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本研究由美国能源部（DE-FG02-09ER09-08 和 DE-PS02-09ER09-18）、加州大学洛杉矶分校琼森综合癌症中心以及产业-大学合作研究计划（加州大学发现计划资助，项目编号 bio07-10665）提供资助。我们感谢Nagichettiar Satyamurthy博士及加州大学洛杉矶分校生物医学回旋加速器设施的工作人员提供氟-18放射性同位素以及富有见地的多次讨论。我们感谢来自CEM公司的Michael Collins博士、Greg Leblanc博士、Joseph Lambert博士和Keller Barnhardt博士提供的技术建议与支持。我们感谢Dirk Williams、Darin Williams、Joseph Hong Dun Lin博士和Michael van Dam博士在设计和加工用于改装CEM微波反应器及固相萃取纯化模块的零部件方面所做出的贡献。

1. 初始准备
<ol>
<li>使用一个V型小瓶（5 mL RV1，内含搅拌子）作为微波合成的主要反应容器。将其连接至带有七个进出口的PEEK接头，并置于微波腔内（见图2）。RV2连接固相萃取柱（I），用于收集粗品[18F]SFB。RV3连接固相萃取柱（II），用于收集纯化的[18F]SFB溶液。该容器可置于40°C温水浴中以浓缩相应溶液，尤其适用于后续生物分子的放射性标记。</li>
<li>粗品[18F]SFB收集装置设置： 分别向储液瓶A、B和C中加入MeCN/H2O [6 mL；1:4 (v:v)]溶液、5%乙酸水溶液（8 mL）和MeCN（2 mL）。随后用乙醇（10 mL）活化固相萃取柱（I）（聚苯乙烯，Merck LiChrolut EN），再用5%乙酸水溶液（10 mL）冲洗。</li>
<li>纯化[18F]SFB收集装置设置： 准备储液瓶D和E，分别加入10 mL H2O和3 mL乙醚。第二根固相萃取柱（II）（聚苯乙烯，Merck LiChrolut EN）按上述相同步骤进行活化。</li>
<li>启动高效液相色谱仪（洗脱液：含0.2% TFA的MeCN/H2O，1:1 (v/v)；流速：3 mL/min），对HPLC色谱柱进行预平衡[反相半制备柱（Luna, 5 μm C18(2) 100 Å, 250 x 10 mm），Phenomenex, Torrance, CA, USA]。</li>
</ol>
2. 干燥的[即无载体添加的，(n.c.a)] [18F]氟化物的制备
<ol>
<li>将 [18F]氟化物的 [18O]H2O 溶液（100 μL）加入至含有 Kryptofix 222（20 mg）、1M 水性 K2CO3（26 μL）和乙腈（0.8 mL）的混合物中（置于 Eppendorf 管内）。充分混匀整个溶液后，经由进样管线1转移至反应瓶RV1中。也可将 [18F]氟化物溶液通过阴离子交换小柱（例如 Waters 公司的 QMA-light Sep-Pak）以捕获氟-18，随后用含 K2CO3 与 Kryptofix 的乙腈混合液洗脱。</li>
<li>在微波控制程序下执行干燥程序（20 W，3 分钟），在真空条件下除去RV1中的残留水分。待系统冷却至温度低于50°C后，向反应器中再加入乙腈（1.0 mL），并重复一次该干燥程序。</li>
</ol>
3. 合成4-[18F]氟苯甲酸乙酯
<ol>
<li>通过进样管2，将含有乙基-4-(N,N,N-三甲基铵)苯甲酸三氟甲磺酸酯（1.5 mg）的DMSO溶液（0.4 mL）加入到RV1中。</li>
<li>在微波控制程序下执行标记反应程序（50 W，1分钟），同时进行搅拌，关闭所有阀门并冷却反应容器，以得到乙基-4-[18F]氟苯甲酸酯（[18F]2）。</li>
</ol>
4. 合成4-[18F]氟苯甲酸钾
<ol>
<li>通过进样管3，将含有KOtBu（13 mg）的DMSO溶液（0.5 mL）加入至RV1中。</li>
<li>在微波控制程序下，执行去保护程序（40 W，1 min），同时搅拌，反应容器冷却，所有阀门关闭，得到4-[18F]氟苯甲酸盐（[18F]3）。</li>
</ol>
5. 粗品 [18F]SFB 的合成
<ol>
<li>通过入口管线6，将TSTU（30 mg）加入含有乙腈溶液（2.5 mL）的RV1中。TSTU对湿气和光敏感，应分装至小瓶中，并置于4°C条件下避光密封保存。</li>
<li>在微波控制程序下执行偶联步骤（30 W，2分钟），同时进行搅拌，关闭所有阀门并冷却反应容器，以获得粗品[18F]SFB。</li>
</ol>
6. SPE 纯化的 [18F]SFB 的制备
<ol>
<li>通过进样管线7向RV1中加入5%的水性AcOH溶液（1.0 mL），以中和反应混合物。随后将溶液转移至含有8 mL 5%水性AcOH的样品瓶B中（图2）。</li>
<li>使用氮气（10 psi）将稀释后的反应混合物通过固相萃取小柱（I），以捕获粗品[18F]SFB。</li>
