高分辨率三维成像 EX - VIVO生物样品显微CT

非破坏性的量可视化可以实现，只有通过层析成像技术，其中最有效的是X射线微计算机断层扫描（CT）。

该程序的总体目标是对矿化和非矿化组织进行 3D X 射线显微断层扫描。这是通过首先提取要检查的样品，然后将样品固定在显微 CT 仪器中并定位来实现的。该程序的第三步是为每个样品设置采集参数并收集图像。

最终，通过 X 射线 CT 获得样品的高分辨率 3D 图像。我们现有方法（如 MRI、超声或电子显微镜）的这种技术的主要优点是它以 1 微米的分辨率提供有关蜱虫体积的信息 D.这种方法可以提供许多生物组织的洞察力。它还可用于电子学、材料科学和考古学。

矿化组织和非矿化组织的制备不同。矿化组织必须密封在紧密配合的容器中，这样样品位置不会改变。在进行高分辨率测量时，容器形状将根据组织的形态而变化。

例如，从 18.5 D 龄胚胎中提取的小鼠股骨可以放入移液器吸头中。首先用类似胶水的环氧树脂密封聚苯乙烯移液器吸头的窄端。然后用工作缓冲液填充尖端。

在这种情况下，PBS 现在将裸露股骨的腿紧紧地放入吸头中，并将移液器吸头放入合适的支架中，并用封口膜片状处死密封另一端，并按照随附手稿中的概述灌注动物。然后提取染色的肺和心脏，并将它们转移到准备好的 50 毫升试管中。将器官放在一张干燥的纸上。

将样品放入最后的测量试管中，试管底部是乙醇湿布。为了营造乙醇饱和的环境，样品应紧密贴合试管内。如果样品松动，请用金属丝拧紧，并将其固定在试管底部附近，就在布的正上方。

接下来，将管子粘上或拧入仪器的支架中，然后继续设置图像。采集参数。首先将样品架放在仪器的旋转台上。

然后使用任意选择的电压和电流值拍摄 X 射线图像。如果图像太暗。首先逐渐增加光子的数量来进行更改。

这是通过逐渐增加电流来实现的。如果在将电流增加到 200 微安后图像没有变得更亮，则通过增加电压来逐渐增加 X 射线光子的能量。如果图像太亮，首先降低电压，然后降低电流，直到图像令人满意。

弯曲还可用于以牺牲分辨率为代价来提高图像亮度。inning 值为 2 将使图像的亮度增加大约四倍，而分辨率只有一半。设置最佳亮度后，优化相机的曝光时间，以在可获得的最佳对比度和合理的实验持续时间之间进行折衷。

通过使用滤光片减少低能光子通量，可以提高图像对比度，尤其是对于高吸收率的样品。现在，在 0.5 x 和 40 x 之间选择工作放大倍率，并调整视野以包含整个样品，同时最大限度地提高分辨率。要提高分辨率，请将 X 射线源放置在更靠近样品的位置。

为了增加视野，请将检测器放置在更靠近样品的位置。对于 3D 成像，样品必须在任何旋转角度下都适合视场，因此旋转轴必须居中。首先将样品旋转到负 20 度。

如果所需的体积已横向移动，请重新定位旋转轴。继续以进一步旋转的方式拍摄图像并继续进行校正，直到样品从负 90 度到正 90 度完全可见，然后继续以负 90 度到 90 度之间的所有角度进行测量。运行成像程序可能需要很长时间，因此请相应地进行计划。

例如，要在外汇放大倍率下以 8 微米的分辨率对最股骨进行成像，需要 1000 张投影图像。这只需要三个小时即可完成。然而，需要 10 小时才能收集到 2， 500 张投影图像，以 0.5 倍放大倍率和 16 微米分辨率观察大鼠肺。

为了将来的图像比较，有必要通过拍摄由人造材料制成的标准模型的图像来校准图像，这些人造材料在相同的实验条件下具有骨状和水状 X 射线吸收。对于样品，在记录所有投影图像后，重建整个体积。要将重建的图像校准为模型的值，请使用 hounds 场或 CT 刻度。

例如，在外汇放大时，虚拟模型中的 waterlike 值设置为零，bone like 值设置为此范围内的 3000。所有其他值都是内插或外插的。现在可以使用任何可以支持 20 GB 文件的软件包（例如免费软件 Image J 或 Fiji）来分析图像。

该体积渲染显示了小鼠在骨矿化开始四天后的股骨，矿化分数计算为 18%，骨矿物质密度可以与处于其他发育阶段的骨骼进行比较。12 周龄雌性裸鼠肺的断层扫描体积渲染被解析为 16 微米。肺染色用于显示直径为 20 微米的血管。

在这个系列切片中，对相同的肺进行了分析。在植入肿瘤细胞后的 4 周内，多个癌结节可显示为纯灰色。在这些肺部中，结节生长到覆盖 17% 的肺体积。

大多数肺部染色发生在肿瘤的外围区域。结节内部也有血管，约占其体积的 3%。一旦掌握，如果作得当，可以在 15 到 20 分钟内完成样品定位。

成像时间包括自动体积重建，通常不需要手术人员在场，具体取决于样本，可能需要长达 50 小时。不要忘记，使用固定剂和染色剂可能非常危险。始终佩戴实验室手套，避免吸入样品中的蒸气。