Name: 一个系统为培养虹膜色素上皮细胞，研究蝾螈镜头再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学习培养蝾螈虹膜色素上皮细胞的方法，用于研究晶状体再生机制。该技术通过体外培养IPE细胞并进行移植，帮助科学家深入理解再生生物学过程。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 Ey1040，授予 PAT。

1. 虹膜细胞培养
<ol>
	<li>从7只新螈（用PBS配制的0.1%乙基-3-氨基苯甲酸甲烷磺酸盐麻醉）中取出眼球，并置于无钙镁的Hanks溶液（CMF）中。</li>
	<li>更换手套并在组织培养罩内操作。</li>
	<li>用Lugol's-EtOH对眼球进行3秒的消毒处理。</li>
	<li>用CMF洗涤两次。</li>
	<li>将眼球转移至Hanks溶液中，开始解剖。</li>
	<li>解剖出虹膜-角膜复合体并移除神经视网膜。</li>
	<li>将复合体转移至新的Hanks溶液培养皿中。</li>
	<li>使用#15手术刀将复合体分为背侧和腹侧两部分。</li>
	<li>移除虹膜组织碎片（先移除腹侧），并放入含有1 ml L-15培养基的培养皿中。</li>
	<li>加入15%体积（150 µl）的dispase（浓度为7.5 units/ml）。</li>
	<li>在27°C下孵育2小时（用Parafilm封口膜包裹培养皿）。</li>
	<li>从基质中分离IPE细胞（将胰蛋白酶溶液预热至27°C）。</li>
	<li>将IPE细胞收集至1.5 ml离心管中。</li>
	<li>在室温（RT）下以1000 rpm离心2分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用1 ml Hanks溶液洗涤，室温下以1000 rpm离心2分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入1 ml胰蛋白酶溶液，在27°C下孵育2小时。</li>
	<li>室温下以1000 rpm离心2分钟，去除胰蛋白酶。</li>
	<li>加入1 ml L-15洗涤，以1000 rpm离心2分钟。</li>
	<li>加入800 µl L-15，缓慢吹打约10次（超过12次会降低细胞贴壁能力）。</li>
	<li>将IPE细胞接种于24孔胶原蛋白包被的培养板中，在27°C下孵育2周（通常7只新螈可获得4个背侧和4个腹侧孔的细胞）。</li>
	<li>此时细胞可用于基因转染或用特定因子处理，以研究其在诱导或干扰晶状体再生过程中的作用。</li>
</ol>
2. 虹膜细胞的聚集
<ol>
	<li>向含有虹膜细胞的培养板中加入 20 μl dispase 溶液至 400 μl 培养基中，轻轻摇晃混匀。</li>
	<li>将培养板置于 27°C 培养过夜。</li>
	<li>轻轻吹打数次以悬浮细胞。</li>
	<li>将细胞转移至离心管中，在室温下以 1000 rpm 离心 2 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入 1 ml 完全 L-15 培养基重悬细胞，室温下以 1000 rpm 离心 2 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>每个聚集体使用 2000–7000 个细胞。每个离心管中加入 200 μl L-15 培养基用于形成聚集体。</li>
	<li>将细胞（200 μl）分装至新的离心管中。</li>
	<li>在室温下以 1000 rpm 离心 2 分钟。</li>
	<li>在 27°C 培养 48 小时。</li>
</ol>
3. 聚集细胞的移植
<ol>
	<li>在蝾螈眼睛的角膜上做一个切口，并移除晶状体。</li>
	<li>移除晶状体后，将虹膜色素上皮（IPE）细胞团置于眼睛腹侧角膜组织下方。</li>
	<li>将蝾螈饲养一个月，使其再生晶状体。</li>
</ol>
4. 蝾螈眼睛的包埋
<ol>
	<li>取出植入了聚集体的蝾螈眼睛，并将其置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
	<li>在4°C条件下，用4%多聚甲醛固定至少4小时或过夜。</li>
	<li>在PBS中洗涤，4°C下30分钟。</li>
	<li>用0.85%生理盐水处理：4°C，30分钟。</li>
	<li>在生理盐水/乙醇（1:1）中洗涤：室温下15分钟。</li>
	<li>在70%乙醇中洗涤：室温下15分钟。重复一次。</li>
	<li>在85%和95%乙醇中分别于室温下洗涤，每次30分钟。</li>
	<li>在100%乙醇中洗涤：室温下30分钟。重复一次。</li>
	<li>在4°C下保存或继续后续操作。</li>
	<li>在100%二甲苯中洗涤：室温下30分钟。重复一次。</li>
	<li>用二甲苯/石蜡（1:1）处理：60°C，45分钟。</li>
	<li>用100%石蜡处理：60°C，20分钟。再重复两次。</li>
	<li>在包埋模具中进行包埋。</li>
</ol>
5. 切片
<ol>
	<li>使用切片机制备包埋眼球的15 μm切片。</li>
	<li>将眼球切片置于明胶包被的载玻片上，并放置在载玻片加热板上。</li>
</ol>
6. 染色
<ol>
	<li>将载玻片放入二甲苯中 10 分钟，重复一次。</li>
	<li>依次在 100%、95%、80%、70%、30% 乙醇中各水化 1 分钟。</li>
	<li>在去离子水中冲洗 1 分钟。</li>
	<li>在 PBS 中洗涤 15 分钟。</li>
	<li>在 PBST（含 0.2% Triton-X 100 的 PBS）中洗涤 15 分钟。</li>
	<li>在 PBS 中洗涤 15 分钟。</li>
	<li>置于封闭液（10% 山羊二抗）中 1 小时。</li>
	<li>置于一抗溶液中，4°C 孵育过夜。</li>
	<li>用 PBS 洗去一抗，洗涤 15 分钟。</li>
	<li>在 PBST 中洗涤 15 分钟。</li>
	<li>在 PBS 中洗涤 15 分钟。</li>
	<li>避光条件下，在二抗溶液中（PBS 中 1:100 稀释）孵育 2 小时。</li>
	<li>依次在 PBS、PBST 和 PBS 中各洗涤 15 分钟，然后封片。</li>
	<li>在荧光显微镜下观察载玻片。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
培养蝾螈虹膜细胞的这一方法已被用于研究背侧和腹侧虹膜色素上皮（IPE）细胞的再生潜能。此外，该方法还可用于研究参与蝾螈眼球晶状体再生机制的特定基因。当细胞培养两周后（图1），可对其进行基因转染，以检测这些基因在晶状体再生中的功能。尤其值得关注的是可能诱导腹侧虹膜发生转化的基因。由于腹侧虹膜细胞本身不能转分化为晶状体（图2），因此可通过该体系研究候选基因的诱导功能。过去，我们利用此技术已证实，当在视黄酸存在的情况下过表达six-3基因时，可观察到腹侧虹膜发生晶状体诱导现象6。在图3中可见，腹侧虹膜聚集体发育形成了一个完全成熟且分化的晶状体（箭头所示），与来自背侧虹膜的宿主晶状体（箭头）无差异。
<img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig1.jpg" alt="细胞培养的显微镜图像；细胞形态学的比较分析" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1a) 培养的背侧虹膜色素上皮细胞 体外 为期2周。b) 培养的腹侧虹膜色素上皮细胞 体外 持续2周。注意，此阶段背侧和腹侧虹膜细胞的色素沉着仍然存在。
<img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig2.jpg" alt="细胞结构分析的显微镜图像，突出显示差异性特征和细胞组分。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 培养的虹膜色素上皮（IPE）细胞的再生能力。a) 背侧IPE细胞聚集体诱导晶状体形成（箭头所示）。背侧虹膜诱导宿主晶状体形成（箭头），di：背侧虹膜，vi：腹侧虹膜，le：晶状体上皮，lf：晶状体纤维。b) 腹侧IPE细胞聚集体无晶状体诱导形成（箭头所示）。背侧虹膜诱导宿主晶状体形成（箭头）。
<img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig3.jpg" alt="寄生虫鉴定，显微图像；旋毛虫；组织切片分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
 图3。用six-3转染并经视黄酸处理的腹侧团块中诱导出晶状体。来自背侧虹膜的宿主晶状体诱导（箭头）。来自腹侧团块的晶状体诱导（箭头指示）。