<li>用来自储液瓶A的MeCN与H2O混合液[10 mL, 1:4 (v:v)]洗涤固相萃取小柱（I）。</li>
<li>使用来自储液瓶C的MeCN（2 mL）将[18F]SFB洗脱至RV2中。</li>
</ol>
7. 使用放射性高效液相色谱法纯化粗品 [18F]SFB
<ol>
<li>稀释粗制[18F]SFB 或经 SPE 净化的 [18F]SFB 与 H2O (2 mL) 加入 RV2 中，并将混合液转移至 HPLC 进样环（5 mL）。随后将溶液注入放射性 HPLC [MeCN/H2O，1:1（v/v），含0.2% TFA；流速：3 mL/min。 </li>
<li>收集含有纯化[18F]SFB（保留时间：8-10 分钟）收集至D瓶（预装10 ml H2O）（图2）。关键步骤：若操作正确，此处收集的组分体积应为4-5 ml。</li>
<li>将稀释后的反应混合物通过固相萃取小柱（II），以捕获纯化的[18F]SFB，使用氮气（10 psi）。用氮气吹扫小柱2-3分钟以干燥。</li>
<li>[18F]SFB 从 E 储液槽中用二乙醚（3 mL）洗脱至 RV3 中。</li>
<li>用氮气（10 psi）气流在水浴中将RV3中的溶剂轻轻吹干至完全干燥40° C）。最终干燥的[18F]SFB 可重新溶解于 PBS 缓冲液中，用于后续应用。</li>
</ol>
8. 代表性结果：
我们开发了一种简化的、快速的、一步法合成[18F]SFB的方法，该方法在无水条件下采用去保护策略，并在每次放射化学/化学转化过程中使用微波加热。图1展示了我们放射性合成的详细过程。最终产物的身份通过与非放射性SFB标准品的HPLC保留时间对比得以确认。纯化后的[18F]SFB还通过放射性薄层色谱（radio-TLC）和放射性高效液相色谱（radio-HPLC）分析，以确定其放射化学纯度和化学纯度。在HPLC纯化后60分钟内，[18F]SFB的放射化学产率为35 ± 5%（n &gt; 30），具有高放射化学纯度（&gt;99%）和良好的化学纯度（见图3中HPLC谱图的紫外信号）。比活度约为67–330 GBq/μmol（1.8–9.0 Ci/μmol），具体数值取决于起始放射性活度。
<img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig1.jpg" alt=" [18F]SFB 的合成过程；化学反应图示，包括 [K2.2.2][18F]F 和 HPLC 纯化步骤。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 微波辅助一锅法放射合成 [18F]SFB。首先，在二甲基亚砜（DMSO）中，以 [K⊂2.2.2][18F]F⁻ 配合物存在下，对三氟甲磺酸乙基-4-(N,N,N-三甲基铵)苯甲酸酯（1）进行微波加热（50 W，1 分钟）实现放射性氟化，得到乙基-4-[18F]氟苯甲酸酯（[18F]2）。无需纯化，向反应体系中加入叔丁醇钾（tBuOK）的 DMSO 溶液，并再次进行微波辐照（40 W，1 分钟），完成无水条件下的去保护反应。最后，通过 O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐（TSTU）活化，将 [18F]3 转化为最终产物 [18F]SFB。将乙腈中的 TSTU 加入含有 4-[18F]氟苯甲酸酯（[18F]3）盐的反应混合物中，经加热（30 W，2 分钟）后完成最后一步合成，得到粗品 [18F]SFB。
<img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig2.jpg" alt="放射性标记合成示意图；氟化反应，通过HPLC和SPE纯化；化学装置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 微波辅助一锅法合成[18F]SFB的装置示意图。
<img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig3.jpg" alt="显示化合物分离分析中紫外吸收和放射性保留时间的色谱图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 最终 [18F]SFB 的放射性高效液相色谱图。上方：254 nm 处的紫外信号；下方：放射性信号；插图：254 nm 处的紫外信号（×33.3）。
<img src="/files/ftp_upload/2755/2755table1.jpg" alt="氟化反应方法、放射化学产率、合成时间比较、化学分析表格" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 1"> 
表 1. 使用烷基-4-(三甲基铵)苯甲酸三氟甲磺酸盐作为前体，文献中报道的[18F]SFB放射性合成方法汇总。

