射波长范围为305至500纳米。入口和出口狭缝带宽均使用3纳米。可优化波长增量和积分时间以获得最佳信噪比。波长增量和积分时间的典型值分别为每步1纳米和每步0.5秒。用移液器将200微升样品加入容量为160微升的微量熔融石英Q Vet中，并将qve放入仪器的qve支架中。最后，可以开始进行荧光测量：将荧光光谱的 XY 数据表加载到 Igor Pro、MATLAB Origin 或 Excel 等软件中。在本演示中，将使用 Igor Pro 去除尿素和脂质体背景，将空白样品的荧光光谱乘以 S 缩放因子，然后从蛋白质-脂质溶液的原始荧光光谱中减去该值。在对应的尿素浓度下，从校正后的光谱中记录最大荧光波长（即 lambda max）。对于每种尿素浓度，完全去折叠膜蛋白的典型值为350纳米，而折叠蛋白的典型值约为330纳米。将列表中的波长转换为去折叠分数，即将最大波长（λmax）值的范围转换为0到1之间的范围，使λmax值与去折叠群体的分数相对应。然后将去折叠蛋白的比例对尿素浓度作图。去折叠蛋白比例 F 随尿素浓度 C 变化的曲线可拟合为一个方程，该方程假设蛋白仅以折叠态或去折叠态存在。其中系数 M 对应于自由能相对于变性剂浓度的变化率，CM 对应于折叠态与去折叠态蛋白群体相等时的尿素浓度中点。R 是气体常数，T 是开尔文温度。拟合过程可得到系数 m 和 cm 的数值。这些系数相乘可得到 delta G，即在无尿素条件下蛋白质解折叠的吉布斯自由能。所描述的解折叠曲线揭示了导致最大吸收波长（lambda max）发生显著变化的尿素浓度范围。该范围通常较小，大部分解折叠过程都发生在此狭窄范围内，以便精确测定解折叠的自由能。应在该区域分析更多样品，以获得包含足够多数据点的曲线图，从而实现最优的最小二乘法拟合。例如，若蛋白质在 2 至 4 mol 的尿素浓度之间发生解折叠，可在该尿素浓度范围内以 0.2 mol 的梯度制备样品，以更精确地揭示解折叠曲线中这一关键区域的形状。为获得最佳结果，应至少每 0.5 mol 变化时包含一次空白对照，每 0.2 mol 变化时进行一次测量。由此图获得的解折叠自由能可能与原始解折叠曲线中获得的值略有不同，但反映了更精确的数值。以下是含有单个色氨酸残基的代表性膜蛋白 om a 的色氨酸荧光光谱。根据方案所述，将空白样品的原始荧光光谱从蛋白的原始荧光光谱中扣除，从而得到校正后的光谱。此处展示了根据所述方法获得的多种尿素浓度下膜蛋白的校正色氨酸荧光光谱。在本示例中，假设蛋白质仅处于折叠或去折叠状态，且不存在稳定中间态，据此生成了去折叠曲线。参数 M 反映了蛋白质去折叠后暴露于溶剂中的多肽链数量，而 CM 是一个关键参数，表示折叠态与去折叠态群体数量相等时所需的变性剂浓度。CM 和 M 的较大值表明蛋白质稳定性较高。根据此方法，计算得出 OPA a 的解折叠吉布斯自由能为每摩尔 6.2 千卡。此外，还可采用其他解折叠方法，如加热、调节 pH 值以及其他化学变性剂，以获得有关蛋白质折叠热力学的类似信息。观看本视频后，您应能充分理解如何根据蛋白质折叠态与去折叠态之间不同的荧光特性来测定其稳定性。此外，您也可以采用其他方法（如圆二色性、差示扫描量热法等）生成去折叠曲线，只要该方法能够反映蛋白质构象变化即可，而不论您选择何种分析工具。去折叠曲线法具有良好的通用性，可广泛应用于多种膜蛋白和可溶性蛋白质的研究。

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荧光光谱法测定膜蛋白质折叠的热力学

我们将介绍一种在单细胞水平上结合荧光技术测量膜蛋白离子转运动力学及构象变化位点特异性分析的方法。该技术适用于离子通道、转运蛋白和离子泵，并可用于确定蛋白质亚基之间的距离限制。...

研究膜蛋白的构象动力学 原位 采用位点特异性荧光标记

本视频展示了利用荧光涨落光谱法（FFS）研究蛋白质同源寡聚化的技术。在使用FFS研究蛋白质寡聚化时，样品中带有荧光标记的蛋白质会通过某种试剂诱导形成二聚体。利用共聚焦显微镜，当蛋白质分子进出微小的观测体积时，通过分析荧光分子亮度涨落的变化，可确定蛋白质的寡聚状态。...

荧光涨落光谱法研究蛋白质同源寡聚化

蛋白质功能的关键步骤，特别是主链构象变化和质子转移反应，通常发生在微秒到毫秒的时间尺度上。这些动力学过程可以通过时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱技术进行研究，尤其适用于其功能由光触发的蛋白质。...

利用时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱研究光敏蛋白中的质子转移与蛋白质构象动力学

差示扫描荧光法是一种广泛用于筛选小分子文库与蛋白质相互作用的方法。本文介绍了一种简单的方法，可将此类分析扩展至估算小分子与其靶标蛋白之间的解离常数。...

使用差示扫描荧光法测定蛋白质-配体相互作用

质膜蛋白和脂质的空间分布与时间动态是生物学中的热点问题。本文通过时空图像涨落分析来探讨这一问题，该方法在概念上可提供与单粒子追踪相同的物理量，但使用小分子标记物和常规显微镜装置即可实现。...

从快速荧光成像到商用显微镜下活细胞膜上的分子扩散规律研究

我们提出了一种利用差示扫描量热法快速表征生物分子折叠及与热不稳定配体结合相互作用的实验方案。...

利用热不稳定配体测量生物大分子DSC谱图以快速表征折叠与结合相互作用

细胞中有许多蛋白质能够感知并诱导膜曲率。本文介绍一种从脂质囊泡中拉取膜纳米管的方法，用于研究蛋白质或任何具有曲率活性的分子与弯曲膜之间的相互作用 体外.

从巨大单层囊泡中拉取膜纳米管

本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法，用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即...

一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法

时间分辨单分子蛋白质诱导荧光增强是一种有用的荧光光谱邻近传感器，可灵敏检测蛋白质局部结构变化。本文展示了该方法可用于揭示α-突触核蛋白中稳定的局部构象，而使用长程FRET标尺测量时，该蛋白通常被认为呈球状无序且不稳定。...

利用时间分辨的蛋白质诱导荧光增强技术逐个识别单个α-突触核蛋白单体的稳定局部构象

本方案描述了一种对膜蛋白进行荧光尺寸排阻色谱（FSEC）分析的操作流程，用于评估其在后续功能与结构分析中的质量。文中展示了多种G蛋白偶联受体（GPCRs）在去垢剂溶解和无去垢剂条件下获得的代表性FSEC结果。...

快速评估膜蛋白质量的荧光尺寸排阻色谱法

本文介绍了在共聚焦显微镜模式下，利用单分子时间分辨荧光各向异性研究生物大分子局部柔韧性和动力学特性的实验方案。...

单分子时间分辨荧光各向异性用于表征生物大分子局部柔性

学习使用色氨酸荧光光谱法测定膜蛋白质折叠的热力学参数。本实验通过构建小型LAR囊泡环境，结合尿素浓度梯度变性与荧光检测，获取吉布斯自由能数据，为膜蛋白稳定性研究提供可靠方法。

荧光光谱法测定膜蛋白折叠的热力学

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