Name: 轴突伸展生长:神经生长Mechanotransduction (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 了解轴突伸展生长技术，通过生物反应器系统对神经元施加拉伸力，实现每日高达10毫米的持续生长速率。该方法有助于研究神经发育机制，为神经损伤治疗提供新策略。

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本工作由美国国家科学基金会职业奖（NSF CAREER CBET-0747615）资助。作者谨此感谢 Douglas H. Smith 博士和 David F. Meaney 博士提供的指导与支持。

1. 轴突拉伸生长生物反应器系统概述
<ol>
	<li>已采用两种主要方法对神经元施加实验性力。第一种方法是对整个神经元施加力（Lu, Franze 等 2006；Chetta，Kye 等 2010；Lindqvist，Liu 等 2010）。第二种方法是通过直接牵拉生长锥，对轴突施加外力。利用玻璃针，该方法已被用于模拟新轴突的形成（Bernal, Pullarkat） 等 2007；O'Toole，Lamoureux 等 2008；Lamoureux，Heidemann 等 2010)，以确定伸长和回缩的力阈值（Dennerll, Lamoureux 等 1989；Zheng，Lamoureux 等 1991；Lamoureux，Zheng 等 1992)，以及分析轴突末端中神经递质的聚集情况（Siechen, Yang 等 2009）。该方法的一种独特的组织工程拓展被开发用于利用自动化的轴突拉伸生长（ASG）生物反应器系统制备大型神经结构（Iwata, Browne 等 2006；Pfister，Iwata 等 2006）。最近，我们开发了一种微型化的生物反应器系统，用于实时显微观察ASG（Loverde, Ozoka 等 2011）。本文详细介绍了我们目前用于制备生物反应器并常规开展ASG的9天实验方案（表1）。</li>
	<li>整体操作ASG 生物反应器系统由三个主要部分组成：1）带有独立通道（细长孔）的生物反应器腔室，用于培养和拉伸神经元；2）自动线性运动平台，用于施加拉伸力；3）配备软件的步进电机驱动控制器，用于控制拉伸生长（图1）。</li>
	<li>简而言之，生物反应器原型的制备在机加工车间使用立式铣床（Bridgeport，Elmira，NY）完成。出于生物相容性、易于灭菌和耐用性的考虑，生物反应器内部组件采用3/8英寸聚醚醚酮（PEEK）加工而成。盖子采用透明聚碳酸酯材料，以便进行光学显微观察和培养物的可视化。耐腐蚀的316不锈钢螺丝和配件用于完成整体组装（McMaster-Carr，Elmhurst，IL）。</li>
	<li>的 生物反应器腔室 由一个形成三条通道的拉伸框架、一个可调节的牵引块（用于在通道上操控细胞）以及用于外部操作的突出牵引杆组成（图2）。神经元培养物被接种在由牵引块支撑的一次性Aclar牵引培养基底上（图2） &amp; 3). 一次性盖玻片固定基底连接在拉伸支架底部，并横跨全部3个通道。在拉伸前，已接种的神经元必须通过生长锥的延伸，从牵引基底延伸出轴突至固定基底。跨越两个基底的轴突群体将通过控制牵引块的位移而接受拉伸。</li>
	<li>该 自动线性移动平台 由一个步进电机（HT23-397，Applied Motion Products，Watsonville，CA）和一个线性移动平台（MIPS-2-10-1.0mm，Servo Systems，Monteville，NJ）组成，安装于聚甲醛对准平台之上。生物反应器腔室置于平台内，与线性移动平台平行。从生物反应器腔室延伸出的牵引杆通过适配器固定在线性移动平台上。</li>
	<li>的 步进电机驱动控制器 （Si 2035，Applied Motion Products）通过配套的 Si 程序员软件进行编程，以控制牵引基底的操作。轴突拉伸通过一系列微小位移步进的方式逐步施加。 间隔的 通过停留时间（Pfister，Iwata 等 2004；Pfister，Iwata 等 2006）。该计算机控制系统能够编程设定ASG的自定义程序，对于持续数天至数周的连续实验至关重要。</li>
</ol>
2. 生物反应器腔室的制备
<ol>
	<li>制备用于神经元培养的一次性牵引和固定培养基质：
	<ol>
		<li>从8.5英寸×11英寸的Aclar膜（33C 2.0 mil，Structure Probe，West Chester，PA）上切割拖曳培养基底。使用锋利刀片将基底切割成约0.5 cm × 2.5 cm大小，或略短于泳道宽度，以确保两侧至少留有1–2 mm的间隙。</li>
		<li>轻轻打磨底部三分之一部分rd 使用精细的1200目砂纸（McMaster Carr）打磨两侧牵引培养基底。打磨牵引基底有助于轴突从牵引基底生长至盖玻片上的静止基底。</li>
		<li>剪取一块 5 × 7 cm 的 Aclar 片或使用 1 号玻璃盖玻片作为固定基底（#4865-1，Brain Research Labs，Newton，MA）。</li>
		<li>用稀释的 Alconox 溶液清洁培养基底，并用纯化的 dH₂O 充分冲洗2O.</li>
		<li>将培养基质浸入70%乙醇中30分钟以灭菌。在无菌细胞培养操作台内让基质自然晾干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用稀释的Alconox清洗生物反应器腔室，并将其置于高压灭菌容器中进行高压蒸汽灭菌。灭菌后立即转移至无菌操作台，静置晾干。</li>
