Name: 心电图心脏风险评价指标和乌头碱诱发大鼠心律失常的易感性继癫痫持续状态的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学习使用心电图技术评估癫痫持续状态后大鼠心脏电生理功能及心律失常易感性的方法。该技术通过颈静脉导管植入和电极记录，为研究癫痫相关心脏风险提供重要实验手段。

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本研究获得了公民癫痫研究联合会（CURE）向 SLB 提供的资助。

1. 构建所需材料
 <ol>
	<li>颈静脉导管由一段 PE-50 聚乙烯管（100 mm）制成，一端斜面处理，然后充满肝素盐水（50 U 肝素/mL 生理盐水）。</li>
	<li>心电图记录电极由两根 100 mm 长的绝缘银线（30AWG）制成。两根导线的一端去绝缘层后焊接到微型连接器上，绝缘层绞合形成第三根用作接地的导线。导线远端 5 mm 的绝缘层被剥离并丢弃。</li>
</ol>
2. 植入颈静脉导管
<ol>
	<li>通过腹腔注射乌拉坦（1.2 g/kg）对动物进行麻醉。</li>
	<li>定期（每10分钟）通过评估足底回缩反应和/或眼反射来检查麻醉深度。必要时追加麻醉剂。</li>
	<li>当动物达到适当的麻醉平面后，剃除从锁骨至下颌的右侧颈部毛发。</li>
	<li>在颈动脉上方的皮肤做一纵向切口（10–15 mm），并打开切口。</li>
	<li>采用钝性分离技术，分开下方肌肉组织，以定位并分离右侧颈外静脉。</li>
	<li>将两根外科丝线（#2）置于颈外静脉下方，分别位于切口的头端和尾端。结扎头端结扎线，以阻断静脉血流。</li>
	<li>牵拉尾端结扎线，将血管抬离下方组织后做一小切口。然后插入已充满肝素（50 U/ml 生理盐水）的PE-50聚乙烯导管（长度100 mm）的斜面端，并将导管尖端向前推进约8 mm，到达右心房水平。</li>
	<li>为固定导管，将尾端结扎线围绕血管和导管一并结扎。最后使用伤口夹或缝线关闭切口。</li>
	<li>在导管植入过程中，暴露的导管末端应使用止血钳夹闭或用塞子堵住，以防止在连接输液泵前发生血液反流。</li>
</ol>
3. 植入CG电极
<ol>
	<li>将动物仰卧放置，并剃除胸部毛发。</li>
	<li>为放置电极，在胸部的右上象限和左下象限各做一个纵向切口（约 10 mm），分离切口处的皮肤以暴露胸肌。</li>
	<li>将银丝电极暴露的 5-mm 尖端之一缝合固定于每个暴露区域的胸肌中，并将接地电极置于皮下。</li>
	<li>使用伤口夹闭合切口，并将微连接器插入记录设备。</li>
	<li>用毛巾松松包裹动物，以在操作过程中维持其体温。</li>
</ol>
4. 记录心电图
<ol>
	<li>使用 Powerlab 数据采集系统和 Macintosh 计算机或类似硬件/软件进行记录（放大倍数 50 倍；滤波范围 1-1000 Hz）。</li>
	<li>平衡 20-30 分钟后，记录 20 分钟心电图（ECG）。</li>
</ol>
5. 诱发心室性心律失常
<ol>
	<li>将颈静脉导管连接至置于可编程输液泵中的远程注射器。</li>
	<li>以恒定速率开始乌头碱输注，剂量为 5 ug/kg/min，持续 7 分钟。</li>
	<li>出现心室颤动或输注结束后，采用批准的程序处死动物。</li>
</ol>
6. 心电图分析
<ol>
	<li>QT 间期代表心室电活动的总持续时间。图 1 显示了模型心电图记录及 QT 间期的持续时间。计算在 20 分钟记录期间内、连续五分钟时间段中所有记录心跳的 Q 波起始至 T 波终止之间的平均时间。</li>
	<li>为校正心率差异对 QT 间期的影响（QTc），采用 Bazett 公式：QTc = QT / (RR)½，其中 RR 为心跳间期的平均值。RR 间期的计算基于分析期间连续 Q 波之间的时间间隔。</li>
	<li>QT 离散度（QTd）通过计算每只动物记录中最大 QT 间期与最小 QT 间期之差得出。</li>
</ol>
7. 心率变异性分析
