Name: 一个β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的基细胞死亡含量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 了解利用GUS报告基因系统分析基因诱导细胞死亡的快速植物瞬时检测方法。该方法通过农杆菌介导转化本氏烟草叶片，结合组织化学染色和荧光定量测定，为植物基因功能研究提供灵敏可靠的技术手段。

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Nicotiana benthamiana 植物在25°C的温控培养室中生长。使用3至6周龄植株的完全展开的健康叶片。
提示：使用新长出的叶片可获得更好的结果
1. 农杆菌瞬时侵染实验方案：
第1天
<ol>
 <li>用含有目的基因（用于检测细胞死亡）的载体以及含有组成型启动子驱动的GUS表达盒的载体，对含有利福平（25 μg/ml）和卡那霉素（100 μg/ml）的LB琼脂平板进行农杆菌（Agrobacterium tumefaciens，菌株LBA4404）甘油菌划线接种。务必设置空载体作为阴性对照。</li>
 <li>在28°C下培养2天。</li> 
</ol>
第3天
<ol>
 <li>从先前划线接种的 LB/利福平/卡那霉素平板上，挑取单菌落，接种于 2 ml 含利福平（25 μg/ml）和卡那霉素（100 μg/ml）的 LB 培养基中。</li>
 <li>将每种培养物在 28°C、200 rpm 条件下振荡培养 24 小时，直至达到最大生长密度。</li>
</ol>
提示：有时会观察到结块现象，此时在继续操作前需将培养物充分重悬（例如通过反复吹打）。
第4天
<ol>
<li>孵育结束后，加入新鲜的LB培养基（含有适当的抗生素）和乙酰丁香酮，将总体积调至10 mL（乙酰丁香酮终浓度为25 μM）。</li>
<li>将每种培养物在28 °C下振荡培养16小时。</li>
</ol>
第5天
<ol>
 <li>次日，用10 ml浸润培养基（10 mM MgSO4·7H2O，9 mM MES，pH 5.6）洗涤每种菌液两次（不要添加乙酰丁香酮），每次洗涤后在室温下以4000 × g离心10分钟。</li>
 <li>最后一次离心后，将每种菌液重悬于5 ml含有乙酰丁香酮（100 μM）的浸润培养基中。</li>
 <li>测定OD600nm，OD值在0.1至0.9之间均可接受。 提示：OD600nm低至0.1时也可正常使用，但较高的OD值可能产生更一致的结果。</li>
 <li>将菌液继续孵育3小时，以准备用于感染的农杆菌菌液。</li>
 <li>将含有待分析基因的菌液与阴性对照（含空载体的农杆菌）按1:1比例与含有GUS报告基因盒的菌液混合。</li>
 <li>使用1 ml无针头注射器浸润植物新生叶片的远轴面（下表面）（图1）。 
 提示：在同一植株的不同叶片上分别浸润阴性对照混合液（空载体 + GUS报告基因盒）和待检测基因的混合液（基因x + GUS报告基因盒）。每种处理使用三株重复植株。
 </li>
 <li>浸润后3天，切除浸润过的叶片，检测GUS蛋白的表达。</li>
</ol>
2. 组织化学GUS检测
第8天
<ol>
<li>将X-gluc底物培养基真空浸润至切除的叶片中。</li>
<li>在室温下避光孵育过夜，或直至出现明显的蓝色染色。</li>
</ol>
第9天
<ol>
 <li>用蒸馏水冲洗。</li>
 <li>在70%乙醇中孵育，直至叶绿素被去除，然后再次转移至蒸馏水中。通过肉眼评估GUS表达水平。</li>
</ol>
3. 荧光MUG检测法：
第8天
<ol>
 <li>使用液氮在研钵中研磨浸润的叶片圆片，以分离总蛋白。在保持样品处于冰上的同时，加入100 μL GUS提取缓冲液（50 mM NaPi pH 7.0，10 mM EDTA，0.1% Triton X-100，0.1% N-月桂酰肌氨酸钠盐，β-巯基乙醇（0.7 μL/mL））。</li>
 <li>在4 °C下以14,000 g离心悬浮液5分钟，并取上清液作为总可溶性蛋白。</li>
 <li>根据制造商说明书，使用NanoDrop测定蛋白浓度。</li>
