Name: 高分辨率三维成像 EX - VIVO生物样品显微CT (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学习使用X射线显微CT对矿化和非矿化组织进行高分辨率三维成像。该方法可无损获取小鼠股骨和大鼠肺部的三维结构，为神经科学和发育生物学研究提供重要工具。

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研究在以色列魏茨曼科学研究所的欧文和切尔纳·莫斯科维茨纳米与生物纳米成像中心进行。
我们感谢 Orna Yeger 在设计和实施本实验方案过程中提供的帮助。

1. 样品制备
<ol>
<li>取出待检测组织后，可将矿化组织置于仪器中进行成像。对小鼠股骨进行成像时，应遵循以下步骤：<ol>
			<li>从妊娠18.5天（E18.5）的C57/Bl6胚胎中取下死后腿部组织。</li>
			<li>使用环氧树脂或其他胶水密封聚苯乙烯移液器吸头（20–200 μl）的窄端，并将工作缓冲液（PBS或其他）填充至吸头中。</li>
			<li>将腿部组织紧密地插入吸头中，并用Parafilm封膜密封另一端。</li>
			<li>将移液器吸头放入合适的支架中，并按照第3章的方案进行操作。为观察小鼠胚胎腿部的股骨，仪器设置为40 kV和200 μA。为实现8 μm分辨率，需采集1000张投影图像，放大倍数为4倍。</li></ol></li>
		<li>非矿化组织需先进行固定和染色处理，以增强目标组织的X射线衰减能力，具体可采用多种现有方案之一8,9。对于大鼠肺组织及类似样本，其制备方案如下：<ol>
		<li>将非小细胞肺癌（NSCLC）NCI-H460细胞原位植入裸鼠肺部</li>
		<li>植入后约4周可检测到肺部癌结节</li>
		<li>处死大鼠，并立即用含肝素的生理盐水灌注</li>
		<li>通过左心室注射稀释的Microfil染料溶液（Flowtech公司产品，2 ml 化合物溶液、3 ml 稀释剂和0.3 ml 固化剂）以标记支气管循环</li>
		<li>取出大鼠的肺和心脏组织</li>
		<li>将样本固定（参见方案第2章），通过将其紧密插入50 ml塑料离心管中实现固定</li>
		<li>在管底放置浸有乙醇的纱布，以形成饱和乙醇气氛</li>
		<li>将离心管用胶水固定或旋紧在仪器的支架上</li>
		<li>继续设置成像参数（第3章）。为完整成像大鼠肺组织，X射线源设置为40 kV和100 μA。为达到16 μm分辨率，需在0.5倍放大条件下采集2500张投影图像。</li></ol></li> 
</ol>
2. 样品固定
在高分辨率下，测量过程中必须避免样品位置发生任何变化。为此，需将样品牢固地固定在与其尺寸匹配的塑料容器中。可使用聚苯乙烯移液器吸头、塑料巴斯德吸管或专门制作的塑料支架来实现固定。根据实验要求，样品可在空气中、乙醇或缓冲溶液中进行观察。图1展示了小鼠胚胎腿部在仪器中的典型固定方式及最终定位。
<img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig1.jpg" alt="用于吸收测量的比色皿光学光谱装置；实验室实验设备。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 胚胎小鼠后肢在微计算机断层扫描仪中的最终放置位置。
3. 设置采集参数：X射线电压和电流、CCD曝光时间
<ol>
<li>将样品放入样品 holder 中，然后置于仪器的旋转台上</li>
<li>以任意设定的电压和电流拍摄第一张 X 射线图像</li>
<li>如果图像过暗，应首先增加光子数量，即略微提高电流；如果仍不足，则应略微提高 X 射线光子的能量，即提高 X 射线管的电压</li>
<li>如果图像过亮，应首先降低电压，然后降低电流</li>
<li>可通过像素合并（binning）提高图像亮度。Binning 为 1 时，图像中每个像素的强度被单独记录；而 binning 为 2 时，则将每个 2×2 像素矩阵的强度求和。此时图像亮度约为 binning 1 时的 4 倍，但分辨率仅为原来的一半</li>
<li>在设定最佳亮度后，需优化相机的曝光时间，以在获得最佳对比度与控制实验合理时长之间取得平衡</li>
<li>可通过使用滤光片改善图像对比度，特别是对低吸收样品而言；滤光片可减少光子通量，尤其是低能量光子的通量</li>
</ol>
4. 样品放置
<ol>
<li>选择工作放大倍数。可选的放大倍数为 0.5x、4x、10x、20x 和 40x。随着放大倍数的增加，视场范围会减小。</li>
<li>通过调节X射线源与样品之间以及样品与探测器之间的距离，获得最佳分辨率和视场范围。增大源到样品的距离会减小视场范围并提高分辨率；而增大样品到探测器的距离则具有相反的效果。</li>
</ol>
在所有角度下，投影图像中均应包含需要以三维形式观察的整个区域。应通过在不同角度下旋转样品，并将样品尽可能靠近旋转轴来检查这一点。具体操作步骤如下：
