Name: 一个钙生物发光检测蚊虫的功能分析（埃及伊蚊）和刻度（镰形扇头microplus）G蛋白偶联受体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学习钙生物发光检测技术，用于分析节肢动物神经肽与G蛋白偶联受体的结构活性关系。该方法利用稳定转染的CHO-K1细胞系，为药物先导化合物发现提供可靠工具。

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我们感谢丹麦哥本哈根大学的 C. J. P. Grimmelikhuijzen 博士和 Michael Williamson 博士提供 aequorin 质粒。同时感谢我们的合作者，美国农业部农业研究局（德克萨斯州，美国）的 Ronald J. Nachman 博士提供肽段合成服务以及 NOVOstar 酶标仪。

1. 稳定细胞系的建立
<ol>
	<li>克隆您感兴趣的G蛋白偶联受体（GPCR），并将其插入含有5'端Kozak共有序列（GCCA/GCCATGG）的表达载体中，以在哺乳动物系统中实现核糖体的最佳结合（Kozak, 1986）。本实验中，我们使用质粒pcDNA3.1/Bm-KR表达蜱类激肽受体，使用质粒pcDNA3.1/Aedae-KR表达蚊类激肽受体（Holmes et al., 2003; Pietrantonio et al., 2005）。pcDNA3.1(-)载体在细菌中赋予氨苄青霉素抗性，用于筛选；在哺乳动物细胞中则赋予新霉素（G418）抗性。</li>
 <li>在T-25培养瓶（BD Falcon）中，于37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养CHO-K1空细胞（不含质粒）（ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）或其他所需细胞系（Holmes et al., 2003）。除非另有说明，所有后续孵育均应在上述条件下进行。使用生长培养基（F12K培养基含10%胎牛血清）并添加1×抗生素-抗真菌剂（Invitrogen，CA）维持空细胞培养。</li>
 <li>传代细胞时，将所有溶液预热至37°C。吸除T-25培养瓶中的旧培养基，用5 ml PBS清洗后弃去PBS。进行细胞消化时，加入2 ml PBS-胰蛋白酶-EDTA溶液（34 ml PBS，2 ml 7.5%碳酸氢钠，4 ml 10×胰蛋白酶-EDTA）作用2分钟。加入3 ml培养基，反复吹打混匀细胞。将含细胞的培养基转移至离心管，以约200–300 g（1,000 rpm）离心2分钟。弃上清，用5 ml培养基重悬细胞。将细胞悬液用新鲜培养基按1:5或1:10比例稀释，取5 ml转移至新的T-25培养瓶中。</li>
 <li>待细胞健康生长约2–3天后，将CHO-K1细胞接种至T-25组织培养瓶中，在不含抗生素的生长培养基中过夜培养，直至细胞汇合度达约30%（约18小时）。可通过倒置荧光显微镜观察细胞状态判断汇合程度。</li>
 <li>为每个样品准备以下混合液：
 <ol>
 <li>将1–2 μg DNA（示例：4 μl浓度为265 μg/μl的pcDNA3.1/Aedae-KR）与100 μl Opti-MEM I低血清培养基（Invitrogen）混合。</li>
 <li>将6 μl Lipofectin转染试剂（InvitrogenTM）加入100 μl F12K无血清培养基中，使Lipofectin与DNA体积比为1:1。室温孵育30–45分钟。</li>
 </ol>
将1.5.1与1.5.2所得溶液轻轻逐滴混合（总体积 = 200 μL），室温静置10–15分钟。
</li>