	<li>在超净工作台内继续操作，使用硅胶RTV（Dow Corning #732，McMaster Carr）和无菌棉签（McMaster Carr）将培养基质粘附至生物反应器上：
	<ol>
		<li>将牵引块的支腿置于完全竖直位置，将牵引培养基质粘附于牵引块支腿的未打磨区域，避免接触已打磨的培养表面。</li>
		<li>将固定培养基质粘附至生物反应器腔室的底部。</li>
		<li>用干燥的棉签轻轻按压粘合的基材，以去除多余的胶水和气泡。</li>
		<li>由于硅酮RTV会渗出对神经元有毒的乙酸，因此在引入神经元培养物之前，需将生物反应器置于超净台内紫外光下干燥整整两天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将拖曳块的支腿下放，使砂磨过的拖曳基底尖端与固定基底之间产生2-3 mm的重叠。必须特别注意重叠区域的大小；若重叠过大，拖曳基底的尖端可能会偏离固定基底，从而减少跨越重叠区域的轴突数量（图3）。</li>
	<li>将牵引块置于起始位置，使牵引杆缩回生物反应器内部。拧紧固定螺钉，以防止拉伸生长前牵引杆发生移动。</li>
</ol>
3. 神经元培养
<ol>
	<li>在每个通道的基质界面区域加入1 mL浓度为10 μg/mL的高分子量聚-D-赖氨酸（货号：354210，BD，Bedford，MA），使用无血清培养基稀释。室温下静置孵育1小时，使溶液充分黏附。随后用dH2O轻柔冲洗3次，最后用培养基冲洗一次。移液操作应在通道后部进行，远离基质界面区域。</li>
	<li>从E16大鼠幼崽中分离背根神经节外植体（DRGs）。在体视显微镜下，使用培养皿将外植体稀释成液滴。用100 μL移液器收集3–4个外植体，并将其接种至磨砂牵引培养基质的边缘。接种时需注意，使用少量培养基形成小液滴，将外植体置于牵引基质的边缘。每通道最多加入1 mL培养基即可在数小时内防止蒸发，同时限制外植体移动。培养基配方：Neurobasal培养基添加B-27补充剂、0.5 mM L-谷氨酰胺（Invitrogen，Carlsbad，CA）、1% 热灭活胎牛血清（FBS-HI，Hyclone，Waltham，MA）、2.5 g/L D-葡萄糖（G-7528，Sigma，St. Louis，MO）、20 ng/mL 神经生长因子（NGF，13290-010，Invitrogen）以及20 μM 氟脱氧尿苷（FdU）和20 μM 尿苷有丝分裂抑制剂（F-0503，U-3003，Sigma）。</li>
	<li>盖上盖子，将生物反应器转移至培养箱中孵育1小时，或直至细胞充分贴附。</li>
	<li>从距离外植体最远的位置向生物反应器中加入培养基，以避免扰动外植体。将生物反应器在培养箱中孵育至少5天，使神经元的轴突延伸至静止基质上。</li>
</ol>
4. 轴突拉伸生长
<ol>
	<li>生物反应器在无菌操作台内进行最终的准备工作：
	<ol>
		<li>用磷酸盐缓冲液填充生物反应器的储液腔，以湿润培养室并减少培养基的蒸发。在本系统中，中空的外壳壁用作储液腔。或者，也可将小型培养皿盖置于培养通道上方的牵引块两侧。</li>
		<li>更换培养基，并将通道注满至最大容量。移液操作应在通道的后部进行，远离基底界面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将生物反应器安装在自动线性运动平台上。若实验需在培养箱内进行，则培养箱不得加湿，以免导致自动线性运动平台发生腐蚀。</li>
	<li>将拖车杆适配器固定到拖车杆上。</li>
	<li>使用 Si Programmer 软件点动线性运动平台的载物台，使其与牵引杆适配器对齐，并将其固定在载物台上。为方便操作，可预先在 Si Programmer 中设置序列，以便按特定步长控制载物台移动。</li>
	<li>松开生物反应器腔室上的固定螺钉，以允许拖曳块自由移动。</li>
	<li>通过一系列小的位移步进，以逐步的方式施加拉伸 间隔的 通过停留时间（Pfister，Iwata 等 2006）。我们的范式首先从采取 2 μm 每172秒一步，24小时内产生1毫米的净拉伸。一天后，可通过增加位移或缩短停留时间（表2）来提高拉伸速率。</li>
	<li>一旦启动ASG，通常无需更换培养基。然而，随着时间推移，培养基往往会变酸，表现为颜色呈现黄色。若需进行后续实验，切勿完全移除旧培养基，而应仅部分更换，以尽量减少对漂浮轴突的损伤。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
轴突结构可经历极为快速且强劲的拉伸生长。该过程最初表现为缓慢拉伸阶段（≤ 1 mm/天），其特征是小幅度、不频繁的位移。在开始拉伸的24小时内，神经元生长通路发生机械转导，神经元开始向轴突圆柱体添加物质。持续进行轴突拉伸生长（ASG）24小时后，轴突对更大程度和更频繁的位移表现出逐渐增强的耐受性。通常情况下，轴突能够耐受每12–24小时增加1 mm/天的拉伸速率（Pfister, Iwata et al. 2004；Pfister, Bonislawski et al. 2006；Pfister, Iwata et al. 2006）。然而，过早提高拉伸速率虽可能促使部分轴突生长加快，但也会导致病理性闭塞，进而引起轴突断连。
牵张生长的轴突倾向于形成束状结构，类似于神经束的架构。根据现有方案，轴突束中央经牵张生长的部分与培养基质无黏附，仅最初黏附的近端和远端部分仍附着于培养基质上。因此，牵张生长轴突的中央部分处于自由漂浮状态，易因操作而受到扰动。