<ol start="3">
<li>在 0 度位置拍摄图像，然后将样品旋转至 -20 度。如果目标体积发生横向偏移，则应通过重新调整旋转轴的位置来校正。</li>
<li>校正后，将样品旋转至另一角度并再次校正位置，重复此过程，直至在 -90 至 90 度的所有角度下，感兴趣区域均位于图像范围内。</li>
</ol>
5. 高分辨率断层图像
<ol>
<li>测量过程中，样品每次旋转一个小角度，每个角度采集一幅投影图像。图像总数需在期望的分辨率与测量时间及文件大小之间进行权衡。如图2所示，每幅投影图像均包含样品中所有切片相互叠加的信息，因此无法揭示样品的三维结构。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig2.jpg" alt="三张圆形显微图像，显示材料研究中用于对比分析的表面细节。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2。大鼠肺部在旋转角度为 0°（A）、45°（B）和 90°（C）时的投影图像。
<ol start="2">
<li>只有在获取至少 -90 至 90 度范围内的投影图像后，才能进行样品体积的重建。重建过程耗时在 10 分钟到 2 小时之间，具体取决于所使用的软件和投影数量。同样，三维图像的最终质量是在期望的分辨率、所需花费的时间以及最终文件大小之间权衡的结果。</li>
</ol>
6. 图像尺度校准
重建图像中的像素级别（值）对该图像而言是唯一的。为了比较两幅不同的图像，必须为每幅图像施加一个唯一的强度标度。
<ol>
<li>使用与样品相同的实验条件，对标准模体进行一次断层扫描</li>
<li>利用模体获得的数值重新校准样品图像。最常用的尺度是亨氏（或CT）尺度。对于4倍放大倍率，将背景值15,000（对应水或PBS）替换为0，将骨组织的最大值35,000替换为标准的亨氏值3000。其他像素值根据上述界限通过线性插值或外推获得。</li>
</ol>
7. 图像处理与分析
获得高分辨率图像后，必须使用图像分析软件提取相关信息。所使用的软件包必须能够处理非常大的文件（最大可达 20Gb）。
8. 典型结果
图3显示了一只C57/Bl6小鼠在胚胎发育第18.5天（E18.5）时股骨的图像，此时距矿化过程启动已过去四天。矿化层清晰可见（呈白色），而在此制备样本中软组织不可见。我们共采集了1000张投影图像，线性放大倍数为4倍，最终分辨率为8微米。对图1所示的体渲染图像进行仔细分析后显示，骨体积分数（矿化组织所占骨体积的比例）为0.18，骨矿密度为723 mg/cm3。这些数值使我们能够将该结构与其他发育阶段的骨骼进行比较。
<img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig3.jpg" alt="骨微结构分析、成像；通过横截面研究骨密度和形态的示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 小鼠胚胎股骨三维图像的不同表现形式。图中显示了横断面（横截面）（A）、矢状面（内侧-外侧）切面（B）以及体积渲染的截图（C）。
图4显示了一只12周龄雌性裸鼠（RNU）的肺部三维图像，该小鼠通过原位移植了非小细胞肺癌（NSCLC）NCI-H460细胞。共采集了2500张投影图像，线性放大倍数为0.5倍，最终分辨率达到16微米。图像中可见Microfil染色的血管结构（可分辨至20微米直径）。图像分析显示，移植后4周形成了多个癌性结节，占据肺部总体积的显著比例（17%）。大部分肺部染色信号位于肿瘤的外周区域。值得注意的是，如图4B所示，多个血管也存在于结节内部，根据初步分析，其体积约占结节总体积的3%。
<img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig4.jpg" alt="胸部结构的CT扫描图像，标注以突出解剖特征；医学影像分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 大鼠肺部生长的癌结节的三维图像。展示了容积渲染的快照（A）和通过该容积的切面（B）。癌结节以箭头标示。
视频 1. 图 1 中小鼠股骨的容积渲染。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2688/2688movie1.mpg">点击此处观看视频。</a>
视频 2. 图 2 中大鼠肺部的容积渲染。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2688/2688movie2.mpg">点击此处观看视频。</a>
视频 3. 肺部连续切片。结节在大多数切片中表现为灰色区域。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2688/2688movie3.mpeg">点击此处观看视频</a>

