Name: 一个简单的悬滴细胞生成三维球体文化协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 学习使用悬滴法快速生成三维细胞球体，通过24至48小时培养形成组织样聚集体。该方法可评估细胞间相互作用差异，为细胞生物学和组织工程研究提供高效工具。

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作者感谢贾东轩博士提供的技术支持。本文中部分图片是与普林斯顿大学分子生物学系马尔科姆·S·斯坦伯格博士合作完成的。作者还感谢美国国防部前列腺癌研究项目（资助号 PC-030482 和 PC-991552）以及美国国家癌症研究所/国立卫生研究院（资助号 R01CA118755）的慷慨支持。

1. 单细胞悬液的制备
<ol>
	<li>贴壁细胞培养至90%融合度后，应用PBS冲洗单层细胞两次。充分吸干液体后，加入2 ml（100 mm培养皿）0.05%胰蛋白酶-1 mM EDTA溶液，于37°C孵育至细胞脱落。加入2 ml完全培养基终止消化反应，并用5 ml移液管轻柔吹打混悬液，直至细胞完全悬浮。将细胞转移至15 ml锥形离心管中。</li>
	<li>加入40 μl 10 mg/ml的DNA酶储备液，室温孵育5分钟。短暂涡旋振荡后，以200 ×g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用1 ml完全组织培养基洗涤细胞沉淀。重复一次洗涤步骤，然后将细胞重悬于2 ml完全组织培养基中。</li>
	<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并将细胞浓度调整至2.5 × 106 个细胞/ml。本演示中使用了BioRad TC10自动细胞计数仪。</li>
</ol>
2. 悬滴的形成。
<ol>
	<li>从一个60 mm的组织培养皿中取下盖子，并在皿底加入5 ml PBS，作为保湿室。</li>
	<li>将盖子倒置，使用20 μl移液器在盖子底部滴加10 μl液滴。确保液滴之间保持足够距离，互不接触。每个培养皿中至少可放置20个液滴。</li>
	<li>将倒置的盖子盖在含有PBS的底部培养皿上，置于37°C、5% CO2、95%湿度条件下孵育，每日观察液滴情况，持续孵育直至细胞片层或细胞聚集体形成。可使用体视显微镜评估聚集体的形成。</li>
	<li>一旦形成细胞片层，即可将其转移至含有3 ml完全培养基的圆底玻璃摇瓶中，并在37°C、5% CO2条件下于摇水浴中振荡孵育，直至类球体形成。</li>
</ol>
3. 注意事项
<ol>
	<li>根据细胞大小，可能需要向上或向下调整浓度。</li>
	<li>可在悬滴形成前，使用膜嵌入型荧光染料对细胞进行染色。</li>
	<li>两种不同类型的细胞可在形成悬滴前用不同荧光染料分别标记，并以1:1（或其他比例）混合。这些细胞可以是癌细胞和间质细胞、胚胎组织，或经基因工程改造具有特定黏附特征的细胞。</li>
	<li>可使用0.05%胰蛋白酶/2 mM钙离子将细胞从组织培养皿上解离，以保持钙黏蛋白功能。</li>
	<li>根据实验需求，可测量片状结构的尺寸，或利用细胞聚集体进行力学测试，或进行生物化学或分子分析。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
单层或球状体的形成通常在24小时内发生，但具体时间可能因细胞类型而异。图1显示了未经处理的前列腺癌MAT-LyLu（MLL）细胞在悬滴培养中孵育18小时后拍摄的图像（图1A），以及经25 μm MEK抑制剂PD98059处理后的细胞图像。请注意，MEK抑制剂（MEKi）处理会导致细胞单层显著收缩。收缩程度可通过测量10–20个（或更多）悬滴的大小，并比较不同处理组之间的平均尺寸进行量化。我们通常使用ImageJ软件分析图像：首先对每幅图像进行阈值设定，然后将图像转换为二值模式，接着进行颗粒分析，以获得以像素为单位的总图像面积。该数值可轻松转换为平方微米。图2展示了未经处理与MEKi处理的MLL细胞的尺寸比较。如图所示，通过Student's t检验比较，MEKi处理显著减小了细胞单层的尺寸（P&lt;0.0001）。在该比较中，分别测量了未经处理和经处理细胞的10个聚集体。图3显示了一个鸡胚肝脏球状体，在悬滴培养中培养24小时后，再在摇床培养箱中培养2天形成。
悬挂液滴实验也可进行改进，以包含多种细胞类型，从而揭示其空间排列方式。例如，可分离鸡胚肝脏细胞，用荧光膜嵌入染料进行染色，并与用不同荧光标记物染色的鸡胚心细胞混合。图4A显示，肝脏细胞与心细胞并非保持混合状态，而是倾向于彼此“分离”，形成一种“球中球”结构，其中心细胞被肝脏细胞包裹。这种结构可通过肝脏细胞与心细胞之间细胞间黏附性的差异来解释。这一概念被归纳为差异黏附假说，该假说已被用于解释两栖类3和硬骨鱼类4胚胎中胚层组织之间的细胞分选行为、胰岛细胞的组织结构5，以及两种在其他所有方面均相同、仅在钙黏蛋白表达水平上存在差异的细胞群体之间的细胞分选现象（6及图4B）。该结果对于阐明如何通过调控细胞群体间简单的黏附性差异来构建器官结构（例如胰岛5）具有重要意义。
 <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig1.jpg" alt="细胞聚集对比，显微镜图像；A：大聚集体，B：用于研究的小聚集体。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 细胞在悬滴培养中孵育18小时后的图像，分别在无（A）或含有25 μm MEK抑制剂PD98059（B）的条件下。图像使用Nikon Eclipse TE 300落射荧光显微镜和Photometrics CoolSnap ES数字相机拍摄。
 <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig2.jpg" alt="柱状图比较MLL细胞与MLL+MEKi处理组的聚集体大小，用于统计分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. MEK抑制剂诱导大鼠前列腺癌MLL细胞聚集体压缩的定量分析。将未处理和经MEKi处理的MLL细胞进行悬滴培养，孵育18小时后，按照上述方法测定聚集体大小。聚集体大小的统计分析采用Student t检验。星号表示未处理组与MEKi处理组之间聚集体大小存在统计学显著差异（P&lt;0.0001），提示MEKi处理可导致聚集体显著缩小且更为致密。
 <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig3.jpg" alt="静态平衡；球体在边缘；物理图示；稳定性；平衡分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 将鸡胚胎肝细胞在悬滴培养中孵育18小时，随后在培养箱/摇床中培养48小时后形成的类球体。该图像使用尼康SMZ800体视显微镜和索尼Black CCD相机拍摄。
 <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig4.jpg" alt="荧光显微镜图像、细胞结构、发射分析、颜色编码结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 悬滴培养揭示了不同类型细胞之间的分选行为。在A图中，鸡胚肝细胞用PKH-2膜嵌入染料染色，并与等比例的PKH-26染色的鸡胚心肌细胞混合。在B图中，两个转染了N-钙黏蛋白（N-cadherin）的L细胞克隆（LN4和LN2a），其表面N-cad表达比例为2.4:1，也分别用荧光膜嵌入染料PKH-2和PKH-26（Sigma-Aldrich）染色，等比例混合后进行悬滴培养7。培养18小时后，将细胞片转移至摇瓶中，继续孵育48小时。聚集体用含2%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液固定，并使用连接于Nikon Optiphot-2显微镜的BioRad MRC600扫描激光共聚焦显微系统观察。采集绿色和红色通道的光学切片，并使用配备Vital Images Voxel View Ultra成像软件的Silicon Graphix Crimson VGX工作站对两个通道赋予伪彩色并合并图像，以显示所形成的解剖结构。（A）通过聚集体的共聚焦光学切片，显示肝细胞（伪彩色为蓝色）包裹心肌细胞（伪彩色为黄色）的结构（引自8）。（B）通过聚集体的共聚焦光学切片，显示低表达N-钙黏蛋白的细胞（红色）包裹高表达N-钙黏蛋白的细胞（绿色）的结构（引自6）。

