一种用于蚊子（Aedes aegypti）和蜱虫（Rhipicephalus microplus）G蛋白偶联受体功能分析的钙离子生物发光检测法

以下实验的总体目标是分析合成节肢动物神经肽与其同源G蛋白偶联受体（GPCR）之间的构效关系。首先，将中国仓鼠卵巢K1空细胞转染目标G蛋白偶联受体表达载体，获得源自单细胞的稳定转化细胞系；第二步，将该稳定细胞系转染携带报告基因Gina Quaran的quaran质粒，用于在钙依赖性生物发光板检测中测量细胞内生物发光信号。随后，通过钙依赖性生物发光板检测，测定肽配体作用于这些重组细胞后胞质内钙离子水平的变化。

实验结果表明，将结构不同的肽或不同浓度的肽作用于重组细胞后，由于细胞内钙离子释放被孔青素报告分子在平板检测中所捕获，因而观察到生物发光单位存在差异。相较于瞬时转染和表达方案，使用稳定转染并表达重组G蛋白偶联受体（GPCR）的克隆细胞系的主要优势在于受体表达水平更加均一，从而保证了实验的一致性和结果的可重复性。此外，将孔青素蛋白靶向定位至线粒体，可实现通过生物发光进行高灵敏度的钙离子检测。本次实验将由本实验室的两名研究生Shallin Lie和Simon Kersch，以及一名博士后共同完成。

建立稳定细胞系时，首先在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中培养中国仓鼠卵巢K1空载细胞。待细胞生长状态良好后，使用含1×抗生素-抗真菌剂的生长培养基维持培养。将中国仓鼠卵巢K1细胞接种至T25细胞培养瓶中，加入不含抗生素的生长培养基过夜培养，直至细胞融合度达到约30%。

转染前，按照书面实验方案所述，准备含有目标G蛋白偶联受体（GPCR）的DNA表达载体。将DNA与100微升Optum低血清培养基混合。

将6微升脂质体转染试剂加入100微升F12K无血清培养基中，室温孵育30至45分钟。孵育结束后，将DNA溶液与脂质体预混液在15毫升离心管中逐滴轻轻混合。室温静置10至15分钟。

将转染混合物以逐滴方式轻轻混入1.8毫升新鲜F12K培养基中。然后用PBS洗涤细胞，并将此新的转染溶液加入细胞中。于37°C孵育18小时。

将培养基更换为F12K培养基（含10% FBS，不含抗生素），并于次日继续培养过夜。按照书面实验步骤所述，将细胞以F12K培养基（含10% FBS，不含抗生素）传代至两个T25培养瓶中。再继续培养18小时。

用筛选培养基替换原有培养基。随后使用筛选培养基持续培养细胞三至四周，以筛选出已将质粒稳定整合至基因组DNA中的细胞。

持续使用维持培养基培养细胞，并定期冻存细胞系，以防止因意外污染造成细胞丢失。为筛选单克隆细胞系，首先用胰蛋白酶消化细胞，然后按照书面实验方案所述，用维持培养基离心收集细胞。随后，将细胞重悬于5 mL维持培养基中。

取出0.5毫升细胞悬液，加入4.5毫升新鲜维持培养基，制成10倍稀释液，取100微升该10倍稀释液加入96孔板的12个孔中，以筛选单个细胞。将这些细胞继续进行约19次10倍连续稀释，理论上最终悬液浓度为每100微升含一个细胞，并将每次连续稀释后的100微升分别转移至96孔板的12个孔中。在37°C孵育18小时后，在倒置光学显微镜或荧光显微镜下观察96孔板，标记出明显仅含有单个细胞或由单个细胞分裂而来的两个细胞的孔位。

每天观察培养板，并每三天更换一次培养基。培养细胞约一周，直至细胞融合度达到约80%。随后，用200微升PBS和胰蛋白酶冲洗已标记的孔。

用 100 微升 PBS 胰蛋白酶 EDTA 溶液洗涤细胞。去除 PBS 胰蛋白酶 EDTA 溶液。加入 100 微升维持培养基，将每个标记孔中的细胞转移至六孔板的一个孔中，每孔含 1 毫升维持培养基。

将细胞在六孔板中培养三天后，将细胞分别转移至 T25 培养瓶中。定期冻存细胞系，以便在细胞表现不一致时可重新取用。为确定反应最强的细胞系，可使用活性配体（如受体、肽、配体或其他阳性对照激动剂）通过钙离子生物发光检测法对转移后的细胞进行检测。

