使用微量生物分光光度计测定核酸和蛋白质的浓度
2011年2月17日
本文报道了BioSpec-nano紫外-可见分光光度计在双链DNA和蛋白质定量中的准确性和重复性数据。即使使用极小体积（1至2 µL），其重复性仍非常优异，而自动擦拭功能可提高通量，并将残留降至最低，从而获得更精确的结果。
本实验的总体目标是使用微量分光光度计准确且可重复地测定核酸和蛋白质的浓度。首先选择待测样品的合适光程，以实现该目标。实验的第二步是测量空白对照。
接下来，测量DNA或蛋白质样品。该实验步骤的最后一步是将数据保存为PDF或CSV格式。最终获得高度可重复的DNA和蛋白质结果。
通过该方法可快速、准确地获得定量结果。该技术的主要优点是快速、精确且可重复。开始DNA定量实验时，打开BIOSpec nano分光光度计。
从电脑桌面打开 BIOS spec nano 软件。点击“简单核酸 D-S-D-N-A”标签。软件将与仪器建立通信并运行初始化程序。
这可以验证仪器的性能是否符合规格要求。接下来，选择光程长度。在光程长度滑块上进行选择。
对于微升级别的样品，有三种选择。可使用0.2毫米或0.7毫米的光程，而对于稀释样品，则可选择使用5毫米光程的比色皿。
在此演示中，选择 0.7 毫米的光程用于测量 2 微升样品。所有计算均基于所选的光程长度。接下来在软件中，单击设置选项卡，并选择自动擦拭设置。
选择一种进行单次擦拭。在样品测量前，或每次选择新的光程长度时，均需进行空白测量。对于0.7毫米光程长度，吸取两微升水或缓冲液至基座上。单击“空白”以进行空白测量。
上方窗口将移动以接触样品液滴，此时可观察到氙气闪光。测量完成后，擦拭器将自动清除样品。现在可以进行样品测量了。
使用均匀的样品溶液非常重要，因为未溶解的颗粒物会影响实验结果。样品中的颗粒会导致数据不可重复。为避免引入气泡，应小心吸取两微升样品，然后将样品从移液枪尖端均匀地排加到基座上。
按下仪器上的启动按钮。与之前相同，上方窗口将移动并与样品液滴接触，可观察到氙灯闪烁，为确定重复性，需对同一样品重复测量三次，所有记录的数据将自动保存为 A BUD 文件。如需保存为 PDF 或 CCSV 文件，请点击保存 P-D-F-C-S-V。
还可以通过保存选项卡中的相应选项将结果保存为 CSV 文件。蛋白质定量可使用 280 波长下的吸光度法进行。如需进行蛋白质定量，请选择蛋白质定量选项卡。
如果已知，输入280 nm处的消光系数ε280；如果未知ε280，请使用ε280计算器进行计算。在光程长度滑块上选择0.2毫米，以测量3微升样品。接下来，在软件中点击“设置”选项卡，并选择自动擦拭设置。选择两次擦拭，以防止任何样品残留，确保读数准确。
将三微升水或缓冲液移液至样品台，点击软件中的“空白”按钮进行空白测量。随后，小心地将三微升蛋白质样品移液至样品台。确保不引入任何气泡，然后点击软件中的“开始”按钮，或按下仪器上的开始按钮以开始测量样品。
对同一样品重复测量三次以确定所示的重复性。以下是对典型双链DNA样品测量所得的数据。用于计算DNA浓度的公式为：样品浓度等于DF乘以OD260减去OD320的差值再乘以NACF，其中DF为样品稀释倍数，NACF为核酸浓度换算因子。
核酸浓度因子根据所选分析物设定。显示计算出的核酸浓度和OD 260/280比值。本表格包含DNA定量的重复性测试结果。
综合数据显示，结果具有高度可重复性，相对标准偏差仅为0.26%。此处展示了牛血清白蛋白（BSA）蛋白质浓度分析的代表性结果。每毫升微克（µg/mL）的蛋白质浓度基于Epsilon 280值计算。最后，本表展示了蛋白质定量的可重复性分析结果。
0.51%的相对标准偏差表明，BIOS spec nano不仅对DNA，而且对蛋白质的光密度测量也具有良好的准确性。熟练掌握后，可在一分钟内完成多个样品的分析。
概述
本研究评估了BioSpec-nano紫外-可见光分光光度计在定量双链DNA和蛋白质方面的准确性和重复性。该方法即使在超微量样品体积下仍表现出优异的重复性，且具有最小的交叉污染，可提高检测通量。
关键研究要素
科学领域
- 生物化学
- 分析化学
- 生物技术
背景
- 核酸和蛋白质的准确定量在生物研究中至关重要。
- 微量分光光度法可实现对极少量样品的分析。
- 自动化功能可提高测量的效率和准确性。
