荧光光谱法测定膜蛋白折叠的热力学

以下实验的总体目标是测量与膜蛋白折叠相关的热力学参数。首先组装小型LAR囊泡，为膜蛋白提供折叠环境。构建完成后，利用这些囊泡制备含有蛋白质且尿素浓度系统性变化的样品。

接下来，测量每个样品的色氨酸荧光光谱，以收集生成膜蛋白去折叠曲线所需的数据。结果表明，可根据色氨酸荧光光谱生成的去折叠曲线获得膜蛋白去折叠的吉布斯自由能。大家好，我叫Judy Kim，是加州大学圣地亚哥分校的助理教授。

您即将观看的方法揭示了膜蛋白的一个重要特性。具体而言，我们将向您展示如何测量一种已正确折叠并插入脂双层中的蛋白质的稳定性。我叫Diana Ottinger，是加州大学圣地亚哥分校化学系的一名研究生。

今天，我们将以一种典型的膜蛋白为例来演示该方法。然而，此技术具有普适性，也可应用于其他生物体系，如膜相关肽和可溶性蛋白。现在，让我们开始吧。

在本方案开始之前，购买含有二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DMPC）的氯仿溶液，并将其加入洁净的玻璃小瓶中。每瓶加入20毫克脂质，然后向每瓶中通入一层氮气以防止脂质氧化，并密封小瓶。每次实验使用一个含有20毫克脂质的氯仿溶液小瓶。

制备储备囊泡溶液时，首先使用氮气流吹扫小瓶内容物约一小时，配合聚四氟乙烯（Teflon）隔垫和针头，直至溶剂完全挥发。向干燥的脂质中加入1毫升20毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH 7.3），并在水浴中涡旋振荡约30秒使其充分重悬。将所得乳白色悬浮液转移至带有锥形底部的塑料15毫升离心管中，使用移液器操作。

向最初盛有脂质的空玻璃小瓶中再加入一毫升磷酸盐缓冲液，并重复超声处理。将所得悬浮液加入同一支15毫升离心管中。重复此步骤共四次，以获得最终体积为四毫升、脂质浓度为五毫克每毫升的溶液。

将脂质囊泡悬浮液置于温水浴中，使用超声破碎仪的微探头以50%占空比超声处理一小时。水浴的作用是防止脂质溶液过热，并保持水相脂质溶液的温度高于双分子层相变温度。

将超声处理后的溶液通过0.22微米的一次性注射器滤器过滤，以去除探头尖端的碎屑，并将滤过的溶液在37摄氏度下平衡过夜。为准备初始荧光去折叠实验的样品，配制含有10摩尔尿素的20毫摩尔磷酸盐缓冲液作为储备液，同时配制20毫摩尔磷酸盐缓冲液作为储备缓冲液。根据书面实验方案，应通过折光仪测量溶液的折射率，并与已知数值进行比较，从而实验确定尿素浓度。

接下来，配制变性蛋白的储备液，其中蛋白浓度约为 200 微摩尔/升，溶于 8 摩尔/升尿素和 20 毫摩尔/升磷酸盐缓冲液中。在本视频中，膜蛋白 OPA A 用于演示该实验流程：通过混合适量的蛋白储备液、脂质储备液、10 摩尔/升尿素储备液和磷酸盐缓冲液储备液，制备用于荧光研究的样品，使最终样品中含有约 4 微摩尔/升蛋白、1 毫克/毫升脂质，并含有 0 至 8 摩尔/升尿素（以 1 摩尔/升为增量），总体积为 200 微升。空白样品以相同方式制备。

然而，用四微升八摩尔的尿素溶液代替蛋白质。制备这些空白样品的目的是为了扣除蛋白质荧光光谱中出现的散射和背景信号。在测量荧光光谱前，需将蛋白质样品在空白溶液中于37摄氏度孵育至少两小时。

为确保完全折叠，测量前一小时开启荧光分光光度计。膜蛋白通常只有在温度高于双分子层相变温度时，才能折叠到合成脂质中。因此，对于DMPC，荧光分光光度计样品池的温度设定为30摄氏度。