 <li>吸除细胞中的旧生长培养基，用5 ml F12K无血清培养基清洗细胞后弃去该培养基。在15 ml离心管中，将转染混合液轻轻逐滴加入1.8 ml新鲜F12K培养基中混匀。随后用PBS清洗步骤1.5中的细胞，并将新的转染溶液加入细胞中。孵育18小时。</li>
 <li>更换为含10%胎牛血清但不含抗生素的F12K培养基，过夜孵育。将细胞按1:2比例传代至两个含相同培养基的T-25培养瓶中继续培养18小时（传代操作参见步骤1.3）。</li>
 <li>更换为筛选培养基（F12K培养基含10%胎牛血清及800 μg/ml GENETICIN，Invitrogen）。使用该筛选培养基连续培养细胞3–4周，以筛选出稳定整合质粒至基因组DNA中的细胞。后续持续使用维持培养基（F12K培养基含10%胎牛血清及400 μg/ml GENETICIN）培养细胞。定期使用冷冻培养基（含20% DMSO的筛选培养基）按1:1比例冷冻保存细胞系，以防意外污染导致细胞丢失。</li>
 <li>克隆细胞系筛选：首先，按照步骤1.3操作，用维持培养基对步骤1.8所得细胞进行胰蛋白酶消化和离心。用5 ml维持培养基重悬细胞，取0.5 ml细胞悬液加入4.5 ml新鲜维持培养基中，制成10倍稀释液。将该10倍稀释液转移至96孔板的12个孔中，每孔加100 μl，用于单细胞筛选。</li>
 <li>继续对该细胞悬液进行10倍系列稀释，理论上最终获得每100 μl含一个细胞的悬液（通常最终稀释倍数在10-11至10-19之间；总10倍稀释次数约为˜19）。每次稀释后立即取100 μl加入96孔板的12个新孔中。孵育18小时后，在倒置光学或荧光显微镜下观察96孔板，标记仅含单个细胞或明显由单个细胞分裂而来的两个细胞的孔。持续每日观察，并每三天更换一次培养基。</li>
 <li>当孔内细胞汇合度达80%（约一周后），用200 μl PBS清洗标记的孔，加入100 μl PBS-胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化。将每个标记孔中的细胞转移至6孔板的一个孔中，加入1 ml维持培养基。培养3天后，将细胞转移至单独的T25培养瓶中。使用钙离子荧光素酶生物发光检测法对这些细胞进行激动剂肽检测（参见第2节）。</li>
 <li>从步骤1.11中选择在钙离子荧光素酶生物发光板检测中反应最强的一个细胞系，并重复进行一次单细胞筛选（步骤1.9–1.11）。定期冷冻保存细胞系。</li>
 <li>根据步骤1.12所述的二次筛选结果，选择在钙离子荧光素酶生物发光板检测中反应最强的2–3个细胞系，继续在培养中维持，用于后续的钙离子荧光素酶生物发光板检测。记录细胞传代次数。定期冻存早期传代的细胞系，以便在高传代细胞系性能不稳定时可回溯使用。</li>
</ol>
2. 钙离子生物发光板检测法
<ol>
	<li>将目的报告基因连接至表达载体中。此处我们使用了aequorin质粒mtAEQ/pcDNA1（由丹麦哥本哈根大学的C. J. P. Grimmelikhuijzen博士和Michael Williamson博士惠赠）。将质粒转化至 E. coli 使用 MC1061/PS 细胞（Invitrogen）并利用 QIAprep spin miniprep 试剂盒（Qiagen Inc.）进行质粒纯化。最后一步使用不含 EDTA 的 Tris 缓冲液洗脱质粒，而非水。</li>
 <li>培养第1.13步中表达目标受体的细胞系，使用维持培养基进行培养。当细胞融合度达到90%时，用胰蛋白酶消化，离心后将细胞重悬于5 ml维持培养基中，操作同第1.3步。用维持培养基将细胞稀释约10倍，使用细胞计数器（Bright-Line 血细胞计数板）在显微镜下计数细胞数量。调整细胞密度至约2 × 10⁶ 个/ml。5 细胞/毫升（血细胞计数板中9个方格之一平均有20个细胞）。将2毫升稀释后的细胞悬液接种至6孔板的每个孔中。培养24小时（培养后细胞汇合度应达到约60%）。</li>
