Name: 偏光易位荧光蛋白爪蟾外胚层响应Wnt信号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 了解非洲爪蟾外胚层中荧光蛋白的亚细胞定位变化，用于研究Wnt信号通路调控下的细胞极性。该方法通过显微注射和免疫染色技术，帮助研究者可视化信号蛋白在活体内的分布动态。

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Sokol 实验室的研究由美国国立卫生研究院资助。

1. 体外 受精作用 非洲爪蟾 卵
<ol>
	<li>从实验前12小时注射过人绒毛膜促性腺激素（400单位/只）的雌性青蛙中获取卵子。</li>
	<li>将卵子放入少量（0.5–1 ml）1× Marc's 修饰林格液（MMR）中10使卵子受精 体外 用一小块解剖出的睾丸组织。2–3 分钟后，加入 0.1× MMR 液以完全覆盖卵子表面。20 分钟后，用 3% 半胱氨酸盐酸盐溶液（用氢氧化钠调节至 pH 8）去除卵胶膜。卵子用 0.1× MMR 洗涤三次，并置于低温培养箱中13° C用于注射。</li>
	<li>受精卵发育至2-4细胞阶段。注射时，将胚胎转移至含有3% Ficoll和0.5×MMR的溶液中。</li>
</ol>
2. RNA 显微注射
<ol>
	<li>使用 mMessage mMachine 试剂盒（Ambion）从线性化 DNA 模板合成 RNA，并用无 RNase 水稀释至储存浓度为 0.1–1 μg/μl。注射用 RNA 的最佳剂量需通过预实验确定。Diversin-RFP、膜标记物 GFP-CAAX 和 Frizzled 8 的 RNA 注射剂量为每次注射 0.1–1 ng。</li>
	<li>注射针通过毛细管使用拉针仪制备，再用磨针仪进行修整。注射前，每根注射针需用水校准，确保每次注射释放 10 nl 液体。</li>
	<li>进行注射时，将胚胎置于塑料培养皿中，放入含 3 % Ficoll 和 0.5 × MMR 的大液滴内。使用 Narishige 微注射仪将 1 μl RNA 溶液吸入注射针中，向 8 细胞期胚胎的动物极裂球内注射 10 nl RNA，重复 2–3 次。注射后的胚胎转移至 12 孔板的一个孔中。</li>
</ol>
3. 准备外胚层外植体
<ol>
	<li>当注射后的胚胎发育至早期原肠胚阶段时，将其转移至已涂有1%琼脂糖的3 cm塑料培养皿中的0.6 × MMR溶液中。使用镊子手动去除卵黄膜。利用钨针和毛环从胚胎上切取外胚层组织外植体。</li>
	<li>将外胚层组织外植体转移至玻璃小瓶中，用含3.7%甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS）固定30分钟。固定后的外植体用PBS洗涤三次（每次10分钟）。在第三次洗涤液中加入DAPI以染色细胞核。</li>
	<li>将外植体置于载玻片上。在载玻片上粘贴两条透明胶带，将外植体置于两条胶带之间。由于外植体的外表面具有色素，因此应使外植体的内侧朝向显微镜物镜。加入两到三个20 μl的封片液滴（含25 mg/ml DABCO抗荧光淬灭剂的70%甘油PBS溶液）11，然后加盖盖玻片。</li>
</ol>
4. 在荧光显微镜下对组织块进行成像
<ol>
	<li>使用配备适当滤光片的蔡司 Axioplan 荧光显微镜观察样品。</li>
	<li>利用 Apotome 附件拍摄图像，以从多个独立的外植体中可视化特定层面。</li>
</ol>
5. 冷冻切片
冷冻切片是观察细胞内荧光蛋白分布的另一种方法，更适用于免疫染色。在发育第10期，胚胎用Dent固定液（20% DMSO，80%甲醇）固定1–2小时，用PBS洗涤后，包埋于15%鱼明胶/15%蔗糖溶液11中。将包埋的胚胎在干冰上迅速冷冻，并在Leica冷冻切片机上进行切片。横切面将包含已注入RNA及其翻译产生的蛋白质产物的外胚层细胞。切片可保留荧光信号，可用特异性抗体进行免疫染色，再用荧光标记的二抗进行标记。细胞核用DAPI染色。封片介质与上文所述相同。成像操作可按上文所述进行。
6. 代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2700/2700fig1.jpg" alt="RNA 横截面过程；叠加图像；荧光显微镜；RFP、γ-微管蛋白、DAPI；细胞研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
 图 1. Frizzled 受体将 Diversin 招募至细胞膜。 表达 Frizzled 8（Xfz8）和 Div-RFP RNA 的外胚层细胞显示 Div-RFP 定位于细胞膜，而非中心体（通过 γ-微管蛋白共染色揭示）。实验示意图位于上方，下方显示一个典型的横截面图像。