 <li>使用GUS提取缓冲液将每个样品的蛋白浓度调整至100 μg总可溶性蛋白。</li>
 <li>加入用GUS提取缓冲液配制的MUG底物（4-甲基伞形基-β-D-葡萄糖醛酸三水合物），使其终浓度为2 mM。每个样品的总体积（蛋白 + MUG底物）达到100 μL即可。</li>
 <li>在37 °C下孵育反应1小时。</li>
 <li>通过加入800 μL GUS终止缓冲液（0.2 M Na2CO3）终止反应。</li>
 <li>使用酶标仪在激发波长365 nm、发射波长455 nm条件下测定荧光强度，并将测定值与MU标准曲线进行比较。GUS活性以nmol MU / μg总可溶性蛋白 / min表示。</li>
</ol>
4. 储备液与溶液：
<ol>
<li>乙酰丁香酮（1 M）储备液 (FW = 196.2 g) – 将 0.981 g 溶于 5 mL DMSO 中</li>
<li>卡那霉素（100 mg/mL）储备液 – 溶于 dH2O 中配制 – 过滤除菌</li>
<li>利福平（25 mg/mL）储备液 – 溶于 DMSO 中配制</li>
<li>LB 液体培养基（1 L）： 
1 %（w/v）胰蛋白胨，10 g 
0.5 %（w/v）酵母提取物，5 g 
170 mM 氯化钠，10 g 
pH – 7
</li>
<li>乙酰丁香酮（25 μM）= 1 mL 最终体积中加入 25 μL 的 1 M 储备液</li>
<li>侵染缓冲液（1 L）： 
10 mM MgSO4·7H2O (FW = 246.48 g)，2.4648 g 
9 mM MES (FW = 213.25 g)，1.91925 g 
pH – 5.6</li>
<li>乙酰丁香酮（100 μM）= 1 mL 最终体积中加入 100 μL 的 1 M 储备液</li>
<li>GUS 提取缓冲液 
50 mM NaPi pH 7.0，10 mM EDTA，0.1 % Triton X-100，0.1 % N-月桂酰肌氨酸钠，β-巯基乙醇（0.7 μL/mL）</li>
<li>2× 磷酸缓冲液 
0.2 M NaH2PO4 和 0.2 M Na2HPO4，pH 7</li>
<li>X-Gluc 底物溶液 
将 1 mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖苷酸（X-Gluc）溶于 0.1 mL 甲醇中。加入 1 mL 2× 磷酸缓冲液、20 μL 0.1 M 铁氰化钾、10 μL 10 % Triton X-100 和 850 μL 蒸馏水。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
按照本方案，当细胞死亡发生时，预期会出现GUS表达的丧失。我们已同时表达了报告基因β-葡萄糖醛酸酶（GUS）与一种细胞保护性蛋白成员 拟南芥 Bcl-2 相关死亡促进因子（BAG）家族。我们进行了共浸润 N. benthamiana 使用由35S启动子驱动的BAG表达盒和GUS载体pCAMBIA 2301的叶片 农杆菌 菌株LBA4404。如图2所示，经此侵染后GUS染色明显增强。相反，当使用Bcl-2家族中已知的促凋亡成员BAX时，GUS染色显著减弱（图2）。在这两种情况下，GUS表达均明显不同于对照组。然而，当表达差异较不明显时，可进行荧光定量MUG检测以精确测定GUS表达水平。
<img src="/files/ftp_upload/2680/2680fig1.jpg" alt="植物注射实验；注射器和幼苗，土壤养分吸收，植物学研究方法。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 使用1 ml无针头注射器对N. benthamiana叶片的远轴面进行Agrobacterium菌液渗透的示例。
<img src="/files/ftp_upload/2680/2680fig2.jpg" alt="使用空载体、抗死亡和促死亡载体进行基因表达时叶片组织的GUS染色结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 在N. benthamiana叶片中，GUS载体与抗死亡基因及已知的细胞死亡诱导因子共同表达。将GUS表达水平与空载体对照组（GUS对照）进行比较。

