免疫组化:人类神经干细胞

大家好，我是 Steve。我在加州大学尔湾分校病理学系的 Flanagan 博士的实验室工作。今天，我将向您展示如何对人类神经前体细胞进行免疫化学。

该方案包括将细胞放在铺设涂层的盖玻片上，封闭细胞并在一抗中孵育过夜，然后进行几次 WAS 并在室温下放置二抗。最后，将盖玻片安装到显微镜支架上。让我们开始吧。

因此，首先，我将三个 12 毫米宽的无菌德国玻璃盖玻片放入 24 孔板中，以便用层压板涂覆它们。现在我把盖玻片放在板里，首先我要加入 PDL 聚赖氨酸溶液，我要在室温下将盖上盖的潜膜在 PDL 中孵育 5 分钟。所以现在，在 5 分钟结束时，我将去除 PDL 并涂上层粘连蛋白，并将盖玻片在层压板中孵育至少 4 小时或更长时间过夜。

因此，我将板在层压板中孵育过夜，现在我将用 PBS 冲洗盖玻片，并将我已经计数的人神经前体细胞铺板。所以我刚刚去除了层压溶液，现在我要用 PBS 控制盖玻片。所以现在我要去除 PBS 并涂上培养基溶液。

最后，我已准备好查看单元格。因此，我将以每研磨 10 万个细胞的速度查看细胞，这意味着对于一个 24 孔板，我将在每孔中加入 50， 000 个细胞，因为每个孔含有半毫升。因此，我将将板从一侧倾斜到另一侧，以确保细胞均匀分布在盖玻片的表面上。

现在我要把它们放在培养箱中至少 24 小时，让它们安定下来并展开进行免疫化学。所以细胞已经生长了 24 小时，我观察了它们，它们被附着并很好地分布开来。所以现在我要用 4% 的高度固定它们 5 分钟。

但首先我要去除培养基，我不想让细胞变干。因此，我将去除培养基并同时添加固定剂。所以它被称为双手技术。

所以现在我要在室温下将细胞在固定剂中孵育 5 分钟。所以已经过去了五分钟。我将去除 PFA 并将其放入 PFA 废液容器中，并在去除 PFA 的同时加入 PBS，这样细胞就不会变干。

因此，我将使用其中一个塑料吸取移液器来拉起 PFA，并将计时器设置为 5 分钟。因此，当我的细胞在 PBS 洗涤中时，我将使用 Triton X 100 准备渗透可视化解决方案。它是一种非离子洗涤剂，非常非常粘稠。

因此，重要的是要等到所有溶液都进入并进入移液器。因此，我将制备 0.3% 的 PBS 溶液，我将添加 10 密耳的 PBS。在这 10 密耳的 PBS 中，我将在接下来的 100 毫升中加入 30 微升的 tri。

因此，我将添加 30 微升 tri，然后加入 100 到 10 密耳的 PBS。因此，我将增加大约 10 秒的时间，让所有溶液都进入尖端。所以我，我这里有我的渗透利用解决方案。

我把它放在旋转器上 10 分钟，然后涡旋以确保粘稠的 tritton 完全溶解。现在，我已准备好执行渗透可视化步骤。所以我要在室温下静置 5 分钟。

所以已经过去了五分钟。我现在要进行三次 5 分钟的 PBS 洗涤，以确保洗掉所有的海氚。所以，我再次将时钟设置为 5 分钟。

所以我，我刚刚完成了所有的洗涤步骤，所以我准备好进行阻塞步骤。因此，对于封闭步骤，我在 PBS 中准备了 5% BSA 溶液。就像所有洗涤一样，我将去除 PBS 并同时添加封闭溶液。

封闭步骤将在室温下进行 1 小时。因此，当我的细胞处于封闭状态时，我将准备用于一抗孵育的板。所以我要从这个玻璃板开始，然后我要剪一块，一块差不多大小的封口膜。

我要做的是把它包起来，我需要一些胶带，所以我需要四块胶带。所以我只是要把它们都准备好。所以我要拿这张封段膜，把它拉直，这样表面就好又光滑。

然后，我将把每一端都用胶带粘在玻璃板的背面。所以现在我要拉动另一端以确保表面平直，然后我要用胶带将另一端粘在后面。所以现在我需要另一张与第一张相同尺寸的对膜。

基本上我也会做同样的事情。所以我在第一片上面贴了第二片封口膜，就像第一片一样，只是我把第二片 perfil 的一端松散了，因为我要放置抗体溶液，然后在第一片上放上粉末。然后我要把第二块放在上面，做一个三明治。

