"发光法"的分类检测细菌病原体的记者噬菌体

叶丝酵母菌和炭疽芽孢杆菌是 A 类细菌病原体，分别是鼠疫和炭疽的病原体。尽管这两种疾病的自然发生现在相对罕见，但恐怖组织使用这些病原体作为生物武器的可能性是真实的。本视频演示了一种检测和识别鼠疫耶尔森菌的方法。

首先，微生物在农用板和液体培养基中生长。接下来，将鼠疫耶尔梅菌特异性报告基因 pH 添加到培养物中。报告基因 pH 在其基因组中含有编码细菌荧光素酶 Luxe AB 的基因。

如果存在 Y pesti 细胞，报告噬菌体将特异性地与细胞结合，注射其重组 DNA，携带 luxe AB 基因，并将使用宿主的转录和翻译机制转录和翻译 luxe AB 报告基因获得的结果显示样本已获得生物发光表型，表明未知微生物已被明确鉴定为瘟疫的原因。与传统噬菌体裂解测定等现有方法相比，该技术的主要优点是检测和鉴定高级鼠疫所需的时间是几分钟而不是几天。该方法有助于使用分离的培养物或直接从复杂的临床或环境样本中快速识别、检测 Yesenia pesti 的存在。

这种技术的影响延伸到鼠疫的诊断，因为如果在症状出现后的前 24 小时内不治疗，这种疾病通常是致命的。因此，及时识别 Yesenia 害虫对于积极的预后至关重要。由于几乎所有细菌物种都存在噬菌体，因此该方法可能适用于在医学、环境或农业上对重要鼠疫耶尔

A 1122 是生物安全 2 级排除的选择剂菌株。它缺乏 75 Kilobase Perlo 钙反应或 LCR 毒力质粒，以及毒力所需的 PGM 基因座。在使用无菌技术 streak Y pestis， A 1122 的 2 类 a 型生物安全柜下开始此程序。

如图所示，将培养物储存到 LB 琼脂上。将板倒置在 28 摄氏度的静态温控空气培养箱中 48 小时。鼠疫耶尔森菌的生长速度较慢，两天后生成时间为 1.25 小时。

使用无菌金属接种环挑选单个鼠疫 Y 菌落。选择一个大小均匀的菌落，表示其他菌落，并与平板上的其他菌落明显分开。将菌落转移到含有 2 mL LB 肉汤的无菌 17 x 100 mm 培养管中。

短暂盖上试管涡旋，然后将其置于 225 RPM、28 摄氏度的振荡培养箱中约 20 小时。对于该检测，活性生长的细胞更适合检测。由于噬菌体的转导能力，生物发光反应与宿主细菌的活力和适应性相关。

尽管如此，该检测系统已被证明与在生长周期的所有阶段收获的细胞兼容。生长 20 小时后，将 500 μL 细胞添加到 10 mLlb 肉汤中，在 50 mL锥形管中将鼠疫耶尔森菌培养物稀释1至20。将培养物放回 28 摄氏度的振荡培养箱中。

让培养物生长，直到达到 600 纳米的光密度 0.2。生成生物发光反应底物大约需要 5 小时。将 200 微升 N 癸醛与 9.8 毫升 LB 肉汤混合，制备 2% N 癸醛溶液。

剧烈涡旋 5 秒钟。旁边灌注微孔板发光计进样器。将进样器管的一行和一根含有 13% 末端贴花溶液的 2 毫升管和另一端放入废液容器中。

使用设备软件，指示机器用 2 毫升 10 升 10 毫升溶液灌注注射器管路。完成后，管线应充满底物，将进样器的末端管线放回其设定位置，准备注入孔中。接下来，指示光度计将 67 微升 deel 溶液自动注入每个微孔板。

然后立即测量发射的生物发光水平 10 秒。接下来，要制备每个样品并一式三份，请为每种条件标记三个培养管。在这里，除了测试样品外，还将准备仅相位对照和仅细胞对照。

因此，需要 9 个试管来制备仅噬菌体对照样品，将 1 毫升等分试样的 lb 肉汤分配到三个培养管中。加入 20 μL 报告噬菌体。储备液争用 5 乘以 10 至第九个噬菌斑形成单位或每管每毫升 PFU。

