Name: 免疫组化:人类神经干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-24T00:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 41 s
Description: 学习免疫组化技术用于人类神经前体细胞研究。本方案优化抗体使用效率，通过过夜孵育和荧光显微镜观察，实现抗原精确定位，为神经发育研究提供可靠的可重复实验方法。

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作者谨感谢加州儿童医院橙县研究所国家人类神经干细胞资源中心的 Philip H. Schwartz 博士提供 hNSPC 培养物，以及埃默里大学的 Gary Bassell 博士在石蜡膜染色技术方面的初步指导。

第1天：制备德国玻璃盖玻片及接种细胞
注意：德国玻璃盖玻片通常更适用于原代神经干细胞和神经元的培养。我们采用以下清洗方案以提高细胞的黏附和铺展。将盖玻片置于一个小支架中，确保液体能够接触盖玻片的两侧。首先，将盖玻片在1% Liquinox溶液中孵育10分钟，随后用去离子水洗涤3次。确保无皂液气泡残留。接着，将盖玻片在1M HCl中孵育30分钟，再用去离子水洗涤3次。于65°C下过夜干燥盖玻片。将盖玻片转移至玻璃培养皿中，并进行高压灭菌处理以达到灭菌效果。
<ol>
<li>在组织培养超净台中，将无菌盖玻片放入大小合适的&nbsp;孔板中。 </li>
<li>用层粘连蛋白包被盖玻片以促进细胞黏附。将盖玻片置于含10 µg/ml多聚-D-赖氨酸（PDL）的无菌水中，室温孵育5分钟。吸除PDL溶液，再将盖玻片置于含20 µg/ml层粘连蛋白的EMEM培养基中，在37°C组织培养孵箱中孵育4小时或过夜。 <ol>
<li>注意：请参考Passaging Human Neural Stem Cells文章（<a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a>）和Counting Human Neural Stem Cells文章（<a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a>），了解如何重悬和计数hNSPCs。 </li>
</ol></li>
<li>用PBS冲洗经层粘连蛋白包被的盖玻片，并以特定密度将细胞接种至每个含有盖玻片的孔中（我们通常对用于免疫染色的细胞采用100,000–300,000个细胞/ml的初始接种密度）。 </li>
<li>将孔板放入37°C组织培养孵箱中，使细胞贴附于盖玻片（通常至少需要4小时）。</li>
</ol>
第2天：细胞的固定、通透、封闭及一抗孵育
注意：我们使用以下4%多聚甲醛固定液来保存细胞形态。该配方包含pH转换步骤，以使多聚甲醛充分溶解。我们更倾向于采用此方法而非加热溶解多聚甲醛，因为较高温度可能导致甲酸生成，从而在使用荧光染色时增加背景信号。固定液中的某些组分有助于维持细胞骨架结构（MgCl2 和 EGTA），而其他组分则有助于保持整体形态（蔗糖）。
用于细胞的4%多聚甲醛固定液
<table style="border-collapse: collapse; border: medium none" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
<tr>
<td>试剂与步骤：</td>
<td>配制 100 mL 固定液所需用量：</td>
</tr>
<tr>
<td>MilliQ 水</td>
<td>75 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>多聚甲醛（在通风橱中称量）</td>
<td>4 g</td>
</tr>
<tr>
<td>10N NaOH，搅拌并逐滴加入直至溶液澄清</td>
<td>按需添加</td>
</tr>
<tr>
<td>10X PBS</td>
<td>10 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>1M MgCl2</td>
<td>0.5 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>0.5 M EGTA</td>
<td>2 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>蔗糖</td>
<td>4 g</td>
</tr>
<tr>
<td>6N HCl，滴定至 pH 7.4</td>
<td>按需添加</td>
</tr>
<tr>
<td>MilliQ 水</td>
<td>加至 100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">4°C 保存，最多可保存 1 周。使用前预热至 37°C</td>
</tr>
</tbody>
</table>
<ol>
<li>在实验台上移除培养基，加入预热的固定剂。孵育5-15分钟（根据待检测抗原的不同而定，通常使用10分钟）。此步骤及后续步骤均在室温下进行。 </li>