由于多种原因，某些轴突无法跟上施加的拉伸速率。例如，一个具有两个轴突过程的背根神经节（DRG）神经元，若两个轴突均处于拉伸状态，则可能无法合成足够的蛋白质以匹配施加的拉伸速率。无法适应施加拉伸的轴突将因泊松效应而变细。进一步的拉伸会导致轴突闭塞，抑制其组装，进而引发病理性断连。然而，大多数轴突能够成功进行轴突静态生长（ASG），仅有少量轴突经历这种类似修剪的过程。
<img alt="用于培养室控制的自动移动平台上的生物反应器装置；显示软件界面。" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 轴突拉伸生长生物反应器系统。(A) 生物反应器培养室与自动线性移动平台，(B) 步进电机驱动控制器及 Si 编程软件。
<img alt="显示用于细胞分析的培养通道和牵引杆的微流控装置示意图。" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 生物反应器培养室。该示意图从顶部展示去除盖子后的生物反应器腔室。牵引块的位置反映了轴突拉伸生长的终末阶段。在培养通道内可见成束的拉伸生长轴突。
<img alt="拖拽牵引中的静态平衡；示意图显示正确的与过度的牵引重叠。" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 培养基底板接口示意图。该示意图从侧面展示了生物反应器每个通道内牵引机构的组成部分。（上）牵引基底与固定培养基底的正确重叠方式。（下）牵引基底与固定基底过度重叠会导致牵引基底尖端卷曲。
视频 1. 将培养基质连接到生物反应器腔室。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">点击此处观看视频</a>
视频 2. 将背根神经节外植体接种到牵引基质上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">点击此处观看视频</a>
视频 3. SiProgrammer 使用方法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">点击此处观看视频</a>
视频 4. 生长锥在静止基质上的延伸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">点击此处观看视频</a>
视频 5. 轴突拉伸生长。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">点击此处观看视频</a>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>天数</td>
			<td>步骤</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>灭菌与干燥</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>粘接与组装</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>涂层处理与神经元培养接种</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>开始拉伸生长</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 实验时间安排。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>时间 [hr]</td>
			<td>拉伸速率 [mm/day]</td>
			<td>停留时间 [s]</td>
			<td>总长度 [mm]</td>
			<td>总拉伸时间 [days]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>预张紧</td>
			<td>24</td>
			<td>1</td>
			<td>172.8</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>拉伸</td>
			<td>24</td>
			<td>1</td>
			<td>172.8</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>拉伸</td>
			<td>24</td>
			<td>2</td>
			<td>86.4</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>拉伸</td>
			<td>24</td>
			<td>3</td>
			<td>57.6</td>
			<td>6</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>拉伸</td>
			<td>24</td>
			<td>4</td>
			<td>43.2</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>拉伸</td>
			<td>24</td>
			<td>5</td>
			<td>34.6</td>
			<td>15</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 拉伸速率程序。所有拉伸步骤的位移均为 2 μm（10 步电机步数 = 2 μm 拉伸）。

