Name: 无菌实验室技术:量与血清学移液器和Micropipettors的转移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 学习无菌实验室技术，掌握血清学移液器和微量移液器的正确使用方法，在实验室工作台的无菌区域内进行精确体积转移，避免污染并确保实验成功。

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特别感谢Iroc Designs的Cori Sanders协助准备插图，以及加州大学洛杉矶分校（UCLA）的Kris Reddi协助建立用于配图的样本培养物。本项目经费由霍华德·休斯医学研究所（HHMI）提供（HHMI资助号52006944）。

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我无任何披露事项。

无菌技术是指为防止实验室中无菌溶液和培养物被不需要的微生物污染而采取的一系列常规操作步骤。这类技术对于需要进行细胞培养的实验至关重要。尽管无法实现实验环境的完全无菌，但通过消毒实验台面、使用本生灯创建无菌区域、尽量减少未加盖的培养物和培养基暴露于空气中的时间、对瓶子、试管和玻璃移液管等材料进行灭菌，以及避免无菌器械与非无菌表面接触等操作，可显著降低实验中溶液和培养物被污染的可能性。这些预防性操作的目标是使其成为操作者的习惯性行为，而这需要在实验室工作中通过训练和实践逐步养成。
使用血清学移液管和微量移液器等仪器，对无菌溶液和培养物进行体积转移，是实验室中常见的常规技术之一。不同的实验应用需要使用能够精确、准确地转移特定体积的仪器。血清学移液管常用于微生物学实验室中，以制备需要毫升体积培养基的细胞培养物；而微量移液器则在分子生物学实验中至关重要，因其仅需微升级别的溶液。当使用这些仪器操作时遵循无菌技术，便可最大限度地减少液体转移过程中的污染，无论液体体积大小或实验类型如何。
尽管本方案中未作讨论，但另一种常用的防止污染的方法是在层流罩内进行操作（图10）。该设备对于组织培养以及生物安全等级为BLS-2或更高级别的微生物实验至关重要。层流罩配备有高效微粒空气（HEPA）过滤器，可去除进入罩内的气流中的空气传播污染物，同时防止实验室内的未过滤空气进入工作区域。需要注意的是，不得在层流罩内使用本生灯，因为火焰产生的热量会破坏维持罩体正常功能所必需的气流。
在进行实验时，检查无菌操作技术的质量通常很有帮助。为了确认溶液和培养基在实验操作过程中未被污染，务必准备一个阴性对照。例如，在准备用于细菌培养的液体培养基试管时，留出其中一管不接种，仅含有无菌培养基。将该未接种的培养基与已接种的试管一同培养，随后检查该对照管是否有污染迹象，例如因非目标细胞意外进入试管并生长而导致的浑浊现象。如果对照管出现污染，则实验组试管很可能也已被污染，实验需要重新进行。每次实验都应采取此类预防措施。

<table><tbody><tr><td>LB 培养基</td><td>Difco Laboratories</td><td>244620</td><td>配方亦见参考文献6</td></tr><tr><td colspan="4">TE 缓冲液：</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3253</td><td></td></tr><tr><td>CiDecon</td><td>Decon Laboratories</td><td>8504</td><td>消毒剂</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406</td><td>用作消毒剂时，用蒸馏水配制成70%(v/v)</td></tr></tbody></table>

无菌实验技术：使用血清移液管和微量移液器进行体积转移

Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors

微生物无处不在——存在于空气、土壤、人体以及实验室台面和计算机键盘等无生命物体表面。微生物的普遍存在为实验室带来了大量潜在的污染物。为了确保实验成功，必须尽量减少设备和工作表面上的污染物数量。微生物学的许多实验中普遍涉及对含有细菌细胞或病毒颗粒的培养物进行测量和转移的操作。为避免接触非无菌表面或污染无菌培养基，需要做到以下几点：（1）准备一个无菌的工作空间；（2）精确设定并准确读取仪器，以实现液体的无菌转移；（3）在无菌区域内正确操作仪器、培养瓶、瓶子和试管。掌握这些操作需要培训和练习。起初，动作应缓慢、有意识且受控，目标是使无菌操作在实验台工作中变得自然熟练。本文将介绍在本生灯火焰所形成的无菌区域内，使用血清移液管和微量移液器测量液体体积的步骤。根据所用仪器的不同，体积范围从微升（μl）到毫升（ml）不等。常见的转移液体包括无菌肉汤或化学溶液，以及细菌培养物和噬菌体储备液。通过遵循这些操作步骤，学生应能够：•在本生灯火焰所形成的无菌区域内进行操作；•使用血清移液管时不破坏仪器的无菌状态；•使用血清移液管吸取液体时，通过将液体形成的弯月面与移液管上的刻度线对齐，精确读取标定体积；•在液体转移过程中保持培养瓶、培养瓶、试管及其相应瓶盖的无菌状态；•识别塑料与玻璃血清移液管的不同应用场景；•说明微量移液器的准确度限制；•精确且准确地设定微量移液器的体积；•掌握如何正确使用微量移液器的第一档和第二档来吸取和转移准确体积的液体。