<ol><li>Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+with+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell interactions with three-dimensional matrices.</a> Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).</li>
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</ol>

无利益冲突声明。

研究表明，与刚性的二维（2D）培养系统相比，在三维（3D）环境中培养细胞会产生不同的细胞形态和信号传导9例如，成纤维细胞接种的胶原凝胶表明，成纤维细胞在三维环境中的形态与在二维条件下观察到的形态显著不同 10,11类似地，三维培养可诱导乳腺上皮细胞产生组织特异性的分化。三维培养系统已被用于区分正常细胞与恶性细胞，并且在适当刺激条件下，已被证明能够支持转化细胞逆转为正常表型。12,13正确的组织结构对于远端稳态的维持、凋亡的抑制以及CID-9乳腺上皮细胞分化表型的保持也至关重要。 14多细胞耐药性在小鼠EMT-6乳腺癌细胞中也已被证实存在 体外 仅当细胞在三维构型中培养，而非在传统的单层培养中时15这些及其他数据促使人们提出这样的观点：“在高等生物中，功能的基本单位既不是基因组，也不是单个细胞，而是组织本身”。 16. 生成三维球状体的其他方法还有很多，包括使用模拟微重力培养箱 17，以及微模压非粘附性水凝胶 18,19然而，与这些方法不同，本文所...