<ol><li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li>
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</ol>

的 离体 神经元细胞的机械拉伸技术已获得美国专利 #6264944 和 #7429267 保护。

在制备生物反应器时，应注意两个关键步骤。首先，基质界面处需要有适当的重叠，以确保轴突能够跨越到静止基质上。不应使用过度卷曲或存在其他缺陷的Aclar膜（图3）。为优化重叠区域，需确认牵引基质被均匀打磨，并在整个2-3 mm长的接触区域内与静止基质均匀接触。每次实验前，应通过仔细调节牵引支腿的高度来优化重叠区域。
其次，在为神经元附着提供支持的同时，基质涂层还需承受由生物反应器位移以及轴突收缩张力引起的显著剪切力（Heidemann 和 Buxbaum 1990；Pfister, Iwata et al. 2004；Loverde, Ozoka et al. 2011）。在多聚赖氨酸包被前后，均应使用无菌水将基质充分冲洗。包被液应使用 freshly thawed 的分装样品，并尽可能均匀涂布。重要的是，在细胞黏附期间，不得移动或以其他方式扰动基质。在后续操作步骤中，接种时应避免接触基质，所有溶液均应从培养通道远离基质界面的一端加样。
每个生物反应器组件连接处的公差可能表现为松动。在主动应变生成（ASG）初期，系统中的松动表现为自动线性运动平台发生位移时，牵引块尚未随之移动。松动程度因实验而异，但根据我们的经验，通常小于&lt;1 mm。因此，在启动ASG程序之前，会先进行为期一天、速率为1 mm/天的“预张紧”去松动阶段，使生物反应器各部件充分接触并开始带动牵引基质运动。
如果自动线性运动平台的位移步骤在预张力阶段完成后与拖曳块的位移不一致，则可能需要进行故障排除。拖曳块位移不同步或不准确通常与拖曳装置内部的“粘滑”现象（stiction）或静摩擦以及适配器的弯曲变形有关。为防止这些问题发生，在组装完成后应手动检查拖曳块的运动是否平滑且几乎无需施力。若发现卡滞现象，应在实验前解除拖曳组件的束缚。此外，适配器必须具备足够的刚性，以确保精确且同步的位移不会被拖曳装置的静摩擦所影响。

<table><tbody><tr><td>聚醚醚酮（PEEK）</td><td>McMaster-Carr</td><td>8504K69</td><td>定制生物反应器腔室</td></tr><tr><td>聚碳酸酯</td><td>McMaster-Carr</td><td>8574K28</td><td>定制生物反应器盖</td></tr><tr><td>步进电机</td><td>Applied Motion Products, Watsonville, CA</td><td>HT23-397</td><td></td></tr><tr><td>线性运动平台</td><td>Servo Systems, Montville, NJ</td><td>MIPS-2-10-1.0mm</td><td></td></tr><tr><td>步进电机驱动控制器</td><td>Applied Motion Products, Watsonville, CA</td><td>Si2035</td><td></td></tr><tr><td>Aclar</td><td>Structure Probe Inc., West Chester, PA</td><td>1859</td><td>牵引培养基底</td></tr><tr><td>1号盖玻片</td><td>Brain Research Labs, Newton, MA</td><td>4865-1</td><td>固定培养基底</td></tr><tr><td>硅橡胶（RTV）</td><td>McMaster-Carr</td><td>7587A37</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>McMaster-Carr</td><td>7074T62</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>BD Biosciences</td><td>354210</td><td></td></tr></tbody></table>