<li>在6孔板中将培养基更换为OPTI-MEM培养基。每孔加入时，混合 96 μl 含 OPTI-MEM 的 4 μl FuGENE 6 转染试剂（Roche Biochemicals）于微量离心管中，室温静置 5 分钟。加入 1 μg 将等量的aequorin/pcDNA 1质粒DNA加入各离心管中，轻轻振荡混匀1分钟，室温孵育15–20分钟。将各混合物逐滴加入各孔中，同时轻柔振荡培养板。将培养板孵育6小时后，更换为含10%胎牛血清但不含抗生素的F12K培养基。</li>
<li>在六孔板中培养细胞 24 小时后，按照步骤 1.3 进行胰酶消化、离心并重悬细胞。按照步骤 2.1 将细胞数目调整至 400,000 个细胞/ml，并转移 100 μl （共 40,000 个细胞/100 μl)加入至96孔白色底透微孔板（Costar 3610）的每个孔中。继续孵育24小时，直至细胞融合度达到约80%。此为生物发光检测的最佳细胞浓度。</li>
<li>准备 90μl/well 无钙 DMEM 培养基（Invitrogen） 5 μM 腔肠素（Invitrogen）避光使用（腔肠素对光敏感）。 取步骤2.4中的培养板，吸除旧培养基后加入此溶液 90μl 每孔中加入。在避光条件下孵育平板 3 小时，温度为 37°C 和 5% CO2，此后培养板中的细胞即可用于检测。</li>
</ol>
3. 仪器操作与数据分析
<ol>
	<li>每台生物发光酶标仪均有所不同。我们使用 NOVOstar（BMG Labtechnologies）酶标仪在生物发光模式下进行检测。如果您使用不同的仪器，则必须对本方案进行相应调整。</li>
 <li>使用前请先对酶标仪的泵系统进行排空（或“PRIME PUMPS”）。将微孔板放入板架前，请关闭房间内的灯光。待板架关闭后，再打开灯光。</li>
 <li>在无钙 DMEM 培养基中溶解肽（置于 1.5 ml Eppendorf 管中）。使用前设定肽溶液的“吸液深度”和“位置确定”参数。向细胞中加入 10 μl 不同浓度的肽（10 倍浓缩液，如 FFFSWG-NH2、Aedes-K1-3 或其他目标肽）进行刺激，并立即开始记录发光信号。我们将仪器设置为每 2 秒记录一次各孔的光发射信号（465 nm），总时长为 50 秒。</li>
 <li>务必设置阳性对照，例如活性类似物（如已使用的类似物 FFFSWGa，Taneja-Bageshwar et al., 2009），以及阴性对照，例如仅转染空载体的细胞。阴性对照在数据分析过程中用于设定基线阈值（参见代表性结果）。也可添加一种无关的非活性肽作为阴性对照。</li>
 <li>运行结束后，清洗仪器泵系统（或“PRIME PUMPS”），然后放入下一个肽样品。保存数据后再次清洗泵系统。</li>
 <li>数据处理：将各孔的光发射数据导入 Microsoft Excel 表格中。</li>
 <li>将 Excel 中的数据粘贴至 GraphPad Software Inc.（美国加利福尼亚州圣地亚哥）的 Prism 软件 4.0 版本中。以不同肽浓度为 X 轴，以生物发光单位为 Y 轴。为归一化数据，绘制对数-反应曲线。选择非线性回归曲线拟合分析（采用可变斜率的 S 形剂量-反应方程），以获得每种肽的浓度-反应曲线。程序最终绘出曲线并给出 EC50 值。</li>
 <li>每次实验应至少重复三次，用于数据分析。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
