一种简单的悬滴细胞培养法用于生成三维球状体

本实验的目的是生成类似类固醇的三维组织。首先收获培养的细胞，然后制备单细胞悬液。接着将细胞悬液滴加到组织培养皿倒置的盖子的底面。

然后将盖子倒置在水合室上。最后一步是将悬滴孵育24至48小时，以使聚集体形成。随后可将聚集体转移至摇水浴中，继续孵育最多五天。

最终，可以通过压缩实验、组织表面张力对称性分析或表观荧光显微镜获得结果，以显示聚集体黏附性或细胞分选方面的差异。与现有方法（例如传统的二维组织培养）相比，该技术的主要优势在于，三维培养的细胞更接近组织环境中细胞所经历的细胞间相互作用。我将演示这一方法，向您展示其操作非常简单，甚至实验室负责人也能轻松完成。

开始本实验时，收集贴壁细胞，细胞融合度约为90%。首先，吸出培养基，并用PBS冲洗细胞层两次。然后吸去PBS，再用移液器将2毫升含0.05%胰蛋白酶的EDTA溶液加入单层细胞中。

将培养板放入37摄氏度的组织培养箱中孵育，直至细胞脱落。随后，从培养箱中取出培养板并终止消化。加入2 mL完全培养基。

使用5毫升移液器吹打混合物，直至细胞完全悬浮。然后将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。向细胞悬液中加入40 µL浓度为10 mg/mL的DNA溶液，并在室温下孵育5分钟。

短暂涡旋混匀细胞悬液，然后在200 × g条件下离心5分钟。离心完成后，吸除上清液并弃去，再将沉淀重悬于1 mL完全培养基中以进行洗涤。重复离心操作，并将沉淀重新悬浮于1 mL完全培养基中。

接下来，使用自动细胞计数器或血细胞计数板进行细胞计数。用培养基调整细胞悬液，使其最终浓度为每毫升2.5 × 10⁶个细胞。然后进行悬滴的制备。

通过取下60毫米组织培养皿的皿盖，并向皿底加入5毫升PBS，制备一个水化室。将皿盖倒置，在其内表面滴加最多20个10微升的细胞悬液液滴。确保各液滴之间保持足够间距，避免相互接触。

轻轻将含有滴培养物的盖子放回到含有 PBS 的培养皿底部。将培养板放入组织培养箱中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 95% 湿度条件下孵育过夜。

每天观察液滴，继续培养直至形成细胞片层或细胞聚集体。一旦形成细胞片层或细胞聚集体，立即将其转移至含有 3 mL 完全培养基的圆底玻璃摇瓶中。将含有细胞片层或细胞聚集体的摇瓶置于摇动水浴中进行培养。

在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养约24小时，直至在解剖显微镜下可观察到类固醇的形成。一旦类固醇形成，可根据书面实验方案中所述步骤，对实验干预处理对类固醇形成的影响进行定量分析。此外，此时可利用荧光显微镜观察先前加入的任何荧光染料在膜中的嵌入情况。

这幅明场显微镜图像展示了大鼠前列腺癌MLL细胞在采用悬滴法培养18小时后形成的细胞聚集体。该图像显示了MLL细胞经悬滴法培养18小时后形成的第二个聚集体。这些细胞在含有25微摩尔MEK抑制剂PD 98059的条件下培养，结果形成了结构明显更为紧密的细胞聚集体。

此处展示了经MEK抑制剂处理的MLL悬滴培养物的聚集体大小与未处理对照组聚集体大小之间的差异。星号表示未处理组与MEK抑制剂处理组之间存在统计学显著差异（P小于0.0001），该结果通过学生t检验确定，表明MEK抑制剂处理会导致聚集体显著更小且更为致密。

该图像使用尼康 Smz 800 体视显微镜拍摄，展示了一种类固醇结构，该结构通过将鸡胚肝细胞在悬滴培养中孵育 18 小时，随后在 37°C 摇动水浴中培养 48 小时而形成。该共聚焦显微镜图像展示了当特定细胞群体在悬滴法中共培养时发生的细胞分选行为。在进行悬滴培养之前，鸡胚肝细胞用 PKH2 膜间染料进行染色，以及鸡胚。

心肌细胞用PKH 26染色。将细胞悬液混合后进行悬滴培养，先培养18小时，随后在37摄氏度摇动水浴中孵育48小时。

从光学切片可以看出，呈黄色的心脏细胞被肝脏细胞包裹。此处伪彩为蓝色的是两种Nardi细胞及转染了L细胞克隆，其表面表达NCA。以2.4比1的比例，用荧光膜染料PKH2和PKH26等比例混合染色后，像之前一样以悬滴法进行培养。

在此示例中，高表达 cadian 的细胞（伪彩为绿色）被低表达 en cadian 的细胞（伪彩为红色）所包围。一旦掌握，若操作得当，该技术可在 30 分钟或更短时间内完成。