<ol><li>用于自动计算心率的时间域和/或频域变异性的软件程序（例如 LabChart 7，ADInstruments 公司）可分析在分析期间获得的 RR 间期变异性。</li></ol>
8. 心室心律失常易感性的分析
<ol><li>计算从乌头碱输注开始至首次出现室性期前收缩（PVC，图2，面板1）、室性心动过速（VT，图2，面板2）和心室颤动（VF，图2，面板3）的潜伏期。</li></ol>
9. 代表性结果
图3展示了对照组大鼠以及在测试前一周经历癫痫持续状态（SE）的大鼠在频域内心率变异性（HRV）的一项指标（RR间期标准差的均方根，RMSSD）。该HRV指标反映副交感神经对心脏功能调控的变化26，在癫痫持续状态后显著降低。图4显示，在癫痫持续状态后两周，校正QT间期（QTc，图A）和QT离散度（QTd，图B）均显著增加27。综合来看，这些数据表明癫痫持续状态会增加室性心律失常的风险。这一预测得到了以下发现的支持：在本研究中，诱发实验性心律失常（包括室性早搏PVC、室性心动过速VT和心室颤动VF）所需的乌头碱输注时间在癫痫持续状态后的大鼠中显著缩短（图5）27。
<img src="/files/ftp_upload/2726/2726fig1.jpg" alt="心电图示意图，QT间期测量，心脏周期PQRST各时相。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 1"> 图1. 正常心跳的模型心电图记录，显示P波、QRS波群和T波。QT间期为两条虚线之间的时间间隔。
<img src="/files/ftp_upload/2726/2726fig2.jpg" alt="心电图波形，三通道，心脏活动分析，标注的峰值 A、B、C、D，测量图表。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 图 1) 室性期前收缩（PVC）是发生在正常心跳（A）之间的心室独立收缩（B），其记录特征为缺乏 P 波和 T 波。 
图 2 室性心动过速（VT）是一系列连续发生的多个心室收缩（C），其间无正常的正常心跳（A）插入。 
图 3 心室颤动（VF）表现为无明显节律，且 QRS 波与 P 波之间无关联（D）。
<img src="/files/ftp_upload/2726/2726fig3.jpg" alt="RMSSD分析柱状图，对照组与SE组的比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 对照组大鼠与在测试前1周经历癫痫持续状态（SE）的大鼠心搏间期标准差的均方根（RMSSD；msec）比较。**p&lt;0.01，与对照组相比。
<img src="/files/ftp_upload/2726/2726fig4.jpg" alt="QT间期比较；柱状图；QTc、QTd测量值；对照组与癫痫持续状态组结果对比" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 4"> 图4. 从对照组动物（Cont）和在测试前两周经历癫痫持续状态（SE）的大鼠获得的心电图记录中计算出的平均校正QT间期（A部分）和QT离散度（B部分）。*p&lt;0.05，与对照组比较。（Metcalf 等，Am. J. Physiol. Heart and Circ, 2009, Am Physiol Soc，经27许可使用）。
<img src="/files/ftp_upload/2726/2726fig5.jpg" alt="潜伏期比较柱状图；对照组与癫痫持续状态组在室性早搏、室性心动过速、心室颤动中的比较；实验结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 图 5. 对照组动物（Cont）与测试前两周经历癫痫持续状态（SE）的大鼠在开始乌头碱输注至首次出现室性早搏（PVC）、室性心动过速（VT）和心室颤动（VF）之间的潜伏期（秒）。*p&lt;0.05，**p&lt;0.01，与对照组比较。（Metcalf 等，Am. J. Physiol. Heart and Circ, 2009, Am Physiol Soc，经27许可使用）。