该方法已提交美国专利申请。

本研究基于非水相化学，开发了一种简化的三步一锅法放射性合成18F-酰化试剂[18F]SFB的方法。该方法具有优异的可重复性，且由于以下两项关键改进，可稳定地用于自动化放射化学合成模块中[18F]SFB的制备：1. 我们采用无水的KOtBu/DMSO体系进行去保护/皂化反应，取代常规的水相碱性或酸性溶液。这种非水相去保护策略使得试剂可以依次加入，无需中间固相萃取（SPE）纯化或溶剂蒸发/置换步骤。该改进消除了其他合成路线中所需的第二个反应器及SPE模块所关联的大量额外组件和控制单元，从而降低了系统复杂性并提高了可靠性。本方法既可在简单的手动装置中进行，也可在仅具备基本单反应器配置的自动化放射化学模块中实施。此外，步骤间省去SPE纯化显著缩短了总合成时间。2. 采用微波加热也有助于快速、稳定地制备[18F]SFB（参见表1与其他方法的比较）。在该一锅法[18F]SFB合成的各个步骤中——包括F-18干燥、放射性氟化、去保护和活化——均应用了微波加热。如图1所示，在微...

<table><tbody><tr><td>水溶液中的乙酸（5%，v/v）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500&lt;strong&gt; &lt;/strong&gt;</td><td>本实验室配制</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>二乙醚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14775</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>乙基 4-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-三甲基铵)苯甲酸三氟甲磺酸盐</td><td>实验室制备</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂双环[8.8.8]二十六烷（K222）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29,111-0</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-琥珀酰亚胺基)-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;&amp;rsquo;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;&amp;rsquo;-四甲基脲四氟硼酸盐（TSTU）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>105832-38-0</td><td></td></tr><tr><td>水溶液中的碳酸钾（1 M）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209619</td><td>本实验室配制</td></tr><tr><td>叔丁醇钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156671</td><td></td></tr></tbody></table>

微波辅助一锅法合成n-琥珀酰亚胺-4-[18f]氟代苯甲酸酯 ([18f]sfb)

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB)

生物分子，包括肽1-9、蛋白质10,11以及抗体及其工程化片段12-14，正日益成为潜在的治疗剂和分子影像探针。值得注意的是，当这些分子被正电子发射放射性同位素（如 Cu-64、Ga-68 或 F-18）标记后，可作为探针用于多种生理和病理过程的靶向成像15-18。因此，人们已投入大量努力用于合成和探索18F标记的生物分子。尽管已有若干成功的直接18F标记肽类的例子19-22，但直接放射性氟化反应通常需要苛刻的反应条件（如有机溶剂、极端pH值、高温），这些条件通常与脆弱的蛋白质样品不相容。因此，迄今为止，将放射性标记的前体基团引入生物分子仍是首选方法23,24。
N-琥珀酰亚胺基-4-[18F]氟代苯甲酸([18F]SFB)25-37 一种博尔顿-亨特型试剂，可与生物分子的伯氨基发生反应，是用于标记生物分子的非常通用的 prosthetic group（前体基团） 18对多种生物实体进行F标记，就其明显特征而言 体内 稳定性和高放射性标记产率。标记[18F]SFB，所得的[18F]氟代苯甲酰化生物分子可被探索作为潜在的PET示踪剂 体内 成像研究1 大多数18目前文献中报道的[18F]SFB放射性合成方法通常需要两个甚至三个反应器，并且需通过固相萃取（SPE）或高效液相色谱法（HPLC）进行多次纯化。此类冗长的流程阻碍了其在生物分子放射性标记中的常规化生产和广泛应用。尽管已有若干模块辅助的[18F]SFB 的合成已有报道，29-32, 41-42 它们主要基于使用昂贵的市售放射化学反应盒的复杂且耗时的流程（表1). 因此，[18使用低成本装置实现F]SFB将对其适应自动化流程非常有利。
本文报道了一种简化的 [18F]SFB 制备方法，该方法基于一步法微波辅助合成（图1）。我们的方法在各步骤之间无需纯化，也不需要使用任何含水试剂。此外，微波辐照已被用于多种正电子发射断层显像（PET）示踪剂的合成38-41，与相应的热反应相比，微波辐照可获得更高的放射化学产率（RCY）和更好的选择性，或在更短的反应时间内达到相当的产率38。尤为重要的是，在标记生物分子时，所节省的时间可用于后续的生物偶联或 PET 成像步骤28,43。我们改进的 [18F]SFB 合成方法的新颖性体现在两个方面：（1）无水去保护策略使得各步骤之间的中间体无需纯化；（2）微波辅助的放射化学转化实现了 [18F]SFB 的快速、可靠制备。