在实验室工作时，必须尽量减少污染源。无菌技术是指在转移培养物和试剂时，避免其接触非无菌表面的操作方法。血清移液管和微量移液器可用于精确量取液体体积，同时确保实验中所用溶液的无菌性不受影响。

微生物无处不在——存在于空气、土壤、人体中，以及实验室台面和计算机键盘等无生命物体表面。

本演示介绍了在实验台使用刻度移液管和微量移液器进行液体转移的无菌实验技术。操作应在本生灯火焰所创建的无菌区域内进行。根据具体应用选择合适的液体转移仪器。然后在不破坏其无菌性的前提下正确使用这些工具，同时保持培养试剂和材料的无菌性，并精确吸取液体。这些操作对于最大限度减少污染来源以及确保基础实验的精确性至关重要。最初，精确设定和准确读取仪器刻度，以及协调仪器与实验材料的操作动作，同时又不破坏所转移液体的无菌状态，具有较大挑战性。在实验室中操作活体样本时，实践无菌技术对实验成功至关重要，因此应投入时间学习这些操作规程，使其成为习惯。在实验台操作时，我的实验室主管Chris Reddy博士将演示相关规程：开始任何实验操作前，务必使用抗菌皂和温水彻底清洗双手。首先用流动的温水润湿双手。然后涂抹肥皂并用力充分揉搓，使肥皂均匀分布。双手相互摩擦，确保所有部位均得到清洁，包括拇指、手指背面、手背以及指甲下方。随后彻底冲洗以去除残留的肥皂，并使用从分配器中取出的纸巾擦干双手。最后，用一张干净的纸巾关闭水龙头，清理实验台上的工作区域。然后从容器中取出一张预先浸湿的消毒湿巾，擦拭整个区域。使用点火器使消毒剂蒸发。本生灯。调节火焰，使中间出现蓝色锥形焰心。将实验所需的所有物品放置在实验台无菌区域附近。同时，确保所有材料均已正确标记。血清移液管有多种类型可供选择，包括塑料或玻璃材质、一次性或可重复使用、带滤芯或不带滤芯。不同规格的移液管均经过校准，带滤芯的移液管可通过滤芯作为屏障，防止移液管过度填充。需要注意的是，血清移液管也有两种校准方式。顶部带有双环标记的“排出式”（TD）移液管，其校准方式为不包含尖端液体体积，即尖端残留液体不应排出。此处未展示该类型；而“容纳式”（TC）移液管必须吹出全部液体，因其校准标准为需将全部体积完全排出。使用无菌技术操作 individually wrapped sterile plastic serological pipette 时，应从带塞的一端开始，小心地逐步剥离纸包装。不要完全取下整个套管，而应仅保护移液管吸头的尖端，仅露出移液管上刻度线以上的顶部部分，并在血清学移液管的顶端安装一个移液辅助器，例如橡胶球或移液枪。一手握住移液辅助器，另一手取下塑料移液管上的纸套管。对于存放在金属筒中的玻璃刻度吸管，先松开筒盖，取下盖子，并对盖子和筒的开口端进行火焰灭菌。然后将盖子侧放在已消毒的实验台上。将金属筒水平持握并轻轻摇动，使一至两支吸管的管口端露出。伸出约一英寸。将容器侧放，取出一支移液管，注意不要触碰其他移液管。保持移液管底部管尖不与手部及非无菌表面接触。继续安装移液器辅助装置。然后将玻璃移液管的底部三分之一部分穿过本生灯火焰中的蓝色锥形区域，持续一到三秒钟。现在取下装有无菌培养基的瓶子的瓶盖。用一只手的无名指和手掌夹住瓶子，同时用同一只手的拇指、食指和中指操作移液器辅助装置，另一只手将瓶子倾斜至45度角，并使瓶口通过本生灯火焰。将无菌移液管尖端插入培养基中，然后使用移液器辅助装置吸取液体，通过观察刻度线来控制流速。观察吸入移液管的液体体积以精确读取数值。将移液管保持垂直，并在 eye level 高度正视液体的弯月面。