轴突拉伸生长：神经元生长的力传导机制

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

在胚胎期突触前发育过程中，神经元通过生长锥短距离延伸其神经突以到达靶位。随着生物体的不断生长，骨骼的发育导致神经元胞体与轴突末端之间的距离逐渐增加（Weiss 1941；Gray, Hukkanen et al. 1992）。这种机械转导作用诱导了一种次级神经元生长模式，能够适应轴突的持续伸长（Bray 1984；Heidemann 和 Buxbaum 1994；Heidemann, Lamoureux et al. 1995；Pfister, Iwata et al. 2004）。
轴突拉伸生长（Axon Stretch Growth, ASG）可能是胚胎期短突起发育为成体神经系统典型长神经和白质纤维束过程中的关键因素。为研究ASG 体外，我们设计了生物反应器，以对神经元培养物的短轴突施加张力（Loverde, Ozoka 等 2011）。本文详细描述了我们用于制备生物反应器并开展轴突拉伸生长（ASG）的实验方法。首先，在生物反应器的每个拉伸通道内，将神经元接种于经微操控的可移动牵引基质上；随后，神经元通过生长锥的延伸，使其轴突再生至固定的静止基质上；最后，通过将接种有细胞体的可移动基质向远离已黏附于静止基质的轴突末端方向牵引，实现轴突的拉伸生长，从而模拟生长锥延伸后的骨骼式生长过程。
先前的研究表明，胚胎大鼠背根神经节神经元的轴突连续生长（ASG）能够达到前所未有的生长速率，最高可达10 mm/天，长度可达10 cm，同时伴随轴突直径的增加（Smith, Wolf 等. 2001；Pfister, Iwata 等. 2004；Pfister, Bonislawski 等. 2006；Pfister, Iwata 等. 2006；Smith 2009）。这与缺乏机械刺激条件下的再生性生长锥延伸形成鲜明对比：在后者中，生长速率平均仅为1 mm/天，且成功再生的长度通常局限在3 cm以内（Fu 和 Gordon 1997；Pfister, Gordon 等. 2011）。因此，进一步研究ASG可能有助于揭示在缺乏机械刺激时限制再生的失调性生长机制。