在稳态荧光光谱仪上设置荧光实验，测量每个样品在空白条件下的色氨酸荧光。激发波长应设置为290纳米，以避免激发酪氨酸残基，发射波长范围为305至500纳米。入口和出口狭缝带宽均使用3纳米。

可优化波长增量和积分时间以获得最佳信噪比。波长增量和积分时间的典型值分别为每步1纳米和每步0.5秒。用移液器将200微升样品加入容量为160微升的微量熔融石英Q Vet中，并将qve放入仪器的qve支架中。

最后，可以开始进行荧光测量：将荧光光谱的 XY 数据表加载到 Igor Pro、MATLAB Origin 或 Excel 等软件中。在本演示中，将使用 Igor Pro 去除尿素和脂质体背景，将空白样品的荧光光谱乘以 S 缩放因子，然后从蛋白质-脂质溶液的原始荧光光谱中减去该值。在对应的尿素浓度下，从校正后的光谱中记录最大荧光波长（即 lambda max）。

对于每种尿素浓度，完全去折叠膜蛋白的典型值为350纳米，而折叠蛋白的典型值约为330纳米。将列表中的波长转换为去折叠分数，即将最大波长（λmax）值的范围转换为0到1之间的范围，使λmax值与去折叠群体的分数相对应。

然后将去折叠蛋白的比例对尿素浓度作图。去折叠蛋白比例 F 随尿素浓度 C 变化的曲线可拟合为一个方程，该方程假设蛋白仅以折叠态或去折叠态存在。其中系数 M 对应于自由能相对于变性剂浓度的变化率，CM 对应于折叠态与去折叠态蛋白群体相等时的尿素浓度中点。

R 是气体常数，T 是开尔文温度。拟合过程可得到系数 m 和 cm 的数值。

这些系数相乘可得到 delta G，即在无尿素条件下蛋白质解折叠的吉布斯自由能。所描述的解折叠曲线揭示了导致最大吸收波长（lambda max）发生显著变化的尿素浓度范围。该范围通常较小，大部分解折叠过程都发生在此狭窄范围内，以便精确测定解折叠的自由能。

应在该区域分析更多样品，以获得包含足够多数据点的曲线图，从而实现最优的最小二乘法拟合。例如，若蛋白质在 2 至 4 mol 的尿素浓度之间发生解折叠，可在该尿素浓度范围内以 0.2 mol 的梯度制备样品，以更精确地揭示解折叠曲线中这一关键区域的形状。为获得最佳结果，应至少每 0.5 mol 变化时包含一次空白对照，每 0.2 mol 变化时进行一次测量。

由此图获得的解折叠自由能可能与原始解折叠曲线中获得的值略有不同，但反映了更精确的数值。以下是含有单个色氨酸残基的代表性膜蛋白 om a 的色氨酸荧光光谱。根据方案所述，将空白样品的原始荧光光谱从蛋白的原始荧光光谱中扣除，从而得到校正后的光谱。

此处展示了根据所述方法获得的多种尿素浓度下膜蛋白的校正色氨酸荧光光谱。在本示例中，假设蛋白质仅处于折叠或去折叠状态，且不存在稳定中间态，据此生成了去折叠曲线。参数 M 反映了蛋白质去折叠后暴露于溶剂中的多肽链数量，而 CM 是一个关键参数，表示折叠态与去折叠态群体数量相等时所需的变性剂浓度。

CM 和 M 的较大值表明蛋白质稳定性较高。根据此方法，计算得出 OPA a 的解折叠吉布斯自由能为每摩尔 6.2 千卡。此外，还可采用其他解折叠方法，如加热、调节 pH 值以及其他化学变性剂，以获得有关蛋白质折叠热力学的类似信息。

观看本视频后，您应能充分理解如何根据蛋白质折叠态与去折叠态之间不同的荧光特性来测定其稳定性。此外，您也可以采用其他方法（如圆二色性、差示扫描量热法等）生成去折叠曲线，只要该方法能够反映蛋白质构象变化即可，而不论您选择何种分析工具。去折叠曲线法具有良好的通用性，可广泛应用于多种膜蛋白和可溶性蛋白质的研究。