<li>将固定剂倒入适当的容器中，因为&nbsp;许多机构将多聚甲醛视为危险废物。用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。移除液体时，注意避免抽吸导致细胞干燥。此外，每次更换溶液前，应提前准备好下一溶液，并在移除覆盖细胞的液体后立即加入新溶液，防止细胞干燥。 </li>
<li>如果目标抗原位于细胞内，则必须使细胞膜通透，以允许抗体进入。为实现细胞通透化，使用新鲜配制的含0.3% Triton X-100的PBS溶液。由于Triton黏稠，移液时应缓慢操作，并确保去垢剂在加入细胞前已完全溶解于PBS中。通透化处理5分钟后，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。 </li>
<li>必须使用封闭剂处理细胞，以防止抗体非特异性结合。我们使用牛血清白蛋白（BSA）作为封闭剂。封闭液的配制方法为：将5% BSA溶解于PBS中（置于摇床或旋转器上，因溶解需要一定时间），然后使用0.45 µm注射器滤器过滤溶液。将细胞在5% BSA/PBS溶液中于室温下封闭1小时。</li>
</ol>
将一抗（最好针对目标蛋白具有特异性）用1% BSA/PBS（通过5% BSA/PBS稀释配制）稀释至预先确定的浓度。将稀释后的一抗溶液（每25 mm盖玻片30 µl，每18 mm盖玻片20 µl，每12 mm盖玻片15 µl）滴加到铺有Parafilm的玻璃板上。用镊子夹取带有固定细胞的盖玻片，翻转使其细胞面朝下，覆盖在抗体溶液上，使细胞与抗体充分接触。在整体结构上方再覆盖一条Parafilm。4°C条件下孵育过夜。
第3天：洗涤、二抗孵育、核染色与封片
<ol>
<li>小心移除顶部的封口膜条，取出盖玻片，将其翻转后重新放回含有 PBS 的孔板中进行洗涤，确保细胞面朝上。 </li>
<li>用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。 </li>
<li>选择能够识别一抗的二抗。例如，如果一抗来源于兔，则二抗应能识别兔 IgG。同时需注意匹配抗体的同种型（如 IgG、IgM 等）。若使用多种一抗，应确保它们来自不同物种或具有不同同种型，并计划使用带有不同标记物的二抗进行检测。例如，可使用偶联红色荧光染料的抗兔二抗与偶联绿色荧光染料的抗小鼠二抗。将细胞在含 1% BSA 的适当稀释浓度的二抗溶液中避光、室温孵育 2 小时，操作方法与一抗相同（视频中未展示具体步骤）。若二抗保存于甘油溶液中，孵育所需体积可能略大于一抗（每片 25 mm 盖玻片需 40 µl，18 mm 盖玻片需 30 µl，12 mm 盖玻片需 25 µl）。 
<ul>
<li>注意：若使用荧光分子标记二抗，则自加入二抗后样品需避免光照。孵育过程应在避光条件下进行，或将培养板用铝箔包裹。 </li>
</ul>
</li>
<li>按照一抗操作所述方法，小心从封口膜上取下盖玻片。用 PBS 洗涤细胞 2 次，每次 5 分钟，随后在 PBS 中加入终浓度为 2 µg/ml 的 Hoechst 核染料进行 1 分钟孵育（如需进行核复染）。若 Hoechst 染料较旧且信号过弱，可适当延长孵育时间和/或提高染料浓度。Hoechst 孵育结束后，用 PBS 洗涤 1 次，每次 5 分钟。 </li>
<li>应将盖玻片用封片剂封固于载玻片上，以便在显微镜下观察。若使用荧光分子检测二抗，所用封片剂应含有抗荧光淬灭成分。我们通常使用 Vectashield 作为荧光封片剂。在载玻片上滴加适量体积的 Vectashield（每片 25 mm 盖玻片加 12 µl，18 mm 盖玻片加 6 µl，12 mm 盖玻片加 3 µl）。 </li>
<li>小心拿起盖玻片，用去离子水冲洗背面以去除盐分（来自 PBS）。用无尘纸或纸巾轻轻吸去多余水分，然后将细胞面朝下置于 Vectashield 液滴上。将盖玻片以一定角度缓慢放下，避免产生气泡。在载玻片上标注日期及样品信息。 </li>
<li>将贴附盖玻片的载玻片置于避光环境中干燥，然后用吸水纸吸去盖玻片边缘多余的 Vectashield。如有需要，可用指甲油密封盖玻片边缘（尤其适用于在倒置显微镜下观察的样品）。我们通常将载玻片保存于 -20°C 冰箱中。</li>
</ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamin+A%2C+the+Arp2%2F3+complex%2C+and+the+morphology+and+function+of+cortical+actin+filaments+in+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells.</a> J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).</li>
<li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of stem cells.</a> In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li>
</ol>