<table><tbody><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>Bio-Rad</td><td>TC10</td><td></td></tr><tr><td>带 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气体盖的摇床水浴箱</td><td>Labline Instruments</td><td>3540</td><td></td></tr></tbody></table>

一种简单的悬滴细胞培养法用于生成三维球状体

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

对细胞间黏附和细胞-基质黏附的研究传统上是在贴附于刚性基质的单层培养物上进行的。然而，组织内的细胞通常被包裹在紧密堆积的组织团块中，细胞与多个邻近细胞以及细胞外基质组分建立紧密连接。因此，三维组织内细胞所处的化学环境和所受的物理力，与单层培养细胞所经历的条件有本质区别。这已被证明会显著影响细胞的形态和信号传导。已有多种方法被开发用于构建三维细胞培养体系，包括将细胞包埋于胶原凝胶1或生物材料支架2中。这些方法虽然有用，但并不能重现正常组织中所见的紧密直接的细胞-细胞黏附结构，而更接近于单个细胞松散分布于细胞外基质产物构成的三维网状结构中的培养系统。本文中，我们描述一种简便的方法：将细胞置于悬滴培养体系中，在生理条件下孵育，直至其形成真正的三维球状体，其中细胞彼此直接接触，并与细胞外基质组分接触。该方法无需特殊设备，且可灵活调整，适用于加入极微量的任何生物学试剂，以研究其对细胞-细胞或细胞-细胞外基质相互作用的影响。该方法也可用于共培养两种（或多种）不同细胞群体，以阐明细胞-细胞或细胞-细胞外基质相互作用在决定细胞间空间关系中的作用。细胞-细胞黏附和细胞-细胞外基质黏附是研究胚胎发育、恶性侵袭中肿瘤-间质细胞相互作用、伤口愈合以及组织工程应用的基础。这一简便方法将为生成类组织的细胞聚集体提供手段，用于在生理相关模型中进行生物力学性质测定，或分子与生化分析。

我们介绍一种简单、快速地生成类三维组织球体的方法，及其在量化细胞间相互作用差异方面的潜在应用。

细胞间黏附和细胞-基质黏附的研究传统上是在附着于刚性基质的单层培养细胞上进行的。细胞……

本实验的目的是生成类似类固醇的三维组织。首先收获培养的细胞，然后制备单细胞悬液。接着将细胞悬液滴加到组织培养皿倒置的皿盖底面。然后将盖子倒置在水合室上。最后一步是将悬滴培养24至48小时，以使聚集体形成。随后可将聚集体转移至摇水浴中，继续培养最多五天。最终，可以通过压缩实验、组织表面张力对称性分析或表观荧光显微镜观察，获得能够显示聚集体黏附性差异或细胞分选的结果。与现有方法（例如传统的二维组织培养）相比，该技术的主要优势在于，三维培养的细胞更接近组织环境中细胞所经历的细胞间相互作用。我将演示这一方法，向您展示其操作之简便，甚至实验室负责人也能轻松完成。开始本实验时，收集贴壁生长至90%融合度的细胞。首先，吸除培养基，并用PBS冲洗细胞层两次。然后吸除PBS，再加入2毫升含0.05%胰蛋白酶的EDTA溶液至单层细胞上。将培养板放入37摄氏度的组织培养孵育箱中孵育，直至细胞脱落。随后，从孵育箱中取出培养板并终止消化。加入2 mL完全培养基。使用5毫升移液管吹打混合物，直至细胞完全悬浮。然后将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。向细胞悬液中加入40 µL浓度为10 mg/mL的DNA溶液，并在室温下孵育5分钟。轻轻涡旋混匀细胞悬液，然后在200 × g条件下离心5分钟。离心完成后，吸除上清液并弃去，再将沉淀重悬于1 mL完全培养基中以进行洗涤。重复离心操作，并将沉淀重新悬浮于1 mL完全培养基中。接下来，使用自动细胞计数器或血细胞计数板进行细胞计数。用培养基调整细胞悬液，使其最终浓度为每毫升 2.5 × 10⁶ 个细胞。然后进行悬滴的制备。通过从60毫米组织培养皿中取下盖子，并向皿底加入5毫升PBS，制备一个水化室。将培养皿的盖子倒置，在盖子的底面用移液枪滴加最多20个10微升的细胞悬液液滴。确保液滴之间保持足够距离，避免相互接触。轻轻将含有滴液培养物的盖子放回到盛有 PBS 的培养皿底部。将培养板放入组织培养箱中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 95% 湿度条件下孵育过夜。每天观察液滴，继续培养直至形成细胞片层或细胞聚集体。一旦形成细胞片层或细胞聚集体，立即将其转移至含有 3 mL 完全培养基的圆底玻璃摇瓶中。将含有细胞片层或细胞聚集体的摇瓶置于摇动水浴中进行培养。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养约24小时，直至在解剖显微镜下可观察到类固醇的形成。一旦类固醇形成，可根据书面实验方案中所述步骤，定量分析实验干预对类固醇形成的影响。此外，此时可利用荧光显微镜观察先前加入的任何荧光染料在膜中的嵌入情况。这幅明场显微镜图像展示了采用悬滴法培养18小时后，大鼠前列腺癌MLL细胞的聚集情况。该图像显示了通过悬滴法培养18小时后形成的第二个MLL细胞聚集体。这些细胞在含有25 µM MEK抑制剂PD 98059的条件下培养，结果形成了明显更为致密的细胞聚集体。此处展示了经

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科研

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生物工程

一个简单的悬滴细胞生成三维球体文化协议

类球体是一种三维细胞培养模型，与二维细胞培养单层模型相比，能够更准确地模拟细胞的生存环境。在本示例实验方案中，我们将看到科研人员利用结直肠癌细胞系生成类球体，并通过活细胞成像技术追踪类球体的生长过程。...

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