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</ol>

我们没有需要披露的内容。

所述操作中有两个方面至关重要。首先，乌头碱向心脏的给药速率必须在各动物之间保持一致。这要求颈静脉导管尖端相对于心脏的位置保持一致，并仔细调节输注速率。为了能够适当地评估心室心律失常发生时间与易感性改变之间的关系，乌头碱递送至心脏的速率必须相等。如果乌头碱递送速率存在差异，则心律失常的潜伏期差异可能源于药物浓度的不同，而非心脏功能的改变。其次，心电图记录电极的制备与放置必须获得无伪迹的记录，且P波、QRS波群和T波必须清晰可辨。虽然心率、心率变异性（HRV）以及心室心律失常的发生情况可仅通过QRS波群确定，但校正QT间期（QTc）和QT离散度（QTd）的计算则必须依赖于包含清晰可辨Q波起点和T波终点的心电图记录。
这些技术的一个明显局限性在于它们是在麻醉动物中进行的。然而，这出于两个必要原因：1）由于心电图电极被植入骨骼肌组织中，在清醒的大鼠活动时会产生运动伪迹。这些非心脏信号经常掩盖心功能适当分析所必需的心电图信号。2）在清醒动物中诱发乌头碱性心律失常会引发潜在的伦理问题。
这些方法可对同一动物同时进行多种公认的SCD预后指标...

癫痫持续状态后大鼠心脏风险指标及对乌头碱诱发心律失常易感性的ecg评估方法

Methods for ECG Evaluation of Indicators of Cardiac Risk, and Susceptibility to Aconitine-induced Arrhythmias in Rats Following Status Epilepticus

致死性心律失常是多种病理状态下导致死亡的重要原因。通过无创、易于获取的心电图（ECG）获得的多个参数，已被确立为心肌病患者心脏风险的可靠且经过充分验证的预后指标。心率增快、心率变异性（HRV）降低，以及心室电活动持续时间及其变异性增加（QT间期延长）均提示心脏风险升高1-4。在动物模型中，比较这些由心电图导出的变量与实验性诱发心律失常的易感性具有重要价值。静脉输注致心律失常药物乌头碱已被广泛用于评估多种实验条件下心律失常的易感性，包括抑郁症5和高血压6的动物模型、运动后状态7以及暴露于空气污染物后的情况8，同时也用于评价药理学药物抗心律失常效果的有效性9,10。
需要注意的是，人类中的QT离散度是通过标准12导联心电图所有导联的QT间期变异程度来衡量的。因此，本实验方案中描述的大鼠2导联心电图所测得的QT离散度，与从人类心电图记录中计算出的QT离散度有所不同。这表明从啮齿类动物获得的数据向人类临床医学转化时存在一定的局限性。
癫痫持续状态（SE）是指单次发作或一系列连续反复发作的癫痫，持续时间超过30分钟11,12 11,12，其病死率可达20%13。许多患者虽能度过癫痫持续状态，但在30天内死亡14,15。这种延迟性死亡的机制尚未完全阐明。有研究提示，致死性室性心律失常可能是导致这些死亡的重要原因之一14-17。除了癫痫持续状态外，出现自发性反复癫痫发作的患者（即癫痫患者）也面临癫痫相关性早发性猝死（SUDEP）的风险18。与癫痫持续状态类似，SUDEP的确切发生机制尚不清楚。已有研究提出，心室异常及其引发的心律失常可能在其中起着重要作用18-22。
 为了研究癫痫相关性心脏死亡的机制以及心脏保护治疗的有效性，有必要在癫痫动物模型中获取由心电图衍生的风险指标，并评估其对心律失常的易感性23-25。本文描述了在匹罗卡品诱导的癫痫持续状态（SE）后，于Sprague-Dawley实验大鼠（Rattus norvegicus）体内植入心电图电极的方法，以及心电图记录的采集与分析，并通过静脉输注乌头碱诱导心律失常。
 这些方法可用于直接确定从心电图获得的心脏电活动指标与癫痫发作障碍大鼠模型或其他与猝死风险增加相关的病理状态下心室心律失常易感性之间的关系。