<ol><li>Jefferson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUS+fusions%3A+%2C+%CE%B2-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).</li>
<li>Nishihara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+%CE%B2-Glucuronidase+Gene+in+Pollen+of+Lily+%28Lilium+longiflorum%29%2C+Tobacco+%28Nicotiana+tabacum%29%2C+Nicotiana+rustica%2C+and+Peony+%28Paeonia+lactiflora%29+by+Particle+Bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment.</a> Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).</li>
<li>Hodal, L. Plant Science. 87, 115-115 (1992).</li>
<li>Kabbage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BAG+proteins%3A+a+ubiquitous+family+of+chaperone+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci.+%22%5BJournal%5D)">The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators.</a> Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).</li>
<li>Kang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtBAG6%2C+a+novel+calmodulin-binding+protein%2C+induces+programmed+cell+death+in+yeast+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants.</a> Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).</li>
<li>Yan, J. Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).</li>
<li>Takayama, S., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperone+targeting+and+regulation+by+BAG+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins.</a> Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).</li>
<li>Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+analysis+of+BAG-1%3A+a+novel+Bcl-2-binding+protein+with+anti-cell+death+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity.</a> Cell. 80 (2), 279-279 (1995).</li>
<li>Vitha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+%CE%B2-glucuronidase+assay+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants.</a> Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).</li>
<li>Otha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+Expression+in+Tobacco+of+a+%CE%B2-Glucuronidase+%28GUS%29+Reporter+Gene+Containing+an+Intron+Within+the+Coding+Sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence.</a> Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

在植物中使用哺乳动物系统中常见的细胞死亡检测技术往往较为困难。结合GUS报告系统，我们提出了一种基于植物的、灵敏的细胞死亡相关因子检测与分析方法。该方法利用了一个简单的原理：只有活细胞才能进行GUS表达。为了确保结果的可靠性和可重复性，携带GUS表达盒和待测基因的菌液必须以相等比例共注射。在比较其他潜在的细胞死亡相关因子时，也应保持这一比例。如上所示，我们在实验室中已成功应用该方法研究了多个基因的潜在致死功能。由于该方法操作简便，我们相信其可常规用于检测细胞死亡调控因子。此外，该方法还可调整以适应在单一体系中同时共表达多个基因。在某些情况下，特定基因的细胞死亡功能依赖于其他程序性细胞死亡效应因子对其的激活或抑制，因此可在含有GUS表达盒的单一体系中共同表达多个基因，以探究此类可能性。