<ol><li>Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regeneration in vertebrates.</a> Dev Biol. 221, 273-284 (2000).</li>
<li>Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newt%27s+eye+view+of+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A newt's eye view of lens regeneration.</a> Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).</li>
<li>Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+regeneration+at+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Eye regeneration at the molecular age.</a> Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).</li>
<li>Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+between+dorsal+and+ventral+iris+in+lens+producing+potency+in+normal+lens+regeneration+is+maintained+after+dissociation+and+reaggregation+of+cells+from+the+adult+newt%2C+Cynops+pyrrhogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).</li>
<li>Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+system+for+functional+gene+analysis+in+adult+amphibian+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection system for functional gene analysis in adult amphibian lens regeneration.</a> Develop Growth Differ. 43, 361-370 (2001).</li>
<li>Grogg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+inhibition-driven+regulation+of+six-3+underlies+induction+of+newt+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BMP inhibition-driven regulation of six-3 underlies induction of newt lens regeneration.</a> Nature. 438, 858-862 (2005).</li>
<li>Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+in+Newt+Lens+Regeneration%3A+Specific+Control+of+Proliferation+and+Evidence+for+miRNA+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miRNAs in Newt Lens Regeneration: Specific Control of Proliferation and Evidence for miRNA Networking.</a> PLoS One. 5, e12058-e12058 (2010).</li>
<li>Madhavan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14848-14853 (2006).</li>
<li>Maki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-type+linker+histone+B4+is+required+for+transdifferentiation+of+somatic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Oocyte-type linker histone B4 is required for transdifferentiation of somatic cells in vivo.</a> FASEB J. 24, 3462-3467 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本方案已建立一种 体外 研究蝾螈晶状体再生机制的系统。由于聚集物（无论是背侧还是腹侧）均忠实地遵循其 体内 再生过程中的行为，该技术可减轻在蝾螈中进行转基因所需的大量工作，并可用于功能获得和功能缺失实验 7,8,9 此外，可轻松使用生长因子处理类器官聚集体或整个虹膜，并按照本方案所述检测其效应。例如，已有研究利用该技术探讨了BMP信号通路的作用。 6.

