一种用于研究蝾螈晶状体再生的虹膜色素上皮细胞培养系统

本实验的总体目标是培养虹膜色素上皮细胞，以研究晶状体再生。在蝾螈中，首先将蝾螈置于睡眠溶液中麻醉，然后摘除眼睛，即可实现这一目标。

该实验步骤的第二步是从眼组织中分离虹膜色素上皮细胞，首先去除视网膜组织，随后将角膜虹膜碎片切成背侧和腹侧两半。然后将虹膜细胞从基质中分离，并在体外培养两周。经过两周的诱导后，IPE细胞聚集成团，随后被植入已进行优化处理的受体新个体中。

经过一个月的愈合后，组织学结果显示背侧和腹侧虹膜色素上皮（IPE）细胞具有晶状体再生潜能。该方法在细胞培养和移植步骤中的可视化演示至关重要，因为这些步骤难以掌握，需要熟练掌握上百种显微解剖和手术技能。首先使用0.1%乙基氨基苯甲酸甲酯甲磺酸盐对至少七只裸鼠进行麻醉，然后用镊子和手术剪通过剪除眼睑及结膜的方式手术摘除眼球，随后切断视神经。

立即将解剖好的眼睛转移至超净台，用卢戈氏乙醇消毒三秒钟，随后在无钙、无镁的Hank溶液中清洗两次。再将眼睛转移至新鲜的Hank溶液中，继续进行解剖操作。

使用手术刀在眼球上切开一个切口，然后用剪刀沿角膜边缘剪开。取出晶状体，并将残留的视网膜组织连同巩膜一并剪除。

使用15号手术刀将虹膜角膜复合体转移至培养皿中，并置于新鲜的Hanks溶液内。将复合体分离为背侧和腹侧两部分。背侧和腹侧虹膜可通过巩膜背侧存在的黑色斑点以及腹侧虹膜上的V形切口进行区分。

分离腹侧虹膜与背侧虹膜。将虹膜组织碎片收集至含有1毫升L-15溶液的35毫米培养皿中。背侧和腹侧两部分应分别置于不同的培养皿中。

现在向培养皿中加入150微升的dispa溶液，并在27摄氏度下孵育两小时。以从基质中收集IPE细胞。借助镊子，轻轻剥离所有收集到的组织碎片中的IPE细胞。

接下来，将IPE细胞转移至1.5毫升离心管中，在室温下以1000 ×g离心2分钟，弃去上清液。用1毫升Hanks溶液重悬沉淀，再次离心以分离细胞。弃去Hanks溶液，重悬沉淀。

在1毫升1:250的胰蛋白酶溶液中，于27摄氏度孵育2小时，洗涤细胞后离心并去除胰蛋白酶。加入1毫升L-15溶液，再次离心，重复洗涤一次，更换为800微升新鲜L-15溶液，轻轻吹打使细胞重悬。随后将细胞接种至经胶原蛋白包被的24孔板中。

从七个 Ns 中通常可获得四孔背侧细胞和四孔腹侧细胞。将培养皿在 27 摄氏度下孵育两周，持续两周。如图所示，IPE 可通过基因转染以研究其在晶状体再生中的功能。

此为两周的腹侧IPE细胞培养，其形态与背侧细胞相同。请注意，背侧和腹侧虹膜细胞在此阶段仍保留色素。在植入IPE细胞之前，必须通过在400微升新鲜培养基中加入20微升dyse使细胞聚集，轻轻摇晃培养板，并将细胞在27摄氏度的培养箱中放置过夜。

第二天，用轻柔的吹打混悬细胞，然后将细胞转移至1.5毫升离心管中。通过离心洗涤细胞，并用1毫升L-15培养基替换上清液。重复此步骤两次。取10 µL细胞悬液，采用标准方法计算细胞数量。

计算完成后，将3000至5000个细胞用200微升L-15培养基重悬，形成单个聚集体。随后离心收集细胞，并在27摄氏度下孵育48小时。此时细胞可植入受体动物体内。

首先将成年蝾螈置于麻醉溶液中，直至其停止活动。然后使用手术刀片在眼球角膜上切开一个小口。接着用镊子取出晶状体。

摘除晶状体后，将IPE细胞团块放置在眼球腹侧角膜组织下方。现在将蝾螈放回另一个容器中，使其自行愈合。在此期间，需小心处理蝾螈，避免损伤正在愈合的组织。

移植的细胞需要一个月时间再生形成新的晶状体。一个月后，取出植入了细胞聚集体的新眼，并对组织进行固定。采用标准的脱水流程，将固定后的组织包埋于适合切片的模具中，切成15微米厚的切片，并进行适当的染色。

将团块植入慢病毒转导的新眼球后，来自背侧虹膜色素上皮（IPE）细胞的团块可诱导新晶状体的形成。在植入腹侧团块的眼中，也可观察到由宿主背侧虹膜诱导的晶状体形成。当团块由腹侧IPE细胞制备时，未观察到晶状体诱导现象；但在视黄酸存在条件下过表达six3基因时，腹侧团块则可观察到晶状体诱导。

此外，在眼睛发育完成后，还可观察到由背侧虹膜诱导产生晶状体的现象。该技术为晶状体再生领域的研究人员探索不同基因在新研究方向中的作用奠定了基础。