在没有鼠疫耶尔丝菌细胞的情况下，添加噬菌体报告不应引起生物发光反应。接下来，为了制备测试样品，将 1 毫升等分试样的 Y pesti 培养物分配到三个培养管中。向其中三种培养物中加入 20 μL 报告噬菌体原液。

通过短暂涡旋混合培养物以单独制备细胞。用于测定背景自动生物发光的阴性对照将 1 毫升等分试样的鼠疫耶尔森菌培养物分配到三个额外的培养管中。样品制备完成后，将 200 μL 从每种培养物转移到白色 96 孔微量滴定板的孔中，以时间零读数。

使用微孔板发光计将每种培养物的其余部分放入 28 摄氏度的摇床中。测量时间。生物发光或相对光单位的零样本。

通过从每种培养物中收集 200 微升并在 20、30、40 和 60 分钟在微孔板发光仪中进行读数来进行生物发光测量。添加报告噬菌体以加快检测过程，无需鼠疫杆菌生长后，将集落从新鲜生长的板转移到含有 200 μL lb 的微量离心管中，其中含有报告噬菌体。通过涡旋混合样品，然后将细胞噬菌体混合物分配到微量滴定板的孔中。

将微量滴定板在 28 摄氏度下孵育 60 分钟。然后读取样品以进行生物发光。本视频中演示的检测试剂盒检测了引言中描述的鼠疫耶尔丝菌细胞的存在。

当鼠疫耶尔森菌存在时，报告噬菌体与细胞上的特异性受体结合，注入其 DNA，并使用宿主的转录和翻译机制转录和翻译 luxe。一个报告基因。信号强度和信号响应时间与高浓度细胞下的细胞数量成正比，每毫升 10 到 5 到 10 到 8 CFU。

与对照组相比，在较低细胞浓度（每毫升 10 至 2 至 10 至 4 CFU）下，RLU 应在 20 分钟内明显增加。RLU 应在 40 至 60 分钟内明显增加。报告基因、噬菌体介导的鼠疫耶尔森菌检测的代表性时程实验在此处显示为零次。

将报告噬菌体和细胞混合，在 28 摄氏度下孵育，并监测生物发光 RLU 随时间的变化。RLU 在 12 分钟内明显增加，当 P 值小于 0.05 时，P 值显著，仅噬菌体或仅细胞阴性对照在整个 60 分钟孵育过程中提供约 20 RLU 的生物发光基线水平。请注意，基线水平是特定于光度计的。

相比之下，在 phia 版后 12 分钟，测试样品报告细胞的生物发光增加是明显的。信号强度应在 50 分钟内稳步增加，但此处未显示，但超过 80 分钟的孵育将导致信号由于噬菌体介导的宿主细胞裂解而从峰值信号下降。在 37 摄氏度的孵育温度下也能获得类似的结果，即使鼠疫耶尔森菌生长的最佳温度是 28 摄氏度。

看完这个视频，你应该对如何使用重组报告文学进行检测有了很好的了解。一旦掌握了鼠疫叶森菌的鉴定，该技术可以在 30 分钟内使用 S Golden 菌落作为初始接种物进行。在实验室尝试此程序并使用噬菌体时，重要的是要记住，噬菌体很容易污染您的细菌原液培养物，以减少污染的可能性。

使用一次性塑料衣物，并定期更换手套。报告文学引发 Blum 反应的能力与细胞的适应性相关。因此，在鉴定出 Yesenia Pesta 之后，该报告可用于确定分离株的抗生素敏感性。

例如，与抑制浓度抗生素一起孵育的 Yesenia pesta 细胞将无法或严重削弱其产生生物发光信号的能力。相比之下，具有抗生素抗性的 Yesenia pesta 细胞不会因抗生素的存在而受到损害，并且能够引发类似于未受抑制细胞的生物发光反应。因此，可以快速确定病原体对抗生素的敏感性概况。

为了便于说明，我们使用了减毒的 Yesenia pesta 菌株。在这个实验中，Yesenia 害虫是一个类别，一种细菌病原体。当对 Harbor Yesenia Pestis 检查的样品进行此技术时，必须遵循适当的生物安全和生物危害预防措施。