本方案描述了一种针对人神经干细胞/祖细胞（hNSPCs）的免疫染色方法，可最大限度减少所需抗体的用量，同时实现可靠的细胞染色。文中所述步骤最适合用于细胞内抗原的染色，但也可稍作修改，以用于细胞表面分子的染色或增强细胞骨架的染色效果。

<table><tbody><tr><td>德国玻璃盖玻片（Deutsche Spiegelglas）</td><td>工具</td><td>Carolina Biological</td><td>WW-63-3029</td><td>提供 12、15、18、22、25 mm 盖玻片</td></tr><tr><td>Liquinox 无磷酸盐洗涤剂</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273279</td><td>非常黏稠</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>天然小鼠层粘连蛋白（Laminin, natural mouse）</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>试剂</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>由 Fisher 以所示目录号分销</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100（Triton X-100）</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>非常黏稠</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>潜在致癌物，使用粉末和溶液时需谨慎</td></tr><tr><td>无IgG牛血清白蛋白</td><td>试剂</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-161</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>试剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>黏稠</td></tr></tbody></table>

免疫细胞化学：人神经干细胞

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

免疫细胞化学是一种非常强大且相对简单的方法，用于确定培养细胞中目标抗原（最常见的是蛋白质）的存在、亚细胞定位以及相对丰度。本方案提供了一系列易于操作的步骤，使研究人员能够在节约一抗和二抗用量的同时，获得高质量、可重复的定性和定量染色数据。该方案有两个方面有助于减少染色所需抗体的用量。首先，细胞培养在放置于组织培养板孔中的小型圆形盖玻片上。固定后，可将带有细胞的盖玻片从培养板孔中取出。进行抗体染色时，将带有细胞的盖玻片倒扣在封口膜上的一小滴抗体溶液液滴上，并用另一片封口膜覆盖，以防止干燥。采用此方法，每个盖玻片（或样本）仅需约 25 μl 抗体溶液。本方案描述了人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）的免疫染色，但也可用于其他多种细胞类型。

免疫细胞化学是一种强大的方法，用于确定培养细胞中目标抗原的存在、亚细胞定位以及相对丰度。本方案提供了一系列简单易行的步骤，帮助使用者节约抗体并最大限度地优化染色效果。