<ol><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+induction+---+molecular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic induction --- molecular aspects.</a> Development. 99, 285-306 (1987).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Principles+of+Developmental+Genetics%22">Principles of Developmental Genetics</a>. Moody, S. A. , Academic Press. (2007).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127, 469-480 (2006).</li>
<li>Klaus, A., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+and+its+impact+on+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling and its impact on development and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).</li>
<li>Gordon, M. D., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling%3A+multiple+pathways%2C+multiple+receptors%2C+and+multiple+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors.</a> J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).</li>
<li>Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ankyrin+repeat+protein+Diversin+recruits+Casein+kinase+Iepsilon+to+the+beta-catenin+degradation+complex+and+acts+in+both+canonical+Wnt+and+Wnt%2FJNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling.</a> Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).</li>
<li>Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversin+regulates+heart+formation+and+gastrulation+movements+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).</li>
<li>Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomal+localization+of+Diversin+and+its+relevance+to+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling.</a> J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).</li>
<li>Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Xenopus+Frizzled+8+in+dorsal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development.</a> Mech Dev. 74, 145-157 (1998).</li>
<li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos%3A+I.+characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30, 675-686 (1982).</li>
<li>Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localization+is+required+for+Dishevelled+function+in+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling.</a> J Biol. 4, 3-3 (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们已使用上述方案对 Diversin 的亚细胞定位进行了表征。在动物极外植体中，Diversin-RFP 位于细胞核附近，并在冰冻切片中与中心体标志物 γ-微管蛋白（g-tubulin）共定位（图1）。一旦确定了蛋白质的亚细胞定位，便可构建缺失突变体，以确定负责该亚细胞定位的蛋白结构域是否必要且充分。通过该方法，已将 Diversin 的中心体定位结构域定位于蛋白的中部及羧基末端结构域，这两个区域均含有卷曲螺旋（coiled-coil）基序8。
该相同方案可用于研究信号转导引起的蛋白质定位变化。我们发现，分泌型Wnt蛋白可促使Div-RFP重定位至细胞膜附近的点状结构，而Fz8则将Div-RFP招募至细胞膜上的斑块区域（图1）。我们进一步发现，羧基末端结构域本身对于膜招募并非必需，但对于极性膜招募是必需的。
综上所述，上述实验方案将有助于在用特定生长因子或信号蛋白刺激细胞后，开展蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质向不同细胞区室定位的多种研究。

响应 wnt 信号通路在 xenopus 外胚层中荧光蛋白的极性转位

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

细胞极性是真核细胞的一种基本特性，在胚胎发育过程中受到内在和外在因素的动态调控 1, 2其中一个参与该调控的信号通路是Wnt通路，该通路在胚胎发生过程中多次被利用，并且对人类疾病具有重要意义3, 4, 5该信号通路的多个分子组分以空间限制的方式协同调控信号传导，但其潜在机制尚未完全阐明。 非洲爪蟾 胚胎上皮细胞是研究各种信号蛋白亚细胞定位的优良体系。荧光融合蛋白在其中表达 非洲爪蟾 通过RNA显微注射获得胚胎后，制备外胚层外植体，并利用落射荧光显微技术评估蛋白质定位。本实验方案中，我们描述了Diversin的亚细胞定位方法；Diversin是一种细胞质蛋白，已被证实参与信号转导及细胞极性的决定。6, 7 在……中可视化 非洲爪蟾 外胚层细胞用于研究Wnt信号转导8共表达Wnt配体或Frizzled受体可改变与红色荧光蛋白（RFP）融合的Diversin的分布，并以极化方式将其招募至细胞膜 8, 9。这一点 离体 该方案将是一项有用的补充 体外 培养的哺乳动物细胞研究，其中信号传导的空间调控与完整组织不同，且更难以分析。

非洲爪蟾胚胎外胚层已成为研究细胞极性的理想模型。本文描述了一种检测方法，用于评估外胚层细胞中荧光蛋白的亚细胞分布。该实验方案将有助于解答与信号通路空间调控相关的问题。

