三维光学分辨率的光声显微镜

该程序的总体目标是展示无创且无标记的体内光学分辨率光声显微镜或/或微循环的 Pam。这是通过首先麻醉实验动物来实现的。该程序的第二步是通过平移光学分辨率的成像头来定位感兴趣区域，然后设置光声显微镜扫描参数并开始图像采集。

最终，通过计算多波长实验数据获得血红蛋白总氧浓度和氧饱和度的分布。光学分辨率光声显微镜基于激光激发和超声波检测。短后激光束聚焦到生物组织中。

光吸收产生瞬态加热和随后的超声波发射，被接收以形成图像。Pam 的独特优势在于它无需接地的检测和对光吸收的极高灵敏度。相比之下，现有的反射而非光学显微镜技术主要对光散射或荧光敏感，能够在体内提供无标记的高分辨率光吸收或 RPM 成像，已在神经病学、眼科、血管生物学和皮肤病学中发现了广泛的生物医学应用。

光学分辨率光声显微镜或/或 pamm 由光学和超声组件组成。光照射源是由固态脉冲激光器泵浦的染料激光器。输出激光束由中性密度滤光片衰减并耦合到单模光纤中以进行光传输，以允许对显微镜成像头而不是活体物体进行机械扫描，从而有效地将多模激光束耦合到单模光纤中。

它首先通过直径为 50 微米的针孔过滤。针孔的位置略微远离聚光镜的焦点，使其直径与基本模光束直径相匹配。为了创建几乎衍射受限的光学焦点，单模光纤的输出被整理并填充显微镜的后孔。目的。

超声波探测涉及连接到超声波换能器的自制声波光束合束器。合路器同轴对准光照射和声学检测。在合路器底部研磨一个球形腔，以产生一个数值孔径为 0.5 的声学透镜，在 50 兆赫兹中心频率下提供 43 微米的声学焦距直径。

对于第一次对齐，使用脉冲回波超声来确定声焦平面的位置会有所帮助。垂直调整成像头，直到观察到最大脉冲回波超声信号。为了最大限度地提高检测灵敏度，光学和声学焦点对准。共焦的。

将光学吸收目标（例如一条黑色电工胶带）放置在声学焦平面中。然后调整光学焦距位置以最大化光声信号。OR PAM 系统还包括电子放大器和模数转换器、机械扫描仪和扫描仪控制器。

数字化信号被传输到计算机以形成图像。该软件将原始数据转换为一系列横截面 bcan 图像。当显微镜头光栅扫描物体时，记录的图像可以显示为单个横截面图像、2D 最大振幅投影图像或 3D 渲染。

用于容纳显微镜成像头。将成像窗口切入培养皿中，并用超声和光学透明的聚乙烯膜密封。物体产生的光声波首先通过物体和聚乙烯膜之间的超声波凝胶与超声波探测器进行声耦合，然后通过培养皿中的去离子水耦合。

可用光学激光器和超声换能器的这些发明和应用构成了 OR PAM 系统。在下一部分中，我们将使用该系统对活体小鼠的微血管系统进行成像。如果被成像的动物不是裸鼠，最好在实验前 24 小时进行拍摄。

因此，对皮肤脉管系统的刺激得到了恢复。用医用级氧气中蒸发的 3% ISO 氟麻醉小鼠。典型的流速在每分钟 1 到 1.5 升之间。

取决于动物的体重。用 1% ISO 氟维持麻醉 在整个实验过程中，进行脚趾捏以确保小鼠完全麻醉。用加热垫将鼠标转移到立体定向载物台，使其体温保持在 37 摄氏度。

现在将耳朵压平在塑料板上。然后在耳朵顶部涂上一层超声波凝胶。避免将气泡困在凝胶内。

还要在眼睛上涂抹眼药膏，以防止干燥或意外激光损伤。避免用涂抹器直接接触眼睛。然后将耳朵放在成像窗下，慢慢升高动物载物台，直到超声凝胶接触膜的底部。

需要柔软的接触，因为将耳朵压在膜上可能会影响耳朵中的血液流动。接下来，对动物采取一些预防措施来监测其生理状态。将脉搏血氧仪夹在鼠标、腿部或尾部。

现在降低成像头，直到声学镜头浸入去离子水中，并去除声学镜头下的气泡。将激光机设置为外部触发模式并开始试扫描。调整成像头的 Z 位置，直到光学和声学双焦点位于耳朵中间。

现在设置扫描参数并开始正式图像采集。测量总血红蛋白浓度。将波长设置为 ISO 痉挛点，其中氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白具有相同的摩尔消光系数。

要测量血红蛋白氧饱和度，请将第二个波长设置为氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的摩尔消光系数具有明显差异的位置。完成后，清洁鼠标耳朵并将鼠标放入培养箱中。在环境温度设定为 37 摄氏度的情况下，当它醒来时，自然会把老鼠放回动物设施。

该最大振幅投影图像显示了使用 或 Pam 在 570 纳米处成像的活体裸鼠耳朵的血管解剖结构。该投影图像显示了同一只耳朵中的血红蛋白氧饱和度。它是根据在 570 纳米的 ISO 痉挛波长和 561 纳米的脱氧血红蛋白吸收主波长下获得的图像计算得出的。

仔细观察框内区域，可以看到 oramm 的分辨率。密集的毛细血管床已明显消退。在本视频中，我们演示了 ORPM 的典型实验方案，包括系统配置、系统对准体内实验程序和功能成像方案。

仪器设计和作中最重要的方面之一是光学声学共聚焦对准，这对成像灵敏度至关重要，光学分辨率光声显微镜与深穿透声学分辨率光声显微镜和光声计算机断层扫描相结合，有望在体内、功能和分子成像以及多个末端尺度、器官指甲、细胞、组织、 和器官都可以使用相同的对比度成像。成像可扩展性等来源有可能彻底改变多尺度系统、生物学和转化的研究。从微观实验室发现到宏观临床实践。