在CHO-K1细胞中表达时，埃及伊蚊（Aedes aegypti）激肽受体表现为一种多配体受体，在钙生物发光板检测中，单独测试的三种内源性伊蚊激肽（Aedae激肽1-3）在低至1 nM的浓度下即可产生功能性反应。图1显示，根据各自的EC50值，其效力排序为Aedae-K-3 > Aedae-K-2 > Aedae-K-1，其中Aedae-K-3为16.04 nM，Aedae-K-2为26.6 nM，Aedae-K-1为48.85 nM，三者之间的差异具有统计学显著性（P < 0.05）（Pietrantonio et al., 2005）。
我们还利用该实验确定了哪些缓激肽残基对缓激肽-受体相互作用至关重要。昆虫缓激肽类肽具有一个C端五肽，代表发挥生物学活性所需的最小序列，也称为核心序列。在表1中，缓激肽核心类似物以丙氨酸逐步取代核心五肽FFSWGa中的各个氨基酸进行合成，并通过钙依赖性生物发光板式检测法进行测试（Taneja-Bageshwar et al., 2006）。我们发现，Phe1 和 Trp4 这两个氨基酸对两种受体中昆虫缓激肽的活性均至关重要。
该检测方法还可用于测试设计用于增强生物稳定性的肽。表2显示了在蜱虫重组激肽受体上测试的含α-氨基异丁酸（Aib）的合成激肽类似物，图2展示了通过钙依赖性生物发光板检测法（Taneja-Bageshwar et al., 2009）测定的六种α-氨基异丁酸类似物在表达蜱虫激肽受体的CHO-K1细胞系中的活性比较。六肽类似物FFFSWGa作为受体活性的阳性对照加入。类似物FF[Aib]WGa的活性高于该六肽对照类似物。含有两个α-氨基异丁酸替换的类似物[Aib]FF[Aib]WGa在所有测试的双替换类似物中活性最强（表2和图2）。
有关该检测方法已应用和可应用的更多示例，请参见 Nachman 和 Pietantonio (2010)、Nachman et al. (2009)、Taneja-Bageshwar et al. (2008a) 以及 Taneja-Bageshwar et al. (2008b)。
<img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig1.jpg" alt="埃及伊蚊激肽剂量-反应曲线及EC50值；科研结果分析，生物测定数据研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 估计 伊蚊 激肽有效浓度（EC50通过钙-生物发光板式检测法检测CHO-K1 E10细胞。 浓度-反应曲线的纵轴数据来自以各肽段最大反应为100%的相对发光单位百分比。数据点表示三次独立实验中六次重复的平均值，误差线表示标准误。(A) Aedae-K1 EC50 = 48 nM。（B）Aedae-K2 EC的估计值50 = 26 nM。（C）Aedae-K3 EC₅₀ 的估算50 = 16 nM。EC50 Aedae-K3 &lt; EC50 Aedae-K2 &lt; EC50 Aedae-K1；P &lt; 0.05。统计分析和图表采用 GraphPad Prism 4.0 软件完成。
<img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig2.jpg" alt="显示类似物EC50值的生物发光剂量-反应曲线，以最大发光百分比表示。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 通过钙依赖性生物发光板法比较六种α-氨基异丁酸类似物在表达蜱虫激肽受体的CHO-K1细胞系中的活性。 Y轴表示每种类似物的最大生物发光单位百分比，即在某一浓度下观察到的生物发光信号相对于该类似物在所有测试浓度中所达到的最大反应的百分比。统计分析和图形绘制使用GraphPad Prism 4.0软件完成。
<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 	<td> </td>
 	<td colspan="2">蜱受体细胞系</td>
 <td colspan="2">蚊受体细胞系</td>
 