<ol><li>Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+micro-CT+in+small+animal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Application of micro-CT in small animal imaging.</a> Methods. 50, 2-13 (2010).</li>
<li>Bauer, J. S., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+osteoporosis+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Advances in osteoporosis imaging.</a> Eur J Radiol. 71, 440-449 (2009).</li>
<li>Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Basle, M. F., Audran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+insight+bone+measurements+by+histomorphometry+and+microCT%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT.</a> J Bone Miner Res. 20, 1177-1184 (2005).</li>
<li>Muller, R., Van Campenhout, H., Damme, B. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+human+bone+biopsies%3A+a+quantitative+structural+comparison+of+histological+sections+and+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography.</a> Bone. 23, 59-66 (1998).</li>
<li>Mueller, K., Yagel, R., Wheller, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Aliased+3D+Cone-Beam+Reconstruction+Of+Low-Contrast+Objects+With+Algebraic+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Anti-Aliased 3D Cone-Beam Reconstruction Of Low-Contrast Objects With Algebraic Methods.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 18, 519-537 (1999).</li>
<li>Kachelriess, M., Schaller, S., Kalender, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+single-slice+rebinning+in+cone-beam+spiral+CT%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Advanced single-slice rebinning in cone-beam spiral CT.</a> Med Phys. 27, 754-772 (2000).</li>
<li>Endo, M., Komatsu, S., Kandatsu, S., Yashiro, T., Baba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combination-weighted+Feldkamp-based+reconstruction+algorithm+for+cone-beam+CT%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">A combination-weighted Feldkamp-based reconstruction algorithm for cone-beam CT.</a> Phys. Med. Biol. 51, 3953-3965 (2006).</li>
<li>Marxen, M., Thornton, M. M., Chiarot, C. B., Klement, G., Koprivnikar, J., Sled, J. G., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med Phys. 31, 305-313 (2004).</li>
<li>Plouraboué, F., Cloetens, P., Fonta, C., Steyer, A., Lauwers, F., Marc-Vergnes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+high-resolution+vascular+network+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">X-ray high-resolution vascular network imaging.</a> J Microsc. 215, 139-148 (2004).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