<table><tbody><tr><td>利福平</td><td>VWR international</td><td>IC19549001</td><td>25mg/mL DMSO 储液</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;-羟基-3&amp;rsquo;,5&amp;rsquo;-二甲氧基苯乙酮（乙酰丁香酮）</td><td>VWR international</td><td>TCD2666</td><td>DMSO 中 0.981 g/mL（1M 储液）</td></tr><tr><td>2-(4-吗啉基)乙磺酸一水合物（MES）</td><td>VWR international</td><td>EM-6110</td><td>水中 1.92 g/L，用于配制 1 L 浸润培养基</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td>水中 10g/L，用于配制 1 L LB 培养基</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>VWR international</td><td>EM1.03753.0500</td><td>水中 5g/L，用于配制 1 L LB 培养基</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>VWR international</td><td>EM-7710</td><td>水中 10g/L，用于配制 1 L LB 培养基</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠一水合物</td><td>VWR international</td><td>MK-7868-12</td><td>水中 2.5g/L，用于配制 50mM NaPi 缓冲液</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠七水合物</td><td>VWR international</td><td>EMD-SX0715-1</td><td>水中 5g/L，用于配制 50mM NaPi 缓冲液</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>VWR international</td><td>EM-MX0070-1</td><td>水中 2.5 g/L，用于配制 1 L 浸润培养基</td></tr><tr><td>N-月桂酰肌氨酸</td><td>VWR international</td><td>TCL0151-500G</td><td>GUS 缓冲液中 0.1% v/v</td></tr><tr><td>5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸环己胺盐（X-gluc）</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G1281C</td><td>甲醇（100%）中 1mg/100μL</td></tr><tr><td>4-甲基伞形基-&amp;mu;-D-葡萄糖醛酸水合物（MUG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5664</td><td>GUS 提取缓冲液 100 μL 中含 2 mM</td></tr><tr><td>三水合亚铁氰化钾</td><td>VWR international</td><td>EM-PX1460-1</td><td>X-gluc 底物溶液用 100mM 储液</td></tr><tr><td>&amp;#946;-甲基伞形酮（MU）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1381</td><td>MU 标准曲线使用 GUS 提取缓冲液</td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>VWR international</td><td>EM-SX0395-11</td><td>水中 0.2 M，用于配制 GUS 终止缓冲液</td></tr></tbody></table>

基于β-葡萄糖醛酸酶（gus）的细胞死亡检测方法

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

我们开发了一种新型的瞬时植物表达系统，可同时表达报告基因β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）以及细胞死亡的潜在正向或负向调控因子。在该系统中， N. benthamiana 叶片通过共浸润法同时转入含有待分析基因的35S启动子驱动表达盒以及GUS载体pCAMBIA 2301 农杆菌 以菌株LBA4404作为载体。由于GUS表达需要活细胞才能发生，因此当该报告基因与促细胞死亡的正向调控因子共表达时，GUS活性会降低。同样，与空载体对照相比，当共表达抗凋亡基因时，GUS活性会增强。如下所示，我们在实验室中已成功利用该系统分析了促死亡和抗死亡因子，包括植物抗凋亡Bcl-2相关athano基因（BAG）家族成员，以及已知的哺乳动物细胞死亡诱导因子如BAX。此外，我们还利用该系统分析了特定蛋白截短片段的死亡功能，这可能为这些蛋白的潜在翻译后修饰或激活机制提供线索。本文介绍了一种快速且灵敏的基于植物的实验方法，可作为研究特定基因死亡功能的初步手段。

在哺乳动物系统中常用的程序性细胞死亡检测方法，如DNA梯状条带分析或TUNEL检测，通常在植物中难以重复。结合GUS报告系统，我们提出一种快速的基于植物的瞬时检测方法，用于分析特定基因潜在的致死特性。

基于β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的细胞死亡检测方法

我们开发了一种新型的瞬时植物表达系统，可同时表达报告基因β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）与假定的……