 </tr>
 <tr>	
 	<td>肽</td>
 <td>EC50 (nM)</td>
 <td>1 mM 时的最大生物发光反应</td>
 <td>EC50 (nM)</td>
 <td>1 mM 时的最大生物发光反应</td>
 
 </tr>
 <tr>
 	<td>AFSWGa</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>FASWGa</td>
 <td>586</td>
 <td>5,600 </td>
 <td>N.D. </td>
 <td>400</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>FFAWGa</td>
 <td>64 </td>
 <td>12,800 </td>
 <td>621 </td>
 <td>3,050</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>FFSAGa</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>FFSWAa</td>
 <td>417</td>
 <td>10,600 </td>
 <td>2,800 </td>
 <td>1,830</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>FFSWGa</td>
 <td>590</td>
 <td>10,800 </td>
 <td>N.D. </td>
 <td>525</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>FSWGa</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>FFSWa</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>FFSWG-OH</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>FFFSWGa</td>
 <td>259</td>
 <td>13,000</td>
 <td>562</td>
 <td>10,000</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>FF[Aib]WGa</td>
 <td>29</td>
 <td>12,700 </td>
 <td>445 </td>
 <td>9,300</td>
 </tr>
 
 
 </tbody>
</table>
表1. 所有测试肽在蜱和蚊受体转染细胞系上的估计效价（EC50）及最大生物发光反应*。
*EC50 估算诱导半数最大反应所需的浓度。I：无活性，若生物发光反应低于300单位（空载体转染细胞的水平）。A：肽FFSWGa中相应残基被丙氨酸取代的位置。N.D.：该类似物已进行测试，但在较低摩尔浓度下活性较弱或无活性，因此无法确定EC50。
<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 	<td>K-Aib-1 </td>
 <td>[Aib]FF[Aib]WGa</td>
 
 </tr>
 <tr>
 	<td>K-Aib-2 </td>
 <td>[α MeF]FF[Aib]WGa</td>
 
 </tr>
 <tr>
 	<td>K-Aib-3 </td>
 <td>Ac-R[Aib]FF[Aib]WGa</td>
 
 </tr>
 <tr>
 	<td>K-Aib-4 </td>
 <td>Ac-R[β3F]FF[Aib]WGa</td>
 
 </tr>
 <tr>
 	<td>K-Aib-5 </td>
 <td>[Aib]RFF[Aib]WGa</td>
 
 </tr>
 <tr>
 	<td>K-Aib-6 </td>
 <td>[Aib-Aib-Aib-Aib]RFF[Aib]WGa</td>
 
 </tr>
 

 </tbody>

</table>
表2. 在蜱虫重组激肽受体上测试的含氨基异丁酸（Aib）的激肽类似物（K）。Ac：乙酰基；α Me：α-甲基苯丙氨酸；β3F：β3-苯丙氨酸；a：酰胺。

<ol><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+5%27-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li>
<li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V. Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNachman%2C+R+%22Neuropeptide+systems+as+Targets+for+Parasite+and+Pest+Control%22">Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control</a>. Geary, T. , Landes Bioscience. Madamme Curie Library. (2010).</li>
<li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+development+of+novel+pest+management+agents+based+upon+insect+kinin+neuropeptide+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biostable+agonists+that+match+and%2For+exceed+the+activity+of+insect+kinins+on+recombinant+arthropod+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs.</a> General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+insect+kinin+analogs+with+cis-peptide+bond%2C+type+VI-turn+motifs+identifies+optimal+stereochemistry+for+interaction+with+a+recombinant+arthropod+kinin+receptor+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus.</a> Peptides. 29, 295-301 Forthcoming.</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+selective+and+non-selective%2C+biostable+beta-amino+acid+agonists+of+recombinant+insect+kinin+receptors+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+and+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti.</a> Peptides. 29, 302-309 Forthcoming.</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+structure-activity+analysis+of+insect+kinin+core+analogs+on+recombinant+kinin+receptors+drom+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29+and+mosquito+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).</li>
<li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).</li>
<li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).</li>
<li>Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li>
<li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们利用本方案成功完成了首个从蛛形纲（蜱、螨和蜘蛛）中发现的神经肽受体——蜱激肽受体的功能表征。该方法具有三个主要应用：第一，可通过配体活性测定实现受体去孤儿化；第二，该检测方法可用于解析配体-受体的构效关系（SAR）；第三，该方法可用于药物发现。此外，本方案还可用于研究激动剂或拮抗剂对几乎所有G蛋白偶联受体（GPCR）的活性。我们正在开始将该方案应用于小型文库的筛选。我们所使用的细胞系不表达普遍存在的G蛋白G16，而无需使用该蛋白，因为节肢动物激肽受体通过Gq蛋白及细胞内钙信号级联通路进行信号传导，且如本研究所示，其在哺乳动物细胞中仍保留了这一信号特性。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td>美国弗吉尼亚州马纳萨斯</td></tr><tr><td>F12K 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>21127</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0643</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（10倍浓度）</td><td>Invitrogen</td><td>15400</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Invitrogen</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectin 转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>18292-011</td><td></td></tr><tr><td>GENETICIN</td><td>Invitrogen</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>MC1061/P3 Ultracomp</td><td>Invitrogen</td><td>C663-03</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep 质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>19064</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 转染试剂</td><td>Roche Group</td><td>11 814 443 001</td><td></td></tr><tr><td>96 孔白色平底微孔板</td><td>Costar</td><td>3610</td><td></td></tr><tr><td>无钙 DMEM 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>21068</td><td></td></tr><tr><td>C&amp;#8211;腔肠素</td><td>Invitrogen</td><td>C-2944</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line 血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td></td><td>美国宾夕法尼亚州霍舍姆</td></tr><tr><td>NOVOstar</td><td>BMG Labtechnologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 软件 4.0</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td>美国加利福尼亚州圣地亚哥</td></tr><tr><td>T-25 和 T-75 培养瓶</td><td>BD Biosciences</td><td>353014 和 353135</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于蚊子（aedes aegypti）和蜱虫（rhipicephalus microplus）g蛋白偶联受体功能分析的钙离子生物发光检测法

