Name: 电解下腔静脉静脉血栓形成的模型（EIM） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 学习使用电解下腔静脉模型在小鼠体内诱导静脉血栓形成的方法。该模型通过施加电流损伤血管内皮，在持续血流条件下形成血栓，适用于研究不同品系小鼠的血栓特征及溶栓机制。

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由美国国立卫生研究院（NIH）1P01HL089407-01A1（Lawrence，项目负责人）、动物核心A及NIH 1K01HL080962-01A2（Myers，项目负责人）资助。

1. 小鼠麻醉操作
<ol>
 <li>将动物从笼中取出，放入麻醉前诱导室，以 0.5 升/分钟的流速（通过蒸发器控制）吸入 2% 异氟烷和 100% 氧气进行气体麻醉诱导。</li>
 <li>小鼠在麻醉诱导室中镇静后，从室内取出，使用电推剪剃除腹侧腹部毛发；若使用脱毛剂，则小鼠保留在诱导室内（1 分钟）。</li>
 <li>在持续镇静状态下，称重小鼠，用无菌眼膏润滑眼睛，然后将其仰卧位置于循环温水加热装置上，在通过鼻罩给予异氟烷和氧气的全身麻醉下进行操作。此时，氧气流速降至 0.2 升/分钟。</li>
 <li>用氯己定溶液喷洒腹部（二乙酸氯己定具有快速杀菌和持久作用），并用无菌纱布擦拭三次，直至手术区域清洁。</li>
</ol>
2. 小鼠显微外科及术后恢复操作
<ol>
 <li>使用虹膜剪在皮肤和腹壁上做一条2 cm的腹正中切口，暴露腹腔。用无菌生理盐水浸湿的2×2纱布将肠管推向动物左侧。放置小鼠固定器，以便观察下腔静脉（IVC）。</li>
 <li>此时将异氟烷浓度降低至维持水平（2%），氧气流速保持在0.2升/分钟，直至手术结束。</li>
 <li>使用无菌棉签和超精细虹膜半弯组织镊进行钝性分离。操作小鼠组织时需格外小心，因其极为脆弱。</li>
 <li>从肾静脉至髂总分叉之间的所有下腔静脉侧支均用7-0非反应性聚丙烯缝线结扎，而后侧支保持开放。</li>
 <li>在电解诱导下腔静脉血栓模型（EIM）中，将连接至镀银铜线（KY-30-1-GRN, Electrospec, Dover, NJ）的25G不锈钢针插入暴露的尾端下腔静脉（见图1），并紧贴前壁放置（作为阳极）。</li>
 <li>另一根导线皮下植入，以完成电路（作为阴极）。</li>
 <li>使用Grass S48方波刺激器和恒流单元（Grass Technologies, An Astro-Med, Inc., West Warwick, RI）施加250 μA电流，持续15分钟。直流电流导致电解产物生成，这些毒性产物腐蚀下腔静脉内皮表面，促进血栓形成环境，进而引发血栓形成。</li>
 <li>15分钟后取出针头，并用棉签轻压穿刺部位以防止出血。</li>
 <li>在假手术组动物中，将针插入下腔静脉后立即拔出，不施加电流。</li>
 <li>腹壁切口采用两层缝合法关闭。本实验室使用5-0薇乔线（合成缝线）连续缝合关闭腹壁，皮肤则使用医用粘合剂闭合，无需留置体表缝线，术后无需拆线。</li>
 <li>术后小鼠置于独立笼具中恢复，在加热灯下密切观察45分钟至2小时（加热灯与笼具最小距离为24英寸），随后返回原饲养单元。若不影响研究目的，可使用镇痛药和抗炎药物。如需不给予镇痛药物，须提供科学依据，并获得兽医及IACUC批准。本实验室发现，皮下注射布托啡诺（Buprenorphine）0.05–0.1 mg/kg是小鼠术前和术后优良的镇痛方案。此外，当全身性镇痛可能干扰实验结果时，可在切口部位注射利多卡因（4 mg/kg，即1%溶液0.4 ml/kg）进行局部镇痛。</li>
 <li>我们通常未观察到因深静脉血栓（DVT）导致的术后不良反应。然而，可能的术后并发症包括麻醉意外死亡、术中失血以及因神经损伤导致的部分轻瘫。恢复缓慢的动物可给予营养凝胶或将湿润饲料置于笼底以促进恢复。出现严重术后并发症的动物应实施人道安乐死。</li>
 <li>在预定时间点，依据美国兽医协会（AVMA）《啮齿类动物安乐死指南》推荐的方法实施人道安乐死。</li>
</ol>
3. 典型结果
EIM 是一种在持续血流条件下形成血栓的模型。下图展示了在此新型模型中研究的各项参数。
 <img src="/files/ftp_upload/2737/2737fig1.jpg" alt="显示下腔静脉、主动脉及导丝插入进行血管通路的血管内操作示意图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
 图 1 展示了插入连接银镀铜线的25G不锈钢针（KY-30-1-GRN，Electrospec，美国新泽西州多佛）的解剖区域。请注意，几乎总存在一个淋巴结，可作为定位尾侧下腔静脉的解剖标志。
 <img src="/files/ftp_upload/2737/2737fig2.jpg" alt="血栓重量比较，EIM，柱状图，PAI-1，WT，^CT，统计分析，p值。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
 图 2：不同品系小鼠在EIM后2天的血栓重量。如预期所示，PAI-1基因敲除（KO）小鼠的血栓重量较低，而高凝状态的Delta CT小鼠（^CT）血栓重量较大。
 <img src="/files/ftp_upload/2737/2737fig3.jpg" alt="运动后两天不同实验组可溶性P-选择素水平的柱状图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
 图3：可溶性P-选择素是深静脉血栓形成的标志物，在不同小鼠品系中进行了检测。其中，PAI-1基因敲除小鼠的水平最低，而高凝状态的delta CT小鼠的水平最高。
 <img src="/files/ftp_upload/2737/2737fig4.jpg" alt="显示P-选择素与血栓重量相关性的图表；EIM后蛋白质水平的数据分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
 图4 在不同品系中均发现血栓重量与可溶性P-选择素之间存在相关性。值得注意的是，在形成较小血栓的组别中，检测到的可溶性P-选择素水平最低（PAI-1基因敲除小鼠）。而在形成最大血栓的组别中，检测到的可溶性P-选择素水平最高（高凝状态delta CT小鼠）。
 <img src="/files/ftp_upload/2737/2737fig5.jpg" alt="超声成像，静脉血流方向，血栓检测，医学分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
 图 5：为了证实血流的存在，在接受电诱导损伤（EIM）的小鼠中进行了超声成像。图 5 显示了小鼠在 EIM 后第 2 天的超声检查结果，随后采集了标本。请注意，血栓的形态提示其在血流存在的情况下形成

