用于创伤性脑损伤研究的神经元细胞冲击性加压

本实验的总体目标是通过施加脉冲式加压并观察培养的脑细胞，以研究创伤性脑损伤。首先，使用维甲酸诱导培养细胞发生神经元分化；随后，将神经元细胞置于基于ksky bar的细胞加压装置中，暴露于与爆炸所致创伤性脑损伤相关的强度和持续时间的脉冲压力下。

最后，对细胞进行分子生物学检测，以评估细胞损伤及创伤性脑损伤的可能机制。显微镜检查结果显示，在脉冲式加压达到2兆帕压力强度且持续时间为0.7毫秒时，神经元细胞发生死亡，并伴有神经突轴突结构的丧失。与现有的流体冲击等方法相比，该技术的主要优势在于不存在负压阶段，且时间持续过程得到良好控制。

该方法有助于回答创伤性脑损伤（TBI）领域的关键问题，例如神经细胞死亡或损伤的阈值如何随脉冲压力的强度、持续时间及加载波形而变化。尽管本方法迄今在我们课题组主要用于研究爆炸所致的创伤性脑损伤，但它也可用于其他类型的创伤性脑损伤研究，例如撞击所致的创伤性脑损伤。该实验操作将由陈方教授实验室的研究生 Matthew 和我实验室的技术员 li ha 共同演示。

本实验采用一套Ksky支架，将其设置为细胞加压装置。该装置由两根六米长的铝合金杆组成，通过成排对齐的黄铜轴承悬挂，并连接一个体外细胞加压室。细胞加压室位于两根杆之间，由活塞缸结构构成。

圆柱体的腔体底部钻有一个小孔，在安装细胞样品时可用于排出空气和多余液体。活塞与杆采用相同的管材制成，并缠绕两到三层聚四氟乙烯胶带。端盖通过两颗小型不锈钢螺钉固定玻璃盖玻片。

本实验采用人源神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞。然而，该方案适用于多种细胞培养模型。将细胞以每平方厘米 3000 个细胞的密度接种于直径为 18 毫米的玻璃盖玻片上。

在孵育细胞期间，通过在补充的DMEM培养基中添加10 µM视黄酸，持续七天，以诱导细胞分化，每两天更换一次培养基。第七天时，细胞将呈现出发育良好的神经突轴突结构，即可进行加压处理。使用高压灭菌器对所有加压室部件进行灭菌，并在组装加压室时将其置于紫外光下保存。

在超净工作台中，确保腔室的通气螺钉松散地旋紧在通气孔中。在腔室底部，加入新配制的温热培养基。然后将细胞面向外，将培养有细胞的玻片旋紧在活塞盖上，小心地将活塞装入腔室的空腔中。

取下放气螺钉，将放气口向上倾斜，并将活塞推入腔室至先前确定的参考线位置。这样可使加压腔室内保留约六毫米的液体深度。避免引入气泡，对放气螺钉进行消毒后重新装回，以确保腔室密封不漏水。

在静态负载下，腔室不应发生泄漏。重置 Ksky 杆系统。将重物移回原始位置，并重新安装锁定螺栓。

锁定螺栓施加的夹紧力可防止入射杆在销钉断裂前发生移动。使用液压千斤顶将新的锁定螺栓拧紧至约200 psi。使用剪式千斤顶将入射杆的预加载段压缩至略高于目标压力的水平，然后略微回松，以使JAK螺钉完全产生摩擦阻力。现在设置数据采集系统，因为加压过程大约持续一毫秒。

使用2000欧姆应变片构成惠斯通电桥电路，设置采样频率为1兆赫兹。在入射杆处将电压设置为45伏。安装细胞腔室时，使活塞朝向透射杆。

将细胞室置于由小型实验剪刀架支撑的V型槽中，并与两根杆对齐。在每个接触面轻轻涂抹润滑脂，并通过轻柔摩擦使萌发表面之间的空气排尽。此时系统已准备就绪。

启动数据采集系统，并通过快速泵动液压夹具驱动器进行测试。这将迫使锁定螺栓断裂，导致夹具分离并将压力波传递至细胞。测试结束后，在生物安全柜中将载玻片从腔室中取出，并继续评估细胞行为。

随着操作经验的积累，该装置每小时可对约九个细胞培养载玻片加压。在分析读数时，透射条形信号的起始位置可能会出现气泡干扰误差，但在本演示中未出现此类情况。

如果透射条足够长，则最重要的数据应从第一次扰动开始，到测量显示负压处结束，该电压读数通过应变片分析与细胞所受应力成正比。透射脉冲的持续时间可能短于入射脉冲。如果细胞加压腔内的液体中困住了一个小气泡，则透射脉冲的幅度可能不会超过入射脉冲，但在卸载前应具有足够长的平台期。

否则，密封腔室内可能困住较大的气泡，或者组件与压杆未对齐。加压后，可立即观察细胞，或进一步孵育以供后续检测。将加压处理的细胞与未加压但其他处理相同的腔室对照细胞进行比较，利用光学显微镜在不同孵育后时间点评估神经突长度的变化。

肌动蛋白免疫荧光染色可用于评估细胞骨架的变化。此外，微管相关蛋白2的抗体也可用于观察关键神经元标志物之一的变化。

若需评估脉冲式加压对神经元及凋亡相关基因表达的影响，可采用常规分子生物学技术，如逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）。可通过多个相同加压条件下的细胞样本收集足够量的细胞裂解液，用于免疫印迹分析。在本示例中，ksky bar装置成功地对培养的神经元细胞施加了约2兆帕水平的单脉冲型瞬时压力，持续时间约为0.7毫秒，如光学显微镜图像所示。与未加压的对照细胞相比，经2兆帕脉冲压力处理的SHSY-5Y人神经元细胞表现出明显的神经突轴突断裂现象。

进行该操作时，您应始终以这种方式持握流体加压室，而绝不能像这样持握，否则会在加压后使细胞承受负压。该技术为神经科学领域的研究人员探索在可控前列腺加压条件下创伤性脑损伤的细胞机制铺平了道路。感谢陆军UNL创伤力学中心提供的经费支持。