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

节肢动物激素受体是新型杀虫剂的潜在靶点，因为它们调控许多重要的生理和行为过程。其中大多数属于G蛋白偶联受体（GPCRs）超家族。我们专注于鉴定蜱虫和蚊子中的节肢动物激肽受体。节肢动物激肽是一类具有肌动、利尿和神经递质功能的多功能神经肽。本文描述了一种在两种异源表达激肽受体系统中系统分析昆虫激肽构效关系的方法。我们提供了与开发具有生物稳定性的激肽类似物相关的重要信息，这类类似物有望干扰蜱虫和蚊子的利尿、肌动和/或消化过程。
将来自南方牛蜱Boophilus microplus（Canestrini）和埃及伊蚊Aedes aegypti（Linnaeus）的激肽受体稳定表达于哺乳动物CHO-K1细胞系中。通过钙离子生物发光板式检测法对这些受体进行功能分析，该方法通过检测细胞内生物发光来确定重组细胞在施加肽类物质后胞浆中的钙离子水平。该方法利用了水母发光蛋白aequorin，这是一种从发光水母中分离得到的光蛋白。我们将aequorin质粒（mtAEQ/pcDNA1）瞬时转染至稳定表达激肽受体的细胞系中，随后用辅因子腔肠素（coelenterazine）处理这些细胞，使其与细胞内的aequorin形成复合物。当钙离子存在时，该复合物断裂并释放出与钙离子浓度相对应的发光信号。由于激肽受体通过释放细胞内钙离子进行信号传导，因此信号强度与肽类物质的活性呈正相关。
本方案综合了先前描述的多种方案并进行了修改，通过功能性板式检测法，逐步介绍了在哺乳动物细胞系中稳定表达G蛋白偶联受体（GPCRs）的操作步骤（Staubly et al., 2002 和 Stables et al., 1997）。利用该方法，我们成功建立了稳定表达蚊子和蜱类缓激肽受体的细胞系，比较了三种蚊类缓激肽的活性，鉴定了配体-受体相互作用中的关键氨基酸位点，并对一个肽库进行了半高通量筛选。由于昆虫缓激肽易被内源性肽酶快速降解，其在害虫控制或内分泌学研究中的应用受到严重限制。因此，我们还测试了含有氨基异丁酸（Aib）的缓激肽类似物，以增强其活性和生物稳定性。这种抗肽酶降解的类似物为开发具有生物稳定性的昆虫缓激肽类似物提供了重要先导化合物，并可能有助于基于神经肽的节肢动物防控策略的研发。

本实验方案提供了克隆细胞系筛选及钙依赖性生物发光检测的方法，用于分析合成节肢动物神经肽与其同源G蛋白偶联受体之间的构效关系。该检测方法可用于受体去孤儿化研究，以及合成类似物设计和肽类/药物先导物发现中的构效关系研究。