C57/Bl6 小鼠在胚胎发育第18.5天（E18.5）时，已处于矿化过程启动后的第四天。在此发育阶段，未来的骨组织由多层矿化的类骨质构成，如图3所示，结构清晰可见。需要强调的是，矿化组织可使用不同仪器在较低分辨率下进行观察，此类仪器对样品处理的要求较低。本实验方案（以及所用的显微CT仪器）除了提供更高分辨率外，还为用户提供了最大程度的灵活性，以选择最适合测量的几何参数。
图4的结果显示，在原位肺癌动物模型中，人非小细胞肺癌可诱导血管募集和新生血管形成。我们认为，在测量过程中肺组织既未发生移动，其形状也未发生改变。操作者在进行断层扫描时应特别注意避免此类变化。对于某些样品，尤其是较软的组织，必须设计特殊的固定装置，以在测量期间完全固定样品。然而，由于肿瘤周围存在大量造影剂渗漏，导致无法对周围血管进行可靠定量。因此，图像边缘区域受到染色剂污染，这在视频2和视频3中尤为明显。我们无法避免这种溢出，但有关癌结节的有用信息（包括其大小、形状以及内部血管的存在）并未受到影响。我们可以明确得出结论：至少对于本研究中所观察的支气管循环而言，周围血管参与了肿瘤的灌注，且肿瘤内部也存在一定程度的灌注。

<table><tbody><tr><td colspan="4">在图像采集过程中，我们使用了由美国康科德Xradia公司生产的MICRO XCT-400微焦点X射线断层扫描系统。</td></tr><tr><td colspan="4">图像采用ImageJ（NIH，美国）、Avizo（VSG，法国）和MicroView（通用电气，美国）软件包进行处理和分析。也可使用其他任何可用的图像分析软件替代。</td></tr></tbody></table>

ex-vivo 生物样本的显微ct高分辨率三维成像

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

只有通过断层扫描技术才能实现无损体积可视化，其中最有效的方法是X射线显微计算机断层扫描（μCT）。
高分辨率显微计算机断层扫描（μCT）是一种非常灵活且精确的技术（分辨率达1-2微米），可用于离体生物样本的三维检测1, 2。与电子断层扫描相比，μCT可检测厚度达4厘米的样本。该技术仅需数小时的测量时间，而组织学方法则需数周。此外，μCT不依赖于二维体视学模型，因此可作为组织学方法的补充，在某些情况下甚至可取代组织学方法3, 4，后者既耗时又具有破坏性。μCT中的样本处理与定位操作简便，无需高真空或低温环境，从而避免了这些条件可能对结构造成的不利影响。样本被置于微焦点X射线源与探测器之间，进行180°或360°旋转；探测器包含闪烁体和高精度CCD相机。对每个角度采集一幅二维图像，随后利用多种可用算法之一重建整个三维体积5-7。三维分辨率随旋转步长的减小而提高。本视频方案展示了样本制备、固定、定位以及高分辨率成像的主要步骤。