开发了一种独特的组织工程技术，通过模拟轴突牵张生长，在培养中实现大量神经纤维的延长；轴突牵张生长是一种神经系统生长形式，神经随之身体的增大而同步伸长。

在胚胎期突触前发育过程中，神经元的轴突通过生长锥短距离延伸，以到达其靶标。随着时间推移，神经元胞体……

以下实验的总体目标是对神经元的轴突施加张力，以刺激并维持其生长。该目标通过在计算机控制的反应器中，将神经元接种于可进行显微操作的牵引基底上来实现。接种后，神经元培养时间最长可达一周，在此期间，轴突通过生长锥的延伸生长至固定基底上。接下来，轴突拉伸生长通过将接种的细胞体从粘附于静止基质上的轴突末端处拖离来实现。轴突拉伸生长这一组织工程技术可实现高达每天10毫米的持续生长速率，显微分析显示可形成较长的、增粗的轴突束状结构。与电流促进生长等其他方法相比，该技术的主要优势在于，可在较短时间内使轴突通路生长至任意所需长度。轴突拉伸生长的意义在于使我们能够重现刺激神经生长的生物力学信号。通过研究这些信号，可以利用它们开发治疗病变或受损神经的新策略。因此，轴突拉伸生长方法有助于回答关于神经系统发育与维持的关键基础科学问题。重要的是，我们可以探索轴突以超出我们以往认知的速度生长的机制。轴突拉伸生长生物反应器系统包含三个主要组成部分。首先，是用于培养并拉伸神经元的生物反应器腔室。其次，是一个可施加拉伸力的自动线性移动平台；最后，是一个带有控制软件的步进电机驱动控制器，用于控制拉伸生长。本方案采用一种微型化系统进行演示，该系统可在显微镜下运行。使用立式铣床加工生物反应器原型，以确保其生物相容性并便于灭菌培养。腔室部件由聚醚醚酮材料加工而成，采用三枚耐腐蚀的16不锈钢紧固件完成组装。生物反应器培养腔包含拉伸框架、可调节的牵引块、用于外部操作的牵引杆，以及一次性使用的牵引式和固定式培养基底。自动线性移动平台由一个线性移动平台和安装在聚甲醛（Delrin）平台上的步进电机组成。使用名为 Psi Programmer 的软件程序对与步进电机连接的驱动控制器进行编程和监控。通过将 LAR 薄膜切成约 0.5 × 2.5 厘米的细条，制备牵引培养基底。使用细粒度1,200目的砂纸轻轻打磨牵引培养基底的下半部分两侧，以促进轴突从牵引基底向静止基底生长。使用分隔标签有助于更均匀地打磨。裁剪一块5厘米×7厘米的LAR材料，或使用一片1号玻璃盖玻片作为静止基底。使用稀释的Alcan溶液清洁培养基质和生物反应器腔室，并用去离子水彻底冲洗。将培养基质浸入70%乙醇中30分钟以进行消毒。将生物反应器腔室置于可高压灭菌容器中，通过高压灭菌法进行灭菌。灭菌后，将培养基质和生物反应器室转移至组织培养罩内，使其自然风干。可使用一盒移液器吸头用于培养基质的干燥。使用无菌棉签插入并固定培养基质。将牵引培养基质粘附到牵引块的支腿上。使用一层薄薄的硅酮RTV胶，将基质粘在未打磨的区域，避免与已打磨的培养表面接触。接下来，将固定培养基质粘附到生物反应器腔室的底部。用干燥的棉签轻轻按压固定基底的底部，以去除多余的胶水和气泡。将小室置于组织培养罩内干燥整整两天。两天后，调节拖曳块的支腿，使标准拖曳基底的尖端与固定基底之间产生两到三毫米的重叠。必须密切关注重叠区域的大小。如果重叠过大，牵引基质的尖端会偏离静止基质，从而减少跨越重叠区域的轴突数量。将牵引块置于起始位置，并使牵引杆缩回至生物反应器内部。拧紧固定螺钉，以防止牵引杆移动。在组织培养罩内进行牵张生长前，将一毫升高分子量多聚赖氨酸溶于无血清培养基中，并加入到每个通道的基质界面。室温下静置一小时后，用去离子水冲洗三次，再用培养基最终冲洗一次，然后将E16大鼠幼崽的背根神经节外植体接种至砂化处理的牵引培养基质上。使用体视显微镜，首先在培养皿中用液滴稀释外植体，然后用100 µL移液器板收集三到四个茄子。将X株植物置于培养基小液滴中，位于牵引基质边缘，培养基体积不超过1毫升。该培养基足以在数小时内防止蒸发，同时限制茄子的移动。 扣紧生物反应器的盖子，转移至培养箱中孵育一小时，使茄子组织贴附。一小时后，在距离茄子组织最远的位置加入培养基，以避免将其冲离。将生物反应器继续孵育五天，使背根神经节（DRG）神经元在静止基质上延伸出轴突。在组织培养超净台内，向生物反应器的储液槽中加入磷酸盐缓冲液，以湿润培养室并减少培养基的异常变化。进行最后一次换液，将生物反应器的通道完全充满培养基。将生物反应器置于非湿润培养箱内的自动线性移动平台上。将拖曳杆适配器固定到拖曳杆上。使用 Cy 程序软件，点动线性运动平台上的载物台，使其与拖曳杆适配器对齐，然后将适配器固定到载物台上以方便操作。预先准备程序化序列，以便以特定增量控制载物台的移动。在启动 Axon Stretch 生长程序之前，松开生物反应室上的固定螺钉。通过一系列由静止期分隔的小位移步进方式，逐步施加拉伸。该实验范式在预张力后的最初24小时内，每隔172秒进行两次微米级位移，累计实现一毫米的净拉伸。一天后，可通过增大位移步长或缩短静置时间来加快拉伸速率。此处展示了轴突拉伸生长过程的代表性结果。植入物中的初始细胞迁移到牵引基质上。在接下来的五天内，生长锥将轴突延伸至静止基质上。当生长锥在静止基质上延伸至少一毫米后，开始进行轴突拉伸生长。将牵引基质从AED生长锥逐步移开时，跨越的轴突弹性立即显现出来，表现为轴突被拉伸。通常情况下，轴突最初会变细，但在数小时内即进入生长阶段，恢复并维持其直径。在持续拉伸生长24小时后，轴突对拉伸的耐受性增强，能够承受拉伸速率的增加。随着轴突不断生长变长且FAS循环进行，它们对拉伸的耐受性逐渐增强。此处可见在人为故意触碰生物反应器时，拉伸生长的轴突出现漂浮现象。偶尔由于黏附不足，轴突可能会从固定基质上脱离。这是最常见的失败情况，通常在初始步长过大或固定基质涂层不充分时发生。当步长过大时，在拉伸生长启动过程中，部分轴突会从固定基质上脱离。在执行该操作时，务必仔细花时间制备基质界面。脚趾和基质应与静止基质重叠两到三毫米，并且在牵张生长过程中，背根神经节（DRG）应尽可能靠近界面处进行接种。您将拥有一个独特的机会，通过活体荧光探针或在细胞拉伸过程中裂解细胞以研究基因表达，来观察轴突生长。观看本视频后，您应能充分理解如何利用施加的张力来驱动轴突生长。利用这一技术，我们发现轴突的生长速度比我们原先认为的可能速度更快，并且能够建立其他任何方法都无法实现的连接。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