本文描述了通过心电图（ECG）记录大鼠癫痫持续状态（SE）后心脏电活动的测量技术，以及对心脏风险因素和心律失常易感性的分析方法。

癫痫持续状态后大鼠心脏风险指标及对乌头碱诱发心律失常易感性的ECG评估方法

致命性心律失常是多种病理状态下导致死亡的重要原因。通过无创、简便的方法获得的多个参数……

本实验的总体目标是评估实验动物在发生癫痫发作后的心脏电生理功能及心室心律失常的易感性。首先，将输注导管插入经历癫痫发作的动物颈静脉中。随后，在胸壁肌肉中植入电极，以记录心脏心电图（ECG）。随后在对照条件下以及颈静脉输注诱发心律失常的试剂期间记录心电图。最后对心电图记录进行评估。最终可获得结果显示，癫痫发作会改变心脏电生理功能，并增加致命性室性心律失常的风险。通过分析心电图（ECG）记录，癫痫发作引起的心电图变化可作为预测心脏性猝死风险的预后指标。该技术的主要优势在于，这些在人体中属于非侵入性的操作，能够获得心脏电活动的记录，用于预测致死性心律失常的风险。此外，在动物模型中，心脏活动的变化可直接与心律失常的易感性相关联。该方法可用于解决癫痫疾病领域中的一个关键问题，即癫痫持续状态及癫痫发作后心脏电活动改变与突发性心脏死亡之间的关系。这些技术对癫痫疾病的治疗具有重要意义，尤其适用于识别因癫痫发作而导致心脏功能障碍的高风险个体。采用这种非侵入性方法可将动物置于心脏保护性治疗中，以降低心源性猝死的风险。尽管该方法可用于研究与癫痫发作相关的 cardiac dysfunctions（心脏功能障碍），但它同样适用于任何可表现为致死性心室心律失常且能在动物模型中复制的病理状态。通常情况下，熟悉啮齿类或其他小型动物基本手术技术的研究人员在使用该方法时不会遇到困难。我们最初萌生了使用该方法的想法，并希望找到一种快速、经济且易于操作的心功能评估方法，同时该方法也可适用于人类疾病的诊断。在将心电图（ECG）电极植入大鼠体内以采集数据，并通过静脉输注乌头碱等致心律失常药物诱导心律失常之前，需先制备颈静脉导管：取一段长100毫米的PE 50聚乙烯管，将其一端削成斜面，随后钝化该斜面，再用肝素化生理盐水充满导管。接下来，使用两段长度均为100毫米的绝缘银线制备心电图记录电极。将两根导线的一端去皮，并焊接到微型连接器上。然后拧紧绝缘层，形成用作接地的第三根导线。焊接完成后，用环氧树脂密封导线。从导线远端剥离5毫米的绝缘层，并弃去，以植入颈静脉导管。首先通过腹腔注射乌拉坦对动物进行麻醉。此剂量足以在整个操作过程中维持动物处于适当的麻醉水平。该手术为非存活手术。通过夹捏脚趾确认动物已达到适当的麻醉水平。然后剃除从锁骨到下颌的右侧颈部区域毛发，并剃除胸部毛发。接着，用碘酒酒精对已剃毛的颈部区域进行消毒，并在颈动脉上方的皮肤做一纵向切口，使用尖端精细的弯头解剖镊子将切口打开。轻轻分离皮肤与下方肌肉，然后分离覆盖颈静脉的肌肉。最后，采用类似技术，将颈静脉从其下方组织中游离出来。取两段2号外科丝线，从颈静脉下方穿过，并将缝线分别置于头侧和尾侧。在切口的大部分位置结扎近端血管，以阻断静脉内的血流。牵拉所有结扎线，将血管从下方组织上提起，并使用显微剪刀或23号针头进行小切口。然后插入先前制备的充满肝素的PE 50聚乙烯导管的钝性斜面末端，并将导管尖端向前推进约八毫米，至右心房水平。通过将结扎线围绕血管和导管一并打结，固定导管。最后，使用伤口夹或缝线关闭切口。导管植入后，将动物仰卧位放置，并对其胸部剃毛区域进行消毒。