只有通过断层扫描技术才能实现无损的体积可视化，其中最有效的方法是X射线显微计算机断层扫描（CT）。

Ex-Vivo 生物样本的显微CT高分辨率三维成像

只有通过断层扫描技术才能实现无损体积可视化，其中最高效的方法是X射线显微计算机断层扫描……

本实验的总体目标是对矿化和非矿化组织进行三维X射线显微断层扫描。首先提取待检测的样品，然后将样品固定并放置于显微CT仪器中。实验的第三步是为每个样品设置采集参数并收集图像。最终，通过X射线CT获得了样品的高分辨率三维图像。与现有的MRI、超声或电子显微镜等方法相比，该技术的主要优势在于能够以1微米分辨率提供蜱虫体积的信息。该方法可为多种生物组织的研究提供见解，也可应用于电子学、材料科学以及考古学领域。矿化组织与非矿化组织的制备方法不同。矿化组织必须密封在贴合紧密的容器中，以防止样品位置发生移动。在进行高分辨率测量时，容器的形状将根据组织的形态而变化。例如，从18.5天大的胚胎中提取的小鼠股骨可以放入移液器吸头中。首先，使用环氧树脂等胶水将聚苯乙烯移液器吸头的窄端密封。然后用工作缓冲液填充吸头。在此情况下，将 PBS 注入套紧暴露股骨的腿部末端，将移液器吸头放入合适的支架中，并用石蜡膜密封另一端，然后按照随附文稿中所述方法处死并灌注动物。随后取出染色的肺脏和心脏，转移至预先准备好的 50 毫升离心管中。将器官置于一张干燥的纸片上。将样品放入底部带有乙醇润湿布料的最终测量试管中。为创建乙醇饱和环境，样品应紧密地置于试管内。若样品松动，可用金属丝固定，并将其固定在靠近试管底部、布料上方的位置。接下来，将管子粘合或拧入仪器的支架中，并开始设置图像采集参数。首先将样品支架放入仪器的旋转台上。然后使用任意选择的电压和电流值拍摄X射线图像。如果图像过暗，首先通过逐步增加光子数量进行调整。通过逐步增加电流来实现此操作。如果将电流增加至200微安后图像仍未变亮，则通过逐步提高电压来小幅增加X射线光子的能量。如果图像过亮，应首先降低电压，然后降低电流，直至图像达到满意效果。宾宁（Benning）还可用于在牺牲分辨率的前提下提高图像亮度。宾宁值设为2时，图像亮度将提高约四倍，但分辨率降至原来的一半。在设定最佳亮度后，应优化相机的曝光时间，以在可实现的最佳对比度与合理的实验时长之间取得平衡。对于吸收率较高的样品，可通过使用滤光片减少低能光子通量来改善图像对比度。现在，在0.5倍至40倍之间选择工作放大倍数，并调整视野以包含整个样品，同时实现分辨率的最大化。为提高分辨率，可将X射线源靠近样品放置。为了增大视场，应将探测器靠近样品放置。对于三维成像，样品在任意旋转角度下都必须完全位于视场范围内，因此旋转轴必须居中。首先将样品旋转至负20度。如果目标体积发生横向偏移，请重新调整旋转轴位置。继续在更多旋转角度下采集图像，并持续进行校正，直至样品在负90度到正90度范围内完全可见，然后在负90度至90度之间的所有角度进行测量。运行成像程序可能需要较长时间，因此请合理规划实验时间。例如，以八微米分辨率对整个股骨在Forex放大倍数下成像，需要采集1000张投影图像，仅需三小时即可完成。然而，要以0.5倍放大倍数和16微米分辨率对大鼠肺部进行可视化，则需要采集2,500张投影图像，耗时长达10小时。为了进行后续的图像比较，有必要在相同的实验条件下，对由具有类似骨和类似水的X射线吸收特性的仿制材料制成的标准模体进行成像，以校准图像。对于样品，在记录所有投影图像后，将重建完整的体积。为了将重建的图像校准至模体的数值，可使用Houndsfield单位或CT标度。例如，在 Forex 放大倍数下，将模体中的类似水的值设为零，类似骨的值从该范围设为 3000。所有其他值均通过插值或外推获得。现在可以使用任何能够支持 20 吉字节文件的软件包（如免费软件 ImageJ 或 Fiji）对图像进行分析。该体绘制图像显示了小鼠股骨在骨矿化启动后第四天的情况，矿化部分计算为18%，且可将骨矿密度与处于其他发育阶段的骨骼进行比较。此幅来自12周龄雌性裸鼠肺部的断层扫描体绘制图像分辨率达到16微米。通过肺部染色可显示直径为20微米的血管。在对相同肺组织进行的连续切片分析中，植入肿瘤细胞四周内可见多个呈实性灰色的癌结节。在这些肺组织中，结节生长至占据肺体积的17%。大部分肺部染色位于肿瘤的周边区域。结节内部也存在血管，约占其体积的3%。一旦掌握技巧，若操作得当，样本定位可在15至20分钟内完成。成像时间包括自动体积重建，通常无需操作人员在场，具体时长取决于样本，可能长达50小时。请注意，使用固定剂和染色剂可能具有极高危险性。务必佩戴实验室手套，并避免吸入样本产生的蒸气。

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