轴突伸展生长：神经生长Mechanotransduction

使用经过校准的玻璃针，可高精度地对神经元施加并直接测量2-1000微达因范围内的作用力。该方法可用于控制和测量轴突发育的多个方面，包括轴突起始、轴突张力、轴突延伸速度以及力的矢量方向。...

机械操控神经元以调控轴突发育

可将活的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌固定在明胶包被的云母表面，并在液体环境中利用原子力显微镜（AFM）进行成像。...

用于原子力显微镜成像的细菌固定方法

本文介绍了一种新型拉伸平台，可用于研究单个细胞对复杂各向异性双轴机械变形的响应，并量化生物组织的力学特性。...

一种用于细胞与组织力学生物学研究的新型拉伸平台

本研究开发了一种新型成像方案，采用定制的电机驱动机械执行器，可实现对活细胞在机械应变下的实时响应进行测量。该系统适用于力学生物学研究，能够施加高达20%的应变，同时支持使用共聚焦显微镜或原子力显微镜进行近实时成像。...

活细胞成像在机械拉伸过程中的应用

本方案描述了从大鼠分离背根神经节（DRG）神经元，并在静态预拉伸细胞培养系统上培养DRG神经元以增强轴突排列，随后与施万细胞（SCs）共培养以促进髓鞘形成的实验方法。...

一种增强背根神经节神经元轴突排列与髓鞘形成的方法

本实验方案描述了如何利用固定在微移液管上、经多聚-D-赖氨酸包被的微珠，引导神经突生长，从而在微流控腔室中快速启动、延伸并连接神经突。...

重连神经元回路：一种实现快速神经突延伸与功能性神经元连接的新方法

利用先前设计的装置对贴壁细胞施加机械应变，本文描述了一种重新设计的基质几何结构以及一种定制设备，可用于使用100倍油浸物镜对受应变细胞进行高分辨率单细胞成像。...

在单轴拉伸应变下单个活细胞核动力学的高分辨率成像

本方案展示了一种简单且可靠的用于研究的方法 原位 轴突生长与生长锥动态。该方法描述了如何制备 离体...

在体 可视化急性离体胚胎脑切片培养中轴突生长与生长锥动态

为了前进，生长锥必须对外部环境施加牵引力。牵引力的产生依赖于肌动蛋白动态和离合器耦合。本研究描述了分析生长锥前进过程中肌动蛋白动态、离合器耦合以及牵引力的方法。...

生长锥前进过程中的肌动蛋白动力学、黏着耦合与牵引力分析

本文介绍了一种多功能等双轴拉伸装置，该装置由气动驱动，且兼容高分辨率显微镜成像。...

用于高倍率活细胞共聚焦荧光显微镜观察的双轴拉伸装置

本文介绍了一种新型装置，该装置能够在支持细胞于刚度可调且蛋白基质可定制的基底上培养的同时，向细胞施加各向同性和单轴应变波形。这一结构简单且经济的实验平台使研究人员能够在基础研究和与疾病相关的环境中探究机械信号如何调控细胞功能。...

一种新型平台 体外 细胞拉伸与成像

了解轴突伸展生长技术，通过生物反应器系统对神经元施加拉伸力，实现每日高达10毫米的持续生长速率。该方法有助于研究神经发育机制，为神经损伤治疗提供新策略。

轴突拉伸生长：神经元生长的力传导机制

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