响应 Wnt 信号通路在 Xenopus 外胚层中荧光蛋白的极性转位

本实验的总体目标是研究生长因子信号传导对蛋白质亚细胞定位变化的影响。首先向非洲爪蟾早期胚胎的动物极囊胚腔中注射编码多种RFP标记蛋白及信号受体FRIZZLED 8的RNA。随后制备电穿孔胚胎的植入组织或胚胎冷冻切片，并进行免疫染色。

最后，使用荧光显微镜对免疫染色的细胞进行成像。最终可获得结果，显示特定蛋白质的亚细胞定位如何依赖于胚胎信号通路。例如，我们证明了DIVERSIN蛋白可由中心体被FRIZZLED 8受体招募至细胞膜。

该方法可使研究人员利用非洲爪蟾胚胎在体内观察信号传导蛋白的亚细胞定位。这有助于回答发育生物学和细胞生物学中的基本问题，例如信号传导的空间调控和细胞命运决定机制的研究。开始体外受精过程时，需获取之前注射了人绒毛膜促性腺激素的雌蛙所产的卵子。

实验前12小时，在卵子中加入0.5至1毫升1倍浓度的Marx改良Ringer溶液，并用一小块解剖出的睾丸组织进行体外受精。2至3分钟后，用0.1倍浓度的MMR溶液降低盐浓度，以激活精子的运动能力。孵育20分钟。

受精后，卵子会以动物极朝上的方向排列。用含3%半胱氨酸的水溶液替换MMR溶液，孵育5分钟，以去除卵子的胶状外膜。用0.1 X MMR溶液洗涤卵子三次。

在13摄氏度下孵育至两到四细胞阶段，然后将胚胎转移至3%fi中，并在0.5 XMMR中进行显微注射。

使用M message M machine试剂盒从线性化DNA模板合成RNA，并用无RNA酶的水稀释至浓度为0.1至1微克每微升。用于体内RFP、膜标记GFP-CX以及FRIZZLED 8的RNA，每注射剂量使用量为0.1至1纳克。在注射前，使用拉针仪和磨针仪从毛细管制备注射针。

使用水校准每根针头，使每次注射时推出10微升液体。将胚胎置于塑料培养皿上，并放入一大滴3%纤维素、0.5倍MMR溶液中。用窄口径显微注射器将一微升RNA溶液吸入注射针头中。

向两个细胞胚胎的两个动物极细胞中各注射10纳升RNA。将注射后的胚胎转移至12孔板中的一个孔内，在13摄氏度下培养，直至胚胎发育至早期原肠胚阶段。

将胃期胚胎转移至已涂有1%琼脂糖的六厘米塑料培养皿中的0.6 XMMR溶液中。用镊子手动去除卵黄膜。然后使用金针和毛发环从胚胎中切取外胚层外植体。

在 PBS 中用 3.7% 多聚甲醛固定 30 分钟。在 PBS 中将 X 标本漂洗三次，每次 10 分钟。为了染色细胞核，在第三次漂洗时加入 davi。

接下来，将X外植体置于载玻片上，方法是将其夹在两条透明胶带之间，并使X外植体内侧无色素的一面朝向物镜。加入两到三滴20 µL的封片液，然后盖上盖玻片。

注射后的胚胎可进行冷冻切片，以观察荧光蛋白在细胞内的分布，并用特异性抗体进行共染。在10期，将胚胎置于4毫升玻璃小瓶中，用浓固定液在室温下固定1至2小时。随后，用PBS洗涤胚胎，并在同一小瓶中将其包埋于15%鱼胶、15%蔗糖溶液中。

第二天，将包埋的胚胎转移至塑料模具中。在干冰上迅速冷冻包埋的胚胎。然后使用冷冻切片机制备冷冻切片。

对标本进行免疫荧光染色，封片后采用与外胚层移植实验相同的方法对横切胚胎进行成像。使用配备适当滤光片的Zeiss Axio Plan荧光显微镜，并结合Z轴扫描，以识别并获取X切面内特定的Z平面图像。在本图中，ersin定位于表皮细胞的中心体，但随后易位至细胞膜。

在 Frizzled 八的响应下，cex GFP 以绿色标记细胞膜。Diverse in RFP 呈红色，而 DPI 标记的细胞核呈蓝色。在胚胎冷冻切片中，Diverse in RFP 被 Frizzled 八招募至细胞膜。

γ微管蛋白是一种中心体标记物。观看本视频后，您应充分理解XUS胚胎及胚胎细胞在亚细胞水平研究蛋白质定位与信号传导过程中的重要作用。