<table><tbody><tr><td>卢戈氏碘液&amp;rsquo;s 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6146</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>分散酶</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 1:250</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>L-15 (Leibovitz 培养基)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4386</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>100x, 15160</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>制霉菌素（两性霉素B溶液）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>24孔胶原蛋白包被板</td><td>BD Biosciences</td><td>354408</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究蝾螈晶状体再生的虹膜色素上皮细胞培养系统

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

蝾螈和墨西哥钝口螈等蝾螈类动物具有再生多种失去身体部位的能力，例如四肢、带有脊髓的尾部、眼睛、大脑、心脏和下颌 1具体而言，蝾螈因其晶状体再生能力而具有独特性。在晶状体被移除后，背侧虹膜的虹膜色素上皮（IPE）细胞会转分化为晶状体细胞，并最终在约一个月内形成新的晶状体。 2,3这一再生特性在腹侧虹膜细胞中从未被观察到。通过移植虹膜细胞，可对其再生潜能进行研究。 体外 培养的IPE细胞。在培养过程中，首先从眼球中分离背侧和腹侧的虹膜细胞，并分别培养2周时间（图1）。这些培养的细胞被重新聚集成团，并移植回蝾螈的眼睛中。以往研究表明，背部聚集体仍保持形成晶状体的能力，而腹侧聚集体则不能形成晶状体，从而重现了 体内 过程图2) 4,5该系统在研究参与晶状体再生的基因和蛋白质功能方面，对于确定背侧和腹侧虹膜细胞的再生潜能具有重要价值。

在蝾螈中，晶状体始终通过背侧虹膜的虹膜色素上皮细胞（IPEs）转分化而再生。本文描述了一种培养蝾螈背侧和腹侧IPE细胞并将其植入蝾螈眼内的实验方法。随后通过组织切片和免疫组织化学技术对植入的细胞进行研究。