放置电极时，在胸部的右上象限和左下象限各做一个10毫米的纵向切口，分离切口上方的皮肤以暴露胸肌，使用较细的外科丝线缝合固定。将银丝电极暴露的5毫米尖端分别插入两个暴露区域的胸肌中。使用伤口夹关闭切口，并将微型连接器插入记录设备。在动物置于接地金属板上并用毛巾 loosely 包裹的 20 至 30 分钟平衡期后，使用 Power Lab 数据采集系统和 Macintosh 计算机或类似硬件和软件进行 ECG 记录。为维持其体温，记录 20 分钟 ECG，将颈静脉导管连接至放置在可编程输液泵中的远程注射器。开始乌头碱输注，以每分钟每公斤5微克的恒定剂量持续输注7分钟，在计算机记录上标记输注开始时间点，记录心室颤动发生时间或输注结束时间。采用经批准的程序对动物实施安乐死。QT间期代表心室电活动的总持续时间。该图显示了一个模型心电图记录以及 QT 间期的持续时间。在 20 分钟对照记录期间，选取其中连续 5 分钟时间段内所有记录的心跳，计算 Q 波起始至 T 波终止之间的平均时间，以校正心率差异对 QT 间期的影响。使用此处所示的 Bass 公式，其中 RR 为心跳之间的平均间期。RR间期计算为分析期间连续Q波之间的时间间隔。QT离散度通过计算每只动物记录到的最大QT间期与最小QT间期之差得出。为分析心率变异性，可使用如LabChart 7等软件程序，该程序可分析在分析期间获得的RR间期变异，并计算心率的时间域和/或频谱域指标。为了分析心室心律失常的易感性，需计算从乌头碱输注开始至首次出现室性期前收缩、室性心动过速和心室颤动之间的时间潜伏期。该图展示了对照组大鼠以及在测试前一周经历过癫痫持续状态（SE）的大鼠在频域内心率变异性（HRV）的一种测量指标，即RR间期标准差的均方根值（R-M-S-S-D）。这种心率变异性（HRV）指标反映了心脏副交感神经功能调控的变化，在脓毒症动物模型中显著降低。该图显示，校正后的QT间期和QT离散度均显著增加。综合脓毒症发生两周后的数据表明，脓毒症会增加心室心律失常的风险。这一预测得到了研究结果的支持：在这些研究中，诱导实验性心律失常所需的乌头碱输注时间，在经历癫痫持续状态（SE）后的动物中显著更短。通常情况下，若操作得当，该过程大约需要一个半小时即可完成。在进行该操作时，需注意保持颈静脉导管通畅，并确保心电图电极的构建和植入方式能够产生尽可能无噪声的信号。观看本视频后，您应能够充分理解如何评估心脏的电活动，并将其与致死性心室心律失常的易感性相关联。在与心源性猝死相关的啮齿类动物病理模型中。

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心电图心脏风险评价指标和乌头碱诱发大鼠心律失常的易感性继癫痫持续状态的方法

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兔癫痫异常的多系统监测：一种在诱发癫痫发作期间同步记录视频脑电图、心电图、二氧化碳图和血氧测定的方法

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癫痫诱导大鼠癫痫发作的脑电图记录

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来源：Jang, S., et al，大鼠电休克惊厥及其海马组织的分离以检测惊厥诱导的突触后密度蛋白变化。J. Vis. Exp.

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