但现在，我要标记要放置抗体溶液和覆盖物的地方。所以，细胞已经在封闭液中放置了一个小时，我现在要把盖玻片放在一抗液滴上过夜孵育。因此，我将滴入一滴 35 μL 的一抗，并且要非常小心，不要排出所有液体，因为这可能会产生气泡，而气泡可能会干扰抗体与抗原的结合。

所以我想尽量避免液滴中出现气泡，所有三滴一抗，我准备在这些液滴上盖上细胞盖玻片。所以我现在要做的是拿起一张封面单。因此，首先我将盖玻片移到一边，并尝试在镊子打开的情况下轻轻提起它。

一旦我觉得我已经抓住了盖玻片，我就要关闭以慢慢关闭镊子，然后轻轻地将盖玻片从井中提起。所以现在的单元格在盖玻片的顶部。所以我要做的是倒置，轻轻触摸液滴，然后慢慢地将其放在液滴上，不产生任何气泡。

因此，我将对第二个和第三个盖玻片重复相同的过程。最后一步是将第二块 para film 放在上面。我要做的是，我要像那样以一个动作把它放下来。

我想尽量避免移动，从一边移动到另一边。最后，我将用另一条胶带将其固定到板的底部。现在终于，细胞可以在 4 度下孵育过夜，这就是免疫化学第一天的结束。

这是免疫化学的第二天，我将在 PB S3 中清洗盖玻片 5 分钟。然后，我将在室温下在二抗中孵育两个小时。首先，我要像这样剪下封口膜，这样我就可以取下盖玻片了。

我将慢慢提起 para film 的顶部，使盖玻片保持在 care para film 的底部。因此，我取出了第一块，并准备好了装有 PBS 洗涤液的板。因此，我将提起每个覆盖汤并将其放入孔中，以洗掉任何未附着到表位上的任何剩余一抗。

所以要提起盖玻片，我首先要用剃须刀片像那样握住它，然后轻轻地尝试把它拿起来。既然细胞是，我们面对的是抗体溶液，我要把它们翻转过来，让它们现在在上面，然后把它放到孔里，这样它仍然留在上面。我将对剩余的 power slip 重复该过程。

所以它们要洗五分钟。所以已经过去了五分钟。我要更换 PBS 溶液。

我要添加钩子模具。现在我要孵化它 5 分钟。所以 hooks 的孵化已经完成，现在我准备好挂载 cover sos and，看看它们。

所以首先我要用 alk quad vector shield，它有助于防止荧光硬币漂白。我要，嗯，首先我要用 和盖玻片的编号标记载玻片，然后我要放置 10 μL 的矢量盾牌。Vector shield 是一种油，它真的很粘稠，所以，等待一会儿，直到它全部进入尖端也很重要。

因此，我在显微镜载玻片上放置了矢量保护罩，现在我已准备好将盖玻片放在显微镜载玻片上。所以我首先要做的是拿起一张盖玻片，然后用去离子水冲洗盖玻片的背面，因为如果我不这样做，当它变干时，PBS 中的盐会结晶，并会干扰荧光芯片的光学特性。所以我要去，我准备好了我的去离子水。

因此，我要拿起盖玻片，用去离子水冲洗它的背面。然后我要用锡擦干它。然后我要再次倒置它，使细胞侧倒置并下降到显微镜载玻片上。

就像以前一样，我将触摸 vector shield 的液滴并慢慢降低它，而不会捕获任何气泡。我将对所有的货物翻转重复相同的过程。现在让我们来看看。

这是您在进行免疫化学并获取图片并制作叠加层等后可能得到的一个例子。所以在这张图片中，这是一张从出生后小鼠的 dent gys 中分离出的海马神经干细胞的图像。今天，我向您展示了如何对人类神经前体细胞进行免疫化学。

如果您注意到，这种技术可以让您节省大量的抗体试剂。我们使用了非常少量的一抗和二抗，方法是将一小滴液滴到 perfil 上，并将细胞倒置在盖玻片上。所以继续做免疫治疗化学，感谢你们收看我。