一种用于蚊子（Aedes aegypti）和蜱虫（Rhipicephalus microplus）G蛋白偶联受体功能分析的钙离子生物发光检测法

节肢动物激素受体是新型杀虫剂的潜在靶点，因为它们调控着许多重要的生理和行为过程。

以下实验的总体目标是分析合成节肢动物神经肽与其同源G蛋白偶联受体（GPCR）之间的构效关系。首先，将中国仓鼠卵巢K1空细胞转染目标G蛋白偶联受体表达载体，获得源自单细胞的稳定转化细胞系；第二步，将该稳定细胞系转染携带报告基因Gina Quaran的quaran质粒，用于在钙依赖性生物发光板检测中测量细胞内生物发光信号。随后，通过钙依赖性生物发光板检测，测定肽配体作用于这些重组细胞后胞质内钙离子水平的变化。实验结果表明，将结构不同的肽或不同浓度的肽作用于重组细胞后，由于细胞内钙离子释放被孔青素报告分子在平板检测中所捕获，因而观察到生物发光单位存在差异。相较于瞬时转染和表达方案，使用稳定转染并表达重组G蛋白偶联受体（GPCR）的克隆细胞系的主要优势在于受体表达水平更加均一，从而保证了实验的一致性和结果的可重复性。此外，将孔青素蛋白靶向定位至线粒体，可实现通过生物发光进行高灵敏度的钙离子检测。本次实验将由本实验室的两名研究生Shallin Lie和Simon Kersch，以及一名博士后共同完成。建立稳定细胞系时，首先在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中培养中国仓鼠卵巢K1空载细胞。待细胞生长状态良好后，使用含1×抗生素-抗真菌剂的生长培养基维持培养。将中国仓鼠卵巢K1细胞接种至T25细胞培养瓶中，加入不含抗生素的生长培养基过夜培养，直至细胞融合度达到约30%。转染前，按照书面实验方案所述，准备含有目标G蛋白偶联受体（GPCR）的DNA表达载体。将DNA与100微升Optum低血清培养基混合。将6微升脂质体转染试剂加入100微升F12K无血清培养基中，室温孵育30至45分钟。孵育结束后，将DNA溶液与脂质体预混液在15毫升离心管中逐滴轻轻混合。室温静置10至15分钟。将转染混合物以逐滴方式轻轻混入1.8毫升新鲜F12K培养基中。然后用PBS洗涤细胞，并将此新的转染溶液加入细胞中。于37°C孵育18小时。将培养基更换为F12K培养基（含10% FBS，不含抗生素），并于次日继续培养过夜。按照书面实验步骤所述，将细胞以F12K培养基（含10% FBS，不含抗生素）传代至两个T25培养瓶中。再继续培养18小时。用筛选培养基替换原有培养基。随后使用筛选培养基持续培养细胞三至四周，以筛选出已将质粒稳定整合至基因组DNA中的细胞。持续使用维持培养基培养细胞，并定期冻存细胞系，以防止因意外污染造成细胞丢失。为筛选单克隆细胞系，首先用胰蛋白酶消化细胞，然后按照书面实验方案所述，用维持培养基离心收集细胞。随后，将细胞重悬于5 mL维持培养基中。取出0.5毫升细胞悬液，加入4.5毫升新鲜维持培养基，制成10倍稀释液，取100微升该10倍稀释液加入96孔板的12个孔中，以筛选单个细胞。将这些细胞继续进行约19次10倍连续稀释，理论上最终悬液浓度为每100微升含一个细胞，并将每次连续稀释后的100微升分别转移至96孔板的12个孔中。在37°C孵育18小时后，在倒置光学显微镜或荧光显微镜下观察96孔板，标记出明显仅含有单个细胞或由单个细胞分裂而来的两个细胞的孔位。每天观察培养板，并每三天更换一次培养基。培养细胞约一周，直至细胞融合度达到约80%。随后，用200微升PBS和胰蛋白酶冲洗已标记的孔。用 100 微升 PBS 胰蛋白酶 EDTA 溶液洗涤细胞。去除 PBS 胰蛋白酶 EDTA 溶液。加入 100 微升维持培养基，将每个标记孔中的细胞转移至六孔板的一个孔中，每孔含 1 毫升维持培养基。将细胞在六孔板中培养三天后，将细胞分别转移至 T25 培养瓶中。定期冻存细胞系，以便在细胞表现不一致时可重新取用。