<ol><li>Diaz, J. A., Hawley, A. E., Alvarado, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombogenesis+with+continuous+blood+flow+in+the+inferior+vena+cava.+A+novel+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model.</a> Thromb Haemost. 104, 366-375 (2010).</li>
<li>Eitzman, D. T., Westrick, R. J., Nabel, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor-1+and+vitronectin+promote+vascular+thrombosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor-1 and vitronectin promote vascular thrombosis in mice.</a> Blood. 95, 577-580 (2000).</li>
<li>Myers, D., Farris, D., Hawley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectins+influence+thrombosis+in+a+mouse+model+of+experimental+deep+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Selectins influence thrombosis in a mouse model of experimental deep venous thrombosis.</a> J Surg Res. 108, 212-221 (2002).</li>
<li>Myers, D. D., Hawley, A. E., Farris, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+and+leukocyte+microparticles+are+associated+with+venous+thrombogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">P-selectin and leukocyte microparticles are associated with venous thrombogenesis.</a> J Vasc Surg. 38, 1075-1089 (2003).</li>
<li>Pierangeli, S. S., Barker, J. H., Stikovac, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+human+IgG+antiphospholipid+antibodies+on+an+in+vivo+thrombosis+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Effect of human IgG antiphospholipid antibodies on an in vivo thrombosis model in mice.</a> Thromb Haemost. 71, 670-674 (1994).</li>
<li>Pierangeli, S. S., Liu, X. W., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+thrombosis+in+a+mouse+model+by+IgG%2C+IgM+and+IgA+immunoglobulins+from+patients+with+the+antiphospholipid+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Induction of thrombosis in a mouse model by IgG, IgM and IgA immunoglobulins from patients with the antiphospholipid syndrome.</a> Thromb Haemost. 74, 1361-1367 (1995).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