基于非水相、三步放射性化学过程，开发了一种简便的一步法合成 N-琥珀酰亚胺-4-[18F]氟代苯甲酸酯（[18F]SFB）的方法。采用微波加热，整个过程可在30分钟内完成；若进一步通过制备型HPLC纯化，则耗时60分钟。衰变校正后的放射性化学产率（RCY）为35–50%（n > 30）。

微波辅助一锅法合成N-琥珀酰亚胺-4-[18F]氟代苯甲酸酯 ([18F]SFB)

生物分子，包括肽类1-9、蛋白质10,11以及抗体及其工程化片段12-14，正日益成为潜在的……

本实验将演示一种基于三步放射化学过程并包含无水D保护步骤的新型微波辅助一锅法合成F 18 SFB。该过程首先在微波加热条件下，以干燥的氟离子和DMSO存在时对Ethel四NNN三甲基铵苯甲酸三氟甲磺酸盐进行放射性氟化，得到Ethel四F 18氟代苯甲酸。下一步，加入A-D-M-S-O溶液中的叔丁基氧化钾，随后进行微波辐射，完成无水D保护，生成四钾F 18氟代苯甲酸钾。最终通过TSTU活化将反应产物转化为粗品F 18 SFB。将乙腈中的TSTU加入含有四氟[18F]氟代苯甲酸盐的反应混合物中，加热反应。该步骤的最后一步是通过固相萃取和高效液相色谱对粗品F 18 SFB进行纯化。最终结果表明，通过无水D保护和微波加热，可实现新型、一步法简化且快速的氟-18标记SFB合成。对于初次进行SFB合成的研究人员而言，以往的合成过程较为困难，因为需要复杂的反应装置，并且由于使用EQU溶液，需进行多次纯化和干燥步骤，这曾是我博士后研究期间面临的挑战。在开始本方案之前，我们演示一个操作流程。按照书面方案中的描述，搭建用于微波辅助一锅法 F-18 SFP 合成的装置。装置搭建完成后，启动高效液相色谱仪（HPLC）以对 HPLC 色谱柱进行预平衡。将F 18氟化物溶液用oh 18水稀释，加入crypto fix 2 22 1摩尔水性碳酸钾和乙腈的混合物，然后转移至RV一。在微波控制程序下执行干燥程序，在冷却后去除RV一中的残留水分。当系统温度低于50摄氏度时，向反应器中再加入1毫升乙腈，并重复该程序一次，以合成Ethel四18 F FLUA苯甲酸酯。首先，通过入口管线二将含有乙基四NNN三甲基氯化铵苯甲酸三的A-D-M-S-O溶液加入至RV一中。然后，在微波控制程序下执行标记序列，同时对搅拌容器进行冷却，并保持所有阀门关闭。接着，通过入口管线三向RV一中加入0.5毫升含有四丁基氧化钾的DMSO溶液，以合成F-18氟代苯甲酸钾。在微波控制程序下运行D protect程序，同时对搅拌容器进行冷却，并关闭所有阀门。最后，通过六号进样管线将含有TSTU的乙腈溶液加入反应瓶一（RV one），从而合成粗产物F 18 SFB。在微波控制程序下执行偶联序列，同时对搅拌容器进行冷却，并关闭所有阀门，得到粗产物F 18 SFB。开始制备固相萃取纯化的 F 18 SFB：通过进样管路 7 向反应瓶 RV 1 加入 1 毫升 5% 的乙酸水溶液，以中和反应混合物。随后将溶液转移至含有 8 毫升 5% 乙酸水溶液的小瓶 B 中。使用 10 psi 的氮气将稀释后的反应混合物通过固相萃取小柱，以捕获粗品 F 18 SFB。穿流完成后，使用储液瓶A中的乙腈与水混合液洗涤固相萃取小柱，将F-18 SFB洗脱至接收瓶2中。接着从储液瓶C中加入2毫升乙腈，用2毫升水稀释固相萃取纯化的F-18 SFB，并将混合液转移至5毫升HPLC进样环中。将溶液注入放射性高效液相色谱仪（radio HPLC）。含有纯化后的 F 18 SFB 的组分应在约8至10分钟的保留时间出现。将样品收集到预先装有10毫升水的样品瓶D中。此处收集的馏分体积必须为五毫升。将D瓶中的稀释反应混合物通过第二个固相萃取小柱，利用10 psi的氮气捕获纯化的F 18 SFB。待混合物完全通过后，用氮气吹干小柱2至3分钟。将纯化的F 18 SFB洗脱至旋转蒸发仪三中。从E储液瓶加入3毫升乙醚。最后，使用40摄氏度温水浴，通入温和的氮气流，将旋转蒸发仪三中的溶剂完全蒸发至干燥。最终得到的干燥F 18 SFB可重新溶解于PBS缓冲液中，用于后续应用。通过将HPLC保留时间与非放射性SFB参比品进行比较，确认了最终F 18 SFB产物的结构。纯化后的F 18 SFB还通过放射性薄层色谱（radio TLC）和HPLC分析，以确定其放射性、化学纯度和化学纯度。F 18 SFP的放射化学产率为35±5%，在HPLC纯化后60分钟内具有高放射化学纯度和良好的化学纯度。比活度为每微摩尔1.8至9居里，具体数值取决于起始放射性活度。请注意，操作辐射和放射性物质可能具有极高危险性，在执行本实验步骤时，必须始终采取适当的防护措施，例如使用屏蔽装置、个人剂量计以及远程可控仪器。