为确定反应最强的细胞系，可使用活性配体（如受体、肽、配体或其他阳性对照激动剂）通过钙离子生物发光检测法对转移后的细胞进行检测。钙离子生物发光检测将在本视频的后续部分详细演示。在继续实验之前，需再次进行单细胞筛选。当选择克隆细胞系用于检测并进行培养时，必须密切记录传代次数，因为高传代次数的细胞可能在T25培养瓶中失去正常功能。将表达目标受体的细胞系在维持培养基中培养至约90%汇合度。消化并离心细胞后，用维持培养基重悬细胞，再用维持培养基将细胞稀释约10倍，使用血细胞计数板计数细胞数量。随后将细胞浓度调整至约2×10⁵个细胞/毫升，每孔接种2毫升细胞于6孔板的每个孔中，于37℃孵育24小时，使细胞在开始钙离子生物发光板检测前达到约60%汇合度。将目的报告基因构建到表达载体中。此处使用在线粒体中表达的群体感应报告系统。然后按照书面实验方案所述，用一微克该报告质粒转染细胞。将细胞在六孔板中培养24小时后，用胰蛋白酶消化，离心并重悬，调整细胞浓度至每毫升40万个细胞，并将100微升细胞悬液转移至96孔白色、薄底微孔板的每个孔中，继续培养24小时，直至细胞融合度达到约80%。此为进行生物发光检测的最佳细胞浓度。以下步骤应在避光条件下操作，但本视频中在光照下展示。为演示起见，准备足量不含钙的 DME 培养基，其中含有 5 µM CHO terezin，每孔加入 90 µL。移除培养板中的旧培养基，每孔加入 90 µL 新培养基。将培养板在 37°C 和 5% CO₂ 条件下避光孵育 3 小时，之后细胞即可用于检测。本演示使用Nova star酶标仪在生物发光模式下进行。开始前，需将微孔板放入暗处的板架中，仪器将自动进行吹扫。在1.5毫升EOR离心管中溶解肽段。使用足量的无钙DME培养基，每孔加入10微升10倍浓度的肽溶液。使用前设定移液深度及肽溶液的位置。用10微升肽溶液刺激细胞，并立即开始记录发光信号。在本实验中，仪器设置为每2秒记录一次每个孔在465纳米处的发光信号，总记录时间为50秒。运行结束后，清洗仪器泵。对每种肽样品重复上述过程，保存数据，并在检测结束后再次清洗仪器泵。软件程序会自动将每个孔的发光数据传输到 Microsoft Excel 数据表中。将 Excel 中的数据粘贴至 Prism 软件 4.0。以不同肽浓度为横轴，以生物发光单位为纵轴，绘制图形。在 Y 轴上，选择非线性回归曲线拟合分析，以获得每种肽段对应的 EC 50 值的浓度-反应曲线。每次实验应重复三次以进行数据分析。当在中国仓鼠卵巢 K1 细胞中表达时，埃及伊蚊的激肽受体表现为一种多配体受体，并能对低至一个氨基酸的刺激产生功能性反应。采用钙依赖性生物发光板法对三种内源性埃及伊蚊激肽单独进行测试，测得其EC50值具有统计学差异，分别为：埃及伊蚊激肽3约16纳摩尔，埃及伊蚊激肽2为26纳摩尔，埃及伊蚊激肽1为49纳摩尔， potency排序结果表明，埃及伊蚊激肽3活性最强，埃及伊蚊激肽1活性最弱。下图为六种α-氨基异丁酸激肽类似物在表达蜱虫激肽受体的中国仓鼠卵巢K1细胞系中的活性比较，检测方法为钙依赖性生物发光板法。Y 轴表示每种类似物在特定浓度下测得的生物发光单位占该类似物在所有测试浓度中所观察到的最大反应的百分比。KININE HEXA 肽 F-F-F-S-W-G 酰胺是受体活性的阳性对照。单取代的速激肽类似物 F-氨基异丁酸-F-S-W-G 酰胺的活性高于阳性对照 HEXA 肽 KININE 类似物；而双取代的 KININE 类似物，即氨基异丁酸-F-氨基异丁酸-S-W-G 酰胺，是所有测试的双取代类似物中活性最强的。观看本视频后，您应能够充分理解如何表达 A-G-P-C-R，并获得克隆细胞系，以通过钙依赖性生物发光检测法分析配体在受体上的构效关系。

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科研

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