本实验的总体目标是利用 Gus 报告系统分析特定基因潜在的致死特性。将目标基因克隆至 Gus 表达盒中，并在 35S 启动子驱动下，通过相应的农杆菌载体在农杆菌菌株 LBA4404 中进行培养。随后，将这些载体与含有 Gus 表达盒的菌液混合，共同侵染尼克氏烟草（Nicotiana occidentalis）叶片。可通过组织化学染色目视评估 Gus 活性，或通过荧光定量 mug 测定进行定量分析。与现有方法（如 DNA 梯状电泳或 TUNEL 测定）相比，该技术的主要优势在于，后者常用于哺乳动物系统，但在植物中难以重复；而本方法是一种灵敏、快速的基于植物的瞬时测定方法，其原理基于一个简单的事实：细胞存活是 Gus 表达发生的必要条件。今天演示该实验操作的是 Hua RAOs。我们实验室的一名博士后研究助理指出，该侵染实验需要使用在25摄氏度下培养的三至六周龄烟草本氏烟（Nicotiana benthamiana）植株上充分展开的健康叶片。本实验计划在八天内完成。第一天，将含有细胞死亡检测载体的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）甘油菌株以及含有Gus表达盒的载体菌株划线接种；当同时测试多个培养组合时，还需始终包含一个空载体作为阴性对照或填充对照。将平板在28摄氏度下孵育两天。第三天，从每块平板上挑取单菌落接种至2毫升选择性LB培养基中。将每种培养物在28摄氏度、200转/分钟的振荡条件下孵育24小时，直至达到最大生长密度。孵育24小时后，若出现菌体聚集，用移液器将培养物彻底重悬，并加入新鲜的选择性LB培养基，使每份培养物的总体积增至10毫升，以诱导农杆菌毒力基因的表达。加入丙酮至终浓度为25微摩尔，并在28摄氏度下振荡培养每份菌液16小时。下一步是将每份菌液在室温下以4,000 ×g离心10分钟，然后将沉淀重悬于10毫升浸润介质中。不要添加丙酮，再次离心菌液，但此次用重悬缓冲液将每个沉淀重悬于5毫升含有100微摩尔丙酮的侵染培养基中。现在测量600纳米处的OD值。浓度低至 0.1 是可接受的，但如果高于 0.9，则在浸润前用浸润介质和丙酮稀释至 0.9。在培养后，再次于 28 °C 条件下振荡培养三小时。将实验培养物与对照培养物按 1:1 比例与含有 Gus 盒的培养物混合。对于每种培养物，使用一支1毫升无针注射器将ABA溶液注入密封处或新长出叶片的背面。渗透体积无需精确控制。当出现水浸状区域时，表明注入量已足够，此时在同一植株的相对两侧叶片上分别注入阴性对照和待检测基因，然后以相同方式再对另外两株植物进行渗透。因此，每种培养条件对应三株植物。侵染后三天，即可采集叶片并检测GUS蛋白的表达。开始组织化学分析时，用X-Gluc底物对整片叶片进行真空浸润，直至叶片完全浸透。现在，将叶片在室温下避光孵育过夜，或直至出现明显的蓝色染色。用蒸馏水冲洗叶片，然后将其置于70%乙醇中孵育过夜，直至叶绿素完全去除。第二天，用蒸馏水冲洗叶片，并检测GUS表达水平。为了定量Gus表达，将底物mug转化为荧光产物mu，可通过以下步骤进行测定：首先在研钵中用液氮研磨浸润的叶片圆片。然后在保持样品处于冰上的条件下加入100 µL GUS提取缓冲液。接着在4°C下以14,000 ×g离心5分钟，收集含有总可溶性蛋白（包括Gus）的上清液。使用NanoDrop测定总可溶性蛋白浓度，并用Gus提取缓冲液将每个样品的浓度调整至100微克总蛋白。然后，向每个样品中加入Gus提取缓冲液配制的mug底物，使终浓度为2毫摩尔mug。每个样品总体积为100微升，用移液器混匀后，在37摄氏度孵育反应1小时。反应1小时后，加入800 µL GUS终止缓冲液以终止反应。为进行定量，将每份样品各100 µL加入微孔板中，在酶标仪中检测荧光，激发波长为365 nm，发射波长为455 nm，所得结果与标准曲线比较，GUS活性可表示为每分钟每微克总可溶性蛋白所对应的µmol产物量。根据所使用的构建体不同，可检测到不同的GUS表达水平；当GUS表达盒与细胞死亡负调控因子或抗凋亡基因共浸润时，GUS活性水平会发生相应变化。相比之下，观察到较高的Gus表达水平。空载体对照组中的Gus水平则低得多。相反，当使用细胞死亡的正向调控因子或促死亡基因时，与空载体对照组相比，Gus表达显著降低。一旦掌握，该技术可在大约一周内完成。在实施该操作时，需牢记此技术仅作为初步步骤，用于评估特定基因的潜在功能。后续还需开展进一步工作，以验证这些初步结果，并确定所涉及细胞的类型。

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