响应 Wnt 信号通路在 Xenopus 外胚层中荧光蛋白的极性转位

细胞极性是真核细胞的一种基本特性，在胚胎发育过程中受到内在和外在因素的动态调控。

本实验的总体目标是研究生长因子信号传导对蛋白质亚细胞定位变化的影响。首先向非洲爪蟾早期胚胎的动物极囊胚腔中注射编码多种RFP标记蛋白及信号受体FRIZZLED 8的RNA。随后制备电穿孔胚胎的植入组织或胚胎冷冻切片，并进行免疫染色。最后，使用荧光显微镜对免疫染色的细胞进行成像。最终可获得结果，显示特定蛋白质的亚细胞定位如何依赖于胚胎信号通路。例如，我们证明了DIVERSIN蛋白可由中心体被FRIZZLED 8受体招募至细胞膜。该方法可使研究人员利用非洲爪蟾胚胎在体内观察信号传导蛋白的亚细胞定位。这有助于回答发育生物学和细胞生物学中的基本问题，例如信号传导的空间调控和细胞命运决定机制的研究。开始体外受精过程时，需获取之前注射了人绒毛膜促性腺激素的雌蛙所产的卵子。实验前12小时，在卵子中加入0.5至1毫升1倍浓度的Marx改良Ringer溶液，并用一小块解剖出的睾丸组织进行体外受精。2至3分钟后，用0.1倍浓度的MMR溶液降低盐浓度，以激活精子的运动能力。孵育20分钟。受精后，卵子会以动物极朝上的方向排列。用含3%半胱氨酸的水溶液替换MMR溶液，孵育5分钟，以去除卵子的胶状外膜。用0.1 X MMR溶液洗涤卵子三次。在13摄氏度下孵育至两到四细胞阶段，然后将胚胎转移至3%fi中，并在0.5 XMMR中进行显微注射。使用M message M machine试剂盒从线性化DNA模板合成RNA，并用无RNA酶的水稀释至浓度为0.1至1微克每微升。用于体内RFP、膜标记GFP-CX以及FRIZZLED 8的RNA，每注射剂量使用量为0.1至1纳克。在注射前，使用拉针仪和磨针仪从毛细管制备注射针。使用水校准每根针头，使每次注射时推出10微升液体。将胚胎置于塑料培养皿上，并放入一大滴3%纤维素、0.5倍MMR溶液中。用窄口径显微注射器将一微升RNA溶液吸入注射针头中。向两个细胞胚胎的两个动物极细胞中各注射10纳升RNA。将注射后的胚胎转移至12孔板中的一个孔内，在13摄氏度下培养，直至胚胎发育至早期原肠胚阶段。将胃期胚胎转移至已涂有1%琼脂糖的六厘米塑料培养皿中的0.6 XMMR溶液中。用镊子手动去除卵黄膜。然后使用金针和毛发环从胚胎中切取外胚层外植体。在 PBS 中用 3.7% 多聚甲醛固定 30 分钟。在 PBS 中将 X 标本漂洗三次，每次 10 分钟。为了染色细胞核，在第三次漂洗时加入 davi。接下来，将X外植体置于载玻片上，方法是将其夹在两条透明胶带之间，并使X外植体内侧无色素的一面朝向物镜。加入两到三滴20 µL的封片液，然后盖上盖玻片。注射后的胚胎可进行冷冻切片，以观察荧光蛋白在细胞内的分布，并用特异性抗体进行共染。在10期，将胚胎置于4毫升玻璃小瓶中，用浓固定液在室温下固定1至2小时。随后，用PBS洗涤胚胎，并在同一小瓶中将其包埋于15%鱼胶、15%蔗糖溶液中。第二天，将包埋的胚胎转移至塑料模具中。在干冰上迅速冷冻包埋的胚胎。然后使用冷冻切片机制备冷冻切片。对标本进行免疫荧光染色，封片后采用与外胚层移植实验相同的方法对横切胚胎进行成像。使用配备适当滤光片的Zeiss Axio Plan荧光显微镜，并结合Z轴扫描，以识别并获取X切面内特定的Z平面图像。在本图中，ersin定位于表皮细胞的中心体，但随后易位至细胞膜。在 Frizzled 八的响应下，cex GFP 以绿色标记细胞膜。Diverse in RFP 呈红色，而 DPI 标记的细胞核呈蓝色。在胚胎冷冻切片中，Diverse in RFP 被 Frizzled 八招募至细胞膜。γ微管蛋白是一种中心体标记物。观看本视频后，您应充分理解XUS胚胎及胚胎细胞在亚细胞水平研究蛋白质定位与信号传导过程中的重要作用。

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