活体大鼠皮层神经元线粒体膜电位与活性氧检测

本实验的目的是利用荧光探针TMRM和H2DCFDA，分别检测原代皮层神经元中的线粒体膜电位以及活性氧水平。首先配制TMRM和H2DCFDA的储备液及工作液浓度；第二步，在室温下用Thai roads缓冲液将皮层神经元与TMRM和H2DCFDA共同孵育45分钟。

第三步是使用515/517纳米和488/515纳米的激发/发射波长，对活体皮层神经元中的TMRM和DCF荧光强度进行成像。在存在线粒体解偶联剂FCCP的情况下监测TMRM荧光的变化，而在过氧化氢存在下监测DCF荧光的变化。本实验流程的最后一步是数据的采集、标准化和分析。

最终，通过绘制图表来获得结果，该图表分别显示了在FCCP和过氧化氢处理前后TMRM和DCF荧光强度的相对水平。大家好，我是Joanna Koska。欢迎来到我在芝加哥洛约拉大学的实验室。

今天我们将向您展示如何测量大鼠皮层神经元中的线粒体膜电位和活性氧水平。该实验操作将由dhi演示。大家好，我是De Denise Jossi。

通过该实验步骤，可在单个线粒体标记水平检测线粒体膜电位，并在单细胞标记水平检测活性氧。现在开始操作。将5毫克TMRM溶解于1毫升无水二甲基亚砜中，涡旋混匀1分钟，配制10毫摩尔的TMRM储备液。

然后分装，将分装物于-20摄氏度保存。避光，且在一个月内使用。接下来，通过将4.87毫克H₂DCFDA溶解于1毫升无水二甲基亚砜中，配制10毫摩尔的H₂DCFDA储备液。

同样，涡旋震荡一分钟，然后分装并储存在-20摄氏度。避光保存，并在一周内使用，以首先对大鼠皮层神经元进行TMRM负载。用台氏缓冲液洗涤培养的神经元三次。

然后通过将10毫摩尔的TMRM储备液在tb中稀释1000倍来配制20纳摩尔的TMRM。每1毫升tb中加入2微升稀释后的TMRM。将神经元在避光、室温条件下与TMRM共同孵育45分钟。

孵育45分钟后，将培养皿置于显微镜载物台上开始成像，以使大鼠皮层神经元负载H 2D CFDA，随后用tb洗涤培养的神经元三次。接着，通过将10毫摩尔的H 2D CFDA储备液在tb中稀释10倍，配制2微摩尔的H 2D CFDA溶液，然后每1毫升tb中加入2微升稀释后的H 2D CFDA溶液。

随后，在室温避光条件下，将神经元与H 2D CFDA共同孵育45分钟。孵育结束后，用TB缓冲液洗涤神经元四次，以去除过量的荧光指示剂，然后进行活细胞成像。对经TMRM孵育的神经元，采用共聚焦激光扫描显微镜结合活细胞时间序列程序进行成像。应用低分辨率和衰减的激光功率，以缩短成像所需时间并避免光漂白。

接下来，使用反射光调整已加载TMRM的固定神经元的焦距。通过在514纳米激发并570纳米检测来观察TMRM荧光。在设定所有参数（包括分辨率、激光功率、检测增益、相机增益以及时间间隔）以获取图像后，将相机的检测增益设置为略低于饱和水平。

在不同实验之间请勿更改这些设置。接下来，更换处理条件。开始采集图像以检测delta PSY M刺激的变化，例如可分别施加一微摩尔的FCCP或每毫升两微克的寡霉素，这将显著使线粒体膜电位去极化或超极化。

这些变化将表现为TMRM荧光强度相较于基础荧光强度的降低（如使用FCCP时）或TMRM荧光强度的增加。在进行LIGA myin实验时，若需对经H2DCFDA孵育的神经元进行活细胞成像，首先将培养皿安装在显微镜载物台上，使用反射光调节细胞的焦距。通过488纳米激发光和515纳米发射光检测DCF荧光。

接下来，将激光功率调整为5%至7%，以检测256×256的增益和分辨率。在不同实验之间不要更改这些设置。然后设定获取实时图像的频率。

使用时间序列程序，选择一个新的视野并开始采集图像，以检测 ROS 水平的变化。用 100 至 200 微摩尔的过氧化氢处理细胞。与基础水平相比，这将表现为 DCF 荧光强度的增加。

使用 LSM 程序中的兴趣区域工具选择相应区域，然后从图像细胞中的线粒体区域或整个细胞体中选择 ROI，分别用于测量 TMRM 或 ROS 的荧光强度。

选择细胞旁边的区域。为计算背景荧光强度，需进行多次测量，并利用 Microsoft Excel 计算各时间点每个细胞目标区域的平均荧光强度减去平均背景荧光强度，从而得到校正后的荧光值。在减去背景强度后，将 TMRM 或 DCF 荧光强度归一化至基线荧光水平。

利用此公式，然后使用 SigmaPlot 程序生成随时间变化的荧光强度变化曲线图。以下是一张大鼠皮层神经元与 TMRM 共孵育后的荧光图像示例。加入线粒体解偶联剂 F-C-C-P-A 后，导致线粒体去极化，并引起 TMRM 荧光强度的降低。

在加入FCCP之前，TMRM荧光水平保持稳定。对TMRM荧光随时间变化的定量分析显示，加入FCCP后TMRM荧光显著下降。以下是一张加载了DCF的大鼠皮层神经元的荧光图像示例。

在加入过氧化氢前的最初120秒内，DCF荧光基线水平保持不变。加入过氧化氢后，细胞体内的DCF荧光强度增加。DCF荧光的时间推移测量显示，过氧化氢处理后其荧光水平持续升高并保持稳定。

在此操作中，重要的是要记住使用低激光功率和快速扫描速度，以避免光漂白和光毒性带来的伪影。祝您的实验顺利成功。