- 可重复性是获得可靠实验结果的关键。
研究目的
- 评估 BioSpec-nano 分光光度计在核酸和蛋白质定量中的性能。
- 建立使用微量样品体积进行准确定量的实验方案。
- 通过重复测量验证结果的可靠性。
使用的方法
- 选择适合的样品测量光程。
- 样品分析前进行空白测量。
- 自动擦拭以防止样品间的交叉污染。
- 将数据保存为 PDF 或 CSV 格式以供进一步分析。
主要结果
- DNA定量结果高度可重复，相对标准偏差为0.26%。
- 蛋白质定量同样表现出高准确性，相对标准偏差为0.51%。
- 使用BioSpec-nano可实现快速且精确的测量。
- 可快速分析多个样品，提高通量。
结论
- BioSpec-nano 分光光度计可对双链 DNA（dsDNA）和蛋白质提供可靠的定量结果。
- 自动化功能显著提高了测量效率。
- 该方法适用于生物研究中的高通量应用。
常见问题
行业重要性概述
核酸和蛋白质的准确且可重复的定量对于早期药物发现中的靶点验证和检测方法开发至关重要。BioSpec-nano 微量分光光度计可实现高通量、低样品消耗的检测，并配备自动样品处理功能，能够减少变异并提高先导化合物筛选流程中的数据可靠性。其快速测量周期和低相对标准偏差有助于在后续筛选及转化应用中获得可靠的预测结果。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可实现对核酸和蛋白质样品的精确定量，支持靶标表达分析和通路研究。
- 操作价值：减少样品消耗和人工操作步骤，提高在发现生物学中进行假设验证的通量。
- 预测价值：较低的相对标准偏差（DNA 为 0.26%，蛋白质为 0.51%）增强了基于定量数据做出“推进/终止”决策时的可信度。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供可重复的吸光度测量值（DNA 的 OD260-OD320，蛋白质的 OD280），适用于实验方法标准化和试剂质量鉴定。
- 操作价值：自动擦拭和调零可最大限度减少残留，确保不同酶标板或批次间测量结果的一致性。
- 可扩展性：每三秒完成一次测量，可快速筛选样品文库或组分分离产物。
转化与临床前研究
- 转化连续性：支持生物标志物定量和药代动力学样本分析，适用于需要小体积、高精度检测的场景。
- 机制性风险降低：通过色氨酸、酪氨酸及半胱氨酸二硫键残基的ε280计算获得准确的蛋白质浓度数据，可在功能分析中实现正确给药。
- 工作流程整合：以PDF/CSV格式输出结果，便于在发现研究与临床前团队之间进行数据追踪和跨部门共享。
流程与工作流整合
从最初的靶点验证到检测方法开发，再到临床前样本分析，BioSpec-nano 贯穿了整个发现流程，尤其适用于需要严格保存样本并确保测量可重复性的场景。
- 发现生物学：支持对核酸（如基因表达载体）和蛋白质（如纯化靶标、抗体）进行假设驱动的定量分析，用于靶点验证。
- 筛选：可在生化或基于细胞的检测中，以极低样品体积实现对样品输入和反应输出的质量控制。
- 分析：提供基于光密度（OD）的定量读数，具备自动光程校正和蛋白质消光系数计算功能。
- 转化研究：适用于需精确浓度归一化的低体积临床前样品（如血浆、组织裂解液）。
- 企业级复用：可作为共享的核心实验室资源，实现跨多个项目和检测模式的标准化定量。
运营与企业影响
- 科学价值：提高核酸和蛋白质定量的数据质量与可重复性，减少早期筛选中的假阴性/假阳性结果。
- 操作价值：通过自动化样品接触、测量和清洗过程，降低操作人员差异，提升实验室效率。
- 战略价值：通过为构效关系（SAR）研究提供可靠的定量数据，加快先导化合物优化的迭代速度。
- 项目组合影响：通过提供可信的定量数据支持靶点优先级排序，实现基于风险调整的资源分配。
实施注意事项
- 需要熟悉分光光度计原理，并能根据样品浓度选择合适的光程。
- 需要配备安装有 BioSpec-nano 软件的计算机，并定期维护光学表面。
- 通过标准化的空白校正、擦拭和样品加载操作流程（SOP），有助于确保不同用户间操作的一致性。
- 可通过软件设置和光程调整，适用于多种类型的样品（如 DNA、蛋白质及其他分析物）。
- 仅限于基于吸光度的定量分析；若无额外仪器，不适用于荧光或化学发光检测。