小鼠是进行体内实验的优良研究工具，因此有必要建立能够紧密模拟疾病或病理状态的小鼠模型。目前已采用多种静脉血栓小鼠模型来研究深静脉血栓（DVT），包括：光化学法（2）、血流停滞法（3-4）和机械损伤法（5-6）。然而，这些模型均未在持续血流存在的情况下，利用血管内皮刺激来诱导血栓形成。EIM模型通过在下腔静脉（IVC）内施加电解刺激，在血流持续存在的条件下通过内皮细胞活化促进静脉血栓形成（1）。该模型技术操作简便，可重复性高，且具有高达99%的存活率。尽管使用电流引发电解反应，但并不会产生热量（1）。EIM模型能够较好地模拟临床DVT，因此是研究血栓形成与溶解内在机制的有力工具，同时也适用于推动抗血栓新疗法的发展。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>英维特罗根</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr></tbody></table>

静脉血栓形成的电解下腔静脉模型（eim）

Electrolytic Inferior Vena Cava Model (EIM) of Venous Thrombosis

动物模型在深静脉血栓（DVT）研究中发挥着至关重要的作用，可用于研究血栓形成、血栓溶解以及测试潜在的治疗化合物（1）。目前，正在开发用于DVT治疗和预防的新化合物。将潜在的治疗性拮抗化合物递送至受累的血栓静脉一直存在困难。在治疗应用背景下，一种利用部分血流停滞并能在主要静脉内稳定生成血栓的模型 recently established。电解性下腔静脉模型（EIM）是一种允许在持续血流存在条件下形成血栓的DVT小鼠模型。该模型使治疗剂能够以动态方式与血栓接触，且比其他DVT模型更为敏感（1）。此外，该血栓形成模型 closely simulates 临床血栓形成的实际情况，是研究静脉内皮细胞活化、白细胞迁移、静脉血栓形成机制以及测试治疗应用的理想选择（1）。EIM模型技术操作简单，易于重复，可产生大小一致的血栓，并能获得较大的样本量（即血栓和静脉壁），满足分析需求。