蝾螈和美西螈等蝾螈类动物具有再生多种丢失身体部位的能力，例如四肢、带有脊髓的尾部、眼睛、大脑等。

本实验的总体目标是培养虹膜色素上皮细胞，以研究晶状体再生。在蝾螈中，首先将蝾螈置于睡眠溶液中麻醉，然后摘除眼睛，即可实现这一目标。该实验步骤的第二步是从眼组织中分离虹膜色素上皮细胞，首先去除视网膜组织，随后将角膜虹膜碎片切成背侧和腹侧两半。然后将虹膜细胞从基质中分离，并在体外培养两周。经过两周的诱导后，IPE细胞聚集成团，随后被植入已进行优化处理的受体新个体中。经过一个月的愈合后，组织学结果显示背侧和腹侧虹膜色素上皮（IPE）细胞具有晶状体再生潜能。该方法在细胞培养和移植步骤中的可视化演示至关重要，因为这些步骤难以掌握，需要熟练掌握上百种显微解剖和手术技能。首先使用0.1%乙基氨基苯甲酸甲酯甲磺酸盐对至少七只裸鼠进行麻醉，然后用镊子和手术剪通过剪除眼睑及结膜的方式手术摘除眼球，随后切断视神经。立即将解剖好的眼睛转移至超净台，用卢戈氏乙醇消毒三秒钟，随后在无钙、无镁的Hank溶液中清洗两次。再将眼睛转移至新鲜的Hank溶液中，继续进行解剖操作。使用手术刀在眼球上切开一个切口，然后用剪刀沿角膜边缘剪开。取出晶状体，并将残留的视网膜组织连同巩膜一并剪除。使用15号手术刀将虹膜角膜复合体转移至培养皿中，并置于新鲜的Hanks溶液内。将复合体分离为背侧和腹侧两部分。背侧和腹侧虹膜可通过巩膜背侧存在的黑色斑点以及腹侧虹膜上的V形切口进行区分。分离腹侧虹膜与背侧虹膜。将虹膜组织碎片收集至含有1毫升L-15溶液的35毫米培养皿中。背侧和腹侧两部分应分别置于不同的培养皿中。现在向培养皿中加入150微升的dispa溶液，并在27摄氏度下孵育两小时。以从基质中收集IPE细胞。借助镊子，轻轻剥离所有收集到的组织碎片中的IPE细胞。接下来，将IPE细胞转移至1.5毫升离心管中，在室温下以1000 ×g离心2分钟，弃去上清液。用1毫升Hanks溶液重悬沉淀，再次离心以分离细胞。弃去Hanks溶液，重悬沉淀。在1毫升1:250的胰蛋白酶溶液中，于27摄氏度孵育2小时，洗涤细胞后离心并去除胰蛋白酶。加入1毫升L-15溶液，再次离心，重复洗涤一次，更换为800微升新鲜L-15溶液，轻轻吹打使细胞重悬。随后将细胞接种至经胶原蛋白包被的24孔板中。从七个 Ns 中通常可获得四孔背侧细胞和四孔腹侧细胞。将培养皿在 27 摄氏度下孵育两周，持续两周。如图所示，IPE 可通过基因转染以研究其在晶状体再生中的功能。此为两周的腹侧IPE细胞培养，其形态与背侧细胞相同。请注意，背侧和腹侧虹膜细胞在此阶段仍保留色素。在植入IPE细胞之前，必须通过在400微升新鲜培养基中加入20微升dyse使细胞聚集，轻轻摇晃培养板，并将细胞在27摄氏度的培养箱中放置过夜。第二天，用轻柔的吹打混悬细胞，然后将细胞转移至1.5毫升离心管中。通过离心洗涤细胞，并用1毫升L-15培养基替换上清液。重复此步骤两次。取10 µL细胞悬液，采用标准方法计算细胞数量。计算完成后，将3000至5000个细胞用200微升L-15培养基重悬，形成单个聚集体。随后离心收集细胞，并在27摄氏度下孵育48小时。此时细胞可植入受体动物体内。首先将成年蝾螈置于麻醉溶液中，直至其停止活动。然后使用手术刀片在眼球角膜上切开一个小口。接着用镊子取出晶状体。摘除晶状体后，将IPE细胞团块放置在眼球腹侧角膜组织下方。现在将蝾螈放回另一个容器中，使其自行愈合。在此期间，需小心处理蝾螈，避免损伤正在愈合的组织。移植的细胞需要一个月时间再生形成新的晶状体。一个月后，取出植入了细胞聚集体的新眼，并对组织进行固定。采用标准的脱水流程，将固定后的组织包埋于适合切片的模具中，切成15微米厚的切片，并进行适当的染色。将团块植入慢病毒转导的新眼球后，来自背侧虹膜色素上皮（IPE）细胞的团块可诱导新晶状体的形成。在植入腹侧团块的眼中，也可观察到由宿主背侧虹膜诱导的晶状体形成。当团块由腹侧IPE细胞制备时，未观察到晶状体诱导现象；但在视黄酸存在条件下过表达six3基因时，腹侧团块则可观察到晶状体诱导。此外，在眼睛发育完成后，还可观察到由背侧虹膜诱导产生晶状体的现象。该技术为晶状体再生领域的研究人员探索不同基因在新研究方向中的作用奠定了基础。

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关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型

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