钙离子生物发光检测将在本视频的后续部分详细演示。在继续实验之前，需再次进行单细胞筛选。当选择克隆细胞系用于检测并进行培养时，必须密切记录传代次数，因为高传代次数的细胞可能在T25培养瓶中失去正常功能。

将表达目标受体的细胞系在维持培养基中培养至约90%汇合度。消化并离心细胞后，用维持培养基重悬细胞，再用维持培养基将细胞稀释约10倍，使用血细胞计数板计数细胞数量。随后将细胞浓度调整至约2×10⁵个细胞/毫升，每孔接种2毫升细胞于6孔板的每个孔中，于37℃孵育24小时，使细胞在开始钙离子生物发光板检测前达到约60%汇合度。

将目的报告基因构建到表达载体中。此处使用在线粒体中表达的群体感应报告系统。然后按照书面实验方案所述，用一微克该报告质粒转染细胞。

将细胞在六孔板中培养24小时后，用胰蛋白酶消化，离心并重悬，调整细胞浓度至每毫升40万个细胞，并将100微升细胞悬液转移至96孔白色、薄底微孔板的每个孔中，继续培养24小时，直至细胞融合度达到约80%。此为进行生物发光检测的最佳细胞浓度。以下步骤应在避光条件下操作，但本视频中在光照下展示。

为演示起见，准备足量不含钙的 DME 培养基，其中含有 5 µM CHO terezin，每孔加入 90 µL。移除培养板中的旧培养基，每孔加入 90 µL 新培养基。将培养板在 37°C 和 5% CO₂ 条件下避光孵育 3 小时，之后细胞即可用于检测。

本演示使用Nova star酶标仪在生物发光模式下进行。开始前，需将微孔板放入暗处的板架中，仪器将自动进行吹扫。在1.5毫升EOR离心管中溶解肽段。

使用足量的无钙DME培养基，每孔加入10微升10倍浓度的肽溶液。使用前设定移液深度及肽溶液的位置。用10微升肽溶液刺激细胞，并立即开始记录发光信号。

在本实验中，仪器设置为每2秒记录一次每个孔在465纳米处的发光信号，总记录时间为50秒。运行结束后，清洗仪器泵。对每种肽样品重复上述过程，保存数据，并在检测结束后再次清洗仪器泵。

软件程序会自动将每个孔的发光数据传输到 Microsoft Excel 数据表中。将 Excel 中的数据粘贴至 Prism 软件 4.0。以不同肽浓度为横轴，以生物发光单位为纵轴，绘制图形。

在 Y 轴上，选择非线性回归曲线拟合分析，以获得每种肽段对应的 EC 50 值的浓度-反应曲线。每次实验应重复三次以进行数据分析。当在中国仓鼠卵巢 K1 细胞中表达时，埃及伊蚊的激肽受体表现为一种多配体受体，并能对低至一个氨基酸的刺激产生功能性反应。

采用钙依赖性生物发光板法对三种内源性埃及伊蚊激肽单独进行测试，测得其EC50值具有统计学差异，分别为：埃及伊蚊激肽3约16纳摩尔，埃及伊蚊激肽2为26纳摩尔，埃及伊蚊激肽1为49纳摩尔， potency排序结果表明，埃及伊蚊激肽3活性最强，埃及伊蚊激肽1活性最弱。下图为六种α-氨基异丁酸激肽类似物在表达蜱虫激肽受体的中国仓鼠卵巢K1细胞系中的活性比较，检测方法为钙依赖性生物发光板法。

Y 轴表示每种类似物在特定浓度下测得的生物发光单位占该类似物在所有测试浓度中所观察到的最大反应的百分比。KININE HEXA 肽 F-F-F-S-W-G 酰胺是受体活性的阳性对照。单取代的速激肽类似物 F-氨基异丁酸-F-S-W-G 酰胺的活性高于阳性对照 HEXA 肽 KININE 类似物；而双取代的 KININE 类似物，即氨基异丁酸-F-氨基异丁酸-S-W-G 酰胺，是所有测试的双取代类似物中活性最强的。观看本视频后，您应能够充分理解如何表达 A-G-P-C-R，并获得克隆细胞系，以通过钙依赖性生物发光检测法分析配体在受体上的构效关系。