免疫细胞化学是一种非常强大且相对简单的方法，用于确定特定蛋白的存在、亚细胞定位以及相对丰度……

大家好，我是 Steve。我在加州大学尔湾分校病理学系的 Flanagan 博士的实验室工作。今天，我将向您展示如何对人类神经前体细胞进行免疫化学。该方案包括将细胞放在铺设涂层的盖玻片上，封闭细胞并在一抗中孵育过夜，然后进行几次 WAS 并在室温下放置二抗。最后，将盖玻片安装到显微镜支架上。让我们开始吧。因此，首先，我将三个 12 毫米宽的无菌德国玻璃盖玻片放入 24 孔板中，以便用层压板涂覆它们。现在我把盖玻片放在板里，首先我要加入 PDL 聚赖氨酸溶液，我要在室温下将盖上盖的潜膜在 PDL 中孵育 5 分钟。所以现在，在 5 分钟结束时，我将去除 PDL 并涂上层粘连蛋白，并将盖玻片在层压板中孵育至少 4 小时或更长时间过夜。因此，我将板在层压板中孵育过夜，现在我将用 PBS 冲洗盖玻片，并将我已经计数的人神经前体细胞铺板。所以我刚刚去除了层压溶液，现在我要用 PBS 控制盖玻片。所以现在我要去除 PBS 并涂上培养基溶液。最后，我已准备好查看单元格。因此，我将以每研磨 10 万个细胞的速度查看细胞，这意味着对于一个 24 孔板，我将在每孔中加入 50， 000 个细胞，因为每个孔含有半毫升。因此，我将将板从一侧倾斜到另一侧，以确保细胞均匀分布在盖玻片的表面上。现在我要把它们放在培养箱中至少 24 小时，让它们安定下来并展开进行免疫化学。所以细胞已经生长了 24 小时，我观察了它们，它们被附着并很好地分布开来。所以现在我要用 4% 的高度固定它们 5 分钟。但首先我要去除培养基，我不想让细胞变干。因此，我将去除培养基并同时添加固定剂。所以它被称为双手技术。所以现在我要在室温下将细胞在固定剂中孵育 5 分钟。所以已经过去了五分钟。我将去除 PFA 并将其放入 PFA 废液容器中，并在去除 PFA 的同时加入 PBS，这样细胞就不会变干。因此，我将使用其中一个塑料吸取移液器来拉起 PFA，并将计时器设置为 5 分钟。因此，当我的细胞在 PBS 洗涤中时，我将使用 Triton X 100 准备渗透可视化解决方案。它是一种非离子洗涤剂，非常非常粘稠。因此，重要的是要等到所有溶液都进入并进入移液器。因此，我将制备 0.3% 的 PBS 溶液，我将添加 10 密耳的 PBS。在这 10 密耳的 PBS 中，我将在接下来的 100 毫升中加入 30 微升的 tri。因此，我将添加 30 微升 tri，然后加入 100 到 10 密耳的 PBS。因此，我将增加大约 10 秒的时间，让所有溶液都进入尖端。所以我，我这里有我的渗透利用解决方案。我把它放在旋转器上 10 分钟，然后涡旋以确保粘稠的 tritton 完全溶解。现在，我已准备好执行渗透可视化步骤。所以我要在室温下静置 5 分钟。所以已经过去了五分钟。我现在要进行三次 5 分钟的 PBS 洗涤，以确保洗掉所有的海氚。所以，我再次将时钟设置为 5 分钟。所以我，我刚刚完成了所有的洗涤步骤，所以我准备好进行阻塞步骤。因此，对于封闭步骤，我在 PBS 中准备了 5% BSA 溶液。就像所有洗涤一样，我将去除 PBS 并同时添加封闭溶液。封闭步骤将在室温下进行 1 小时。因此，当我的细胞处于封闭状态时，我将准备用于一抗孵育的板。所以我要从这个玻璃板开始，然后我要剪一块，一块差不多大小的封口膜。我要做的是把它包起来，我需要一些胶带，所以我需要四块胶带。所以我只是要把它们都准备好。所以我要拿这张封段膜，把它拉直，这样表面就好又光滑。然后，我将把每一端都用胶带粘在玻璃板的背面。所以现在我要拉动另一端以确保表面平直，然后我要用胶带将另一端粘在后面。所以现在我需要另一张与第一张相同尺寸的对膜。基本上我也会做同样的事情。