再次将瓶口通过本生灯火焰。然后盖上盖子，将培养基瓶放置一旁。接着取一支无菌试管，严格无菌操作。按照前述方法取下瓶盖。通过灼烧试管口来创建无菌区域。将移液管中的培养基缓慢加入试管中，控制液体流速，避免溅出。灼烧管口边缘。再次盖上盖子，将试管放置一旁。现在取下移液器辅助装置，将塑料移液管丢弃至指定的锐器容器中，将玻璃移液管浸入10%次氯酸钠溶液中。微量移液器可精确测量和分配微小体积的液体，不同规格的仪器适用于特定的体积范围。使用预先灭菌的试管和塑料吸头。同时使用预先浸湿的消毒擦拭巾清洁微量移液器。注意。Volter 显示三个数字，需根据微量移液器的类型进行解读，其精度反映在最小刻度上。例如，P 20 用于 2.0 至 20.0 微升之间的体积。黑色的顶部数字表示十微升级别。第二个黑色数字表示以微升为单位的体积。红色数字表示十分之一微升，因此每个刻度增量相当于0.02微升。首先，旋转调节旋钮，根据数字刻度指示设置分配器的体积。调节微量移液器体积时，若需减小体积设置，应缓慢旋转拇指转轮至目标刻度；若需增大体积设置，应先将转轮向上旋转超过目标刻度约三分之一圈，再缓慢向下旋转拇指转轮，直至准确达到所需体积。始终使用无菌塑料一次性吸头。将吸头紧密安装在微量移液器筒的末端，向下按压并轻微旋转，以确保形成气密性密封。以垂直位置持握微量移液器。注意微量移液器具有三个位置：静止位、第一档和第二档。将移液器推杆上的按钮从静止位置按压至第一停点，以排出与设定体积相等的空气。然后，在保持按钮按至第一停点的同时，将吸头浸入液体中。缓慢松开按钮，使液体吸入吸头内。当按钮回到静止位置时，留出足够时间使液体吸入吸头。然后将吸头从液体中取出。目视检查吸头内液体吸入程度，确保无气泡产生。将吸头以10至45度的角度紧贴接收液体的试管管壁。然后，缓慢下压推杆上的按钮至第一停点，排出液体。片刻后，将按钮按至第二挡，以排出残留液体。随后，将吸头移出液面，再松开活塞使其回到初始位置。最后，通过按下微量移液器上的弹射按钮，将吸头弃入指定的锐器废弃物容器中。首先关闭本生灯。在收好所有耗材和试剂后，用消毒湿巾擦拭实验器具外表面，然后将其移至储存位置。接着将受污染的玻璃器皿和危险废弃物放入相应的处理容器中。用消毒剂再次彻底擦拭整个工作区域，待消毒剂自然蒸发。最后，用抗菌皂和温水彻底清洗双手。若不采用无菌技术，培养物可能受到污染，从而延误实验进程。使用血清学移液管进行液体的无菌转移对于扩增纯细菌培养物（如该25毫升大肠杆菌制备液）至关重要。此外，血清学移液管有助于将液体无菌转移至无菌试管中。此示例展示了在向试管进行点对点加样时，大肠杆菌纯培养物与污染培养物的对比。有时需要精确的体积。显然，此情况下的培养基转移是不精确的。本示例显示了缓冲液转移体积不正确。学生没有吸取12.5微升，而是吸取了125微升。尽管移液器上的数值设置完全相同，但选择的微量移液器型号错误。观看本视频后，您应掌握如何在不破坏无菌状态的前提下，将无菌技术应用于常规实验操作，例如使用血清移液管和微量移液器转移溶液和培养物。目标是使每次实验时都能习惯性地采取预防性操作，例如对玻璃器皿、移液器吸头、培养管和烧瓶进行灼烧灭菌，并在实验台上的无菌区域内进行操作。此外，在实验过程中精确且准确地测量和分配液体体积也至关重要。学习如何正确使用这些液体转移仪器将提高实验结果的可靠性。

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