通过电解诱导下腔静脉内表面内皮细胞活化，可导致静脉型血栓形成，其机制涉及内皮细胞活化和部分血流淤滞，这两者均为维尔肖三联征的组成部分。

静脉血栓形成的电解下腔静脉模型（EIM）

动物模型在深静脉血栓（DVT）研究中发挥着至关重要的作用，可用于研究血栓形成、血栓溶解过程，以及检验潜在的……

本实验的总体目标是利用电解法下腔静脉（Vanna CVA）模型在小鼠体内诱导静脉血栓形成。首先打开腹腔以暴露下腔静脉（Vanna CVA）或 IVC，随后结扎 IVC 的侧支血管。然后插入阳极和阴极，并施加电流以诱导血栓形成。最后，关闭手术切口并让动物恢复。最终可获得结果，显示在血流存在的情况下，小鼠下腔静脉内形成了静脉血栓，且不同品系小鼠中果胶水平与血栓大小之间存在相关性。Lucchesi 博士于1980年发表了该技术的概念，并在动脉系统中成功应用。当我加入密歇根大学的实验室时，我的任务是修改这一原始技术，使其可用于静脉系统。在此过程中，我考虑到血流方向，认为应将针头插入下腔静脉（IVC）起始处附近。为了在小鼠体内诱导深静脉血栓形成，首先将动物置于预手术麻醉室中，使用5%异氟烷和100%氧气进行麻醉，气体流速为每分钟0.5升。待小鼠进入镇静状态后，将其从麻醉室中取出，使用电动剪刀剃除腹部腹侧的毛发，随后称量小鼠体重。然后涂抹眼膏，并在异氟烷和100%氧气全身麻醉下，将其仰卧于循环温水加热垫上。为消毒切口区域，用氯己定溶液喷洒腹部，并用无菌纱布擦拭。重复三次，直至手术部位清洁。开始手术时，使用虹膜剪在皮肤和腹壁上做一个两厘米长的腹侧正中切口，暴露腹腔。用一块浸有无菌生理盐水的2英寸×2英寸纱布将肠管推向动物左侧。然后固定小鼠固定器，以暴露下腔静脉（IVC）。从此处开始，使用2%异氟烷和每分钟0.2升氧气的维持浓度。使用无菌涂药器棉签和超细弯头虹膜组织镊，钝性分离下腔静脉（IVC）两侧的筋膜，以充分暴露下腔静脉及其分支。注意附近有一个淋巴结，可作为解剖标志，借助7-0非反应性聚丙交酯缝线定位下腔静脉。结扎从肾静脉至髂总分叉处的所有下腔静脉侧支，后方分支保持开放。接着，将连接有镀银铜丝的25号不锈钢针插入暴露的下腔静脉段，并将其置于前壁处。这是阳极。然后将另一根带导线的针头皮下植入，以完成电路。这是阴极。使用草 S 48 方波刺激器和恒流装置，在 15 分钟内施加 250 微安的电流。这将侵蚀下腔静脉（IVC）的内皮表面，形成血栓作为对照。动物操作：将针插入下腔静脉持续 15 分钟，不施加电流。通常在操作过程中可观察到轻微变化，例如针尖附近出现少量黑点，以确认操作成功。15分钟后，通过将针头向背侧降低，并在针头穿刺点上方使用棉签，使血液重新充盈下腔静脉（IVC）针头周围的管腔，然后拔出针头。拔针时向下按压静脉。用棉签轻轻按压，直至出血停止。关闭腹腔切口时，使用5-0薇乔合成缝线以连续缝合方式关闭腹壁。然后涂抹医用粘合胶关闭皮肤。将小鼠置于加热灯下的独立笼具中恢复，并密切观察，待其恢复后再放回原有饲养单元。EIM 是一种在持续血流条件下形成血栓的模型。下图展示了在此新型模型中研究的各项参数。如预期所示，在 EIM 术后两天，小鼠品系的血栓重量（作为血栓大小的测量指标）已呈现出来。PA I-1基因敲除小鼠的血栓重量较低，已知这些小鼠纤溶活性增强，继而形成较小的血栓；而使用ELA可溶性果胶的高凝状态delta CT小鼠血栓重量较高。在不同品系小鼠中检测了深静脉血栓形成的标志物。其中PI-1基因敲除小鼠的水平最低，而高凝状态delta CT小鼠的水平最高。该图显示了在生成较小血栓的 PI 一型敲除小鼠中，不同小鼠品系的血栓重量与可溶性果胶之间的相关性。所检测到的可溶性果胶含量最低；而 delta CT 小鼠生成的血栓最大，其可溶性果胶的检测水平最高。为了证实血流的存在，对接受 EIM 处理的小鼠进行了超声检查。该图显示了小鼠在 EIM 后两天的超声结果。请注意，血栓的形状提示其是在有血流的情况下形成的。在该操作过程中，始终密切关注我们的患者至关重要。低体温是术后期间最严重影响动物生命及其研究结果的关键因素。

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电解下腔静脉静脉血栓形成的模型（EIM）

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