所以我在第一片上面贴了第二片封口膜，就像第一片一样，只是我把第二片 perfil 的一端松散了，因为我要放置抗体溶液，然后在第一片上放上粉末。然后我要把第二块放在上面，做一个三明治。但现在，我要标记要放置抗体溶液和覆盖物的地方。所以，细胞已经在封闭液中放置了一个小时，我现在要把盖玻片放在一抗液滴上过夜孵育。因此，我将滴入一滴 35 μL 的一抗，并且要非常小心，不要排出所有液体，因为这可能会产生气泡，而气泡可能会干扰抗体与抗原的结合。所以我想尽量避免液滴中出现气泡，所有三滴一抗，我准备在这些液滴上盖上细胞盖玻片。所以我现在要做的是拿起一张封面单。因此，首先我将盖玻片移到一边，并尝试在镊子打开的情况下轻轻提起它。一旦我觉得我已经抓住了盖玻片，我就要关闭以慢慢关闭镊子，然后轻轻地将盖玻片从井中提起。所以现在的单元格在盖玻片的顶部。所以我要做的是倒置，轻轻触摸液滴，然后慢慢地将其放在液滴上，不产生任何气泡。因此，我将对第二个和第三个盖玻片重复相同的过程。最后一步是将第二块 para film 放在上面。我要做的是，我要像那样以一个动作把它放下来。我想尽量避免移动，从一边移动到另一边。最后，我将用另一条胶带将其固定到板的底部。现在终于，细胞可以在 4 度下孵育过夜，这就是免疫化学第一天的结束。这是免疫化学的第二天，我将在 PB S3 中清洗盖玻片 5 分钟。然后，我将在室温下在二抗中孵育两个小时。首先，我要像这样剪下封口膜，这样我就可以取下盖玻片了。我将慢慢提起 para film 的顶部，使盖玻片保持在 care para film 的底部。因此，我取出了第一块，并准备好了装有 PBS 洗涤液的板。因此，我将提起每个覆盖汤并将其放入孔中，以洗掉任何未附着到表位上的任何剩余一抗。所以要提起盖玻片，我首先要用剃须刀片像那样握住它，然后轻轻地尝试把它拿起来。既然细胞是，我们面对的是抗体溶液，我要把它们翻转过来，让它们现在在上面，然后把它放到孔里，这样它仍然留在上面。我将对剩余的 power slip 重复该过程。所以它们要洗五分钟。所以已经过去了五分钟。我要更换 PBS 溶液。我要添加钩子模具。现在我要孵化它 5 分钟。所以 hooks 的孵化已经完成，现在我准备好挂载 cover sos and，看看它们。所以首先我要用 alk quad vector shield，它有助于防止荧光硬币漂白。我要，嗯，首先我要用 和盖玻片的编号标记载玻片，然后我要放置 10 μL 的矢量盾牌。Vector shield 是一种油，它真的很粘稠，所以，等待一会儿，直到它全部进入尖端也很重要。因此，我在显微镜载玻片上放置了矢量保护罩，现在我已准备好将盖玻片放在显微镜载玻片上。所以我首先要做的是拿起一张盖玻片，然后用去离子水冲洗盖玻片的背面，因为如果我不这样做，当它变干时，PBS 中的盐会结晶，并会干扰荧光芯片的光学特性。所以我要去，我准备好了我的去离子水。因此，我要拿起盖玻片，用去离子水冲洗它的背面。然后我要用锡擦干它。然后我要再次倒置它，使细胞侧倒置并下降到显微镜载玻片上。就像以前一样，我将触摸 vector shield 的液滴并慢慢降低它，而不会捕获任何气泡。我将对所有的货物翻转重复相同的过程。现在让我们来看看。这是您在进行免疫化学并获取图片并制作叠加层等后可能得到的一个例子。所以在这张图片中，这是一张从出生后小鼠的 dent gys 中分离出的海马神经干细胞的图像。今天，我向您展示了如何对人类神经前体细胞进行免疫化学。如果您注意到，这种技术可以让您节省大量的抗体试剂。我们使用了非常少量的一抗和二抗，方法是将一小滴液滴到 perfil 上，并将细胞倒置在盖玻片上。所以继续做免疫治疗化学，感谢你们收看我。

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