microwave-assisted-one-pot-synthesis-n-succinimidyl-4

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

微波辅助合成一锅 N -琥珀酰亚胺- 4 - [ 18 F] fluorobenzoate（[ 18 F] SFB）

我们演示了[18F]3F4AP的半自动化放射性化学合成及质量控制步骤。...

自动化的放射化学合成[18F]3F4AP：一种用于成像脱髓鞘疾病的新型PET示踪剂

本文介绍了一种高效热活化延迟荧光发光材料的放大合成方法。...

基于二苯并噻吩-S,S-二氧化物核心的热激活延迟荧光发光体的化学合成放大

我们描述了一种用于临床前体内追踪癌症转移的实验方案。该方法基于一种放射性核素-荧光双模报告系统，结合了可通过无创[18F]四氟硼酸盐-PET检测的钠碘同向转运体以及用于简化体外验证的荧光蛋白。该方法不仅适用于肿瘤生物学研究，还可广泛应用于其他领域的临床前体内细胞示踪。...

放射性核素-荧光报告基因成像技术用于追踪啮齿类动物肿瘤模型中的肿瘤进展

参与多项早期临床研究试验的正电子发射断层扫描（PET）成像机构需要具备强大且多功能的放射性示踪剂制备能力。以放射性示踪剂[18F]Clofarabine为例，我们阐述如何利用一种灵活的、基于卡匣式放射性合成仪实现放射性示踪剂的自动化合成，并验证该合成方法在临床应用中的可行性。...

自动化正电子发射断层扫描（PET）放射性示踪剂合成方案用于临床生产

本方案展示了如何使用Auto-CHO软件进行寡糖的分级和可编程一锅法合成。同时描述了RRV测定 实验以及SSEA-4一锅法糖基化的一般操作流程。...

一锅法合成寡糖的层级化与程序化策略

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18F-标记含硅氟受体（SiFA）功能化放射性示踪剂用于正电子发射断层扫描

本方法介绍了一种基于液滴化学反应的新型高通量方法，可利用纳摩尔量级的试剂快速且经济地优化放射性药物。...

利用液滴阵列优化放射化学反应

本文介绍了一种在放射化学合成系统中采用一锅法、两步策略合成1-(2-[18F]氟乙基)-L-色氨酸的方法，该化合物是一种用于研究色氨酸代谢的正电子发射断层成像示踪剂，具有较高的放射化学产率、高对映体过量以及良好的重复性。...

使用一锅法两步法合成1-(2-[18F]氟乙基)-L-色氨酸

介绍了一种用于在商用微波反应器中进行固相多肽合成的简单、低成本且新颖的装置。...

一种用于固相多肽合成的商用微波反应器的低成本改装方案

本方案描述了一种制备并评估阳离子肽Mel4及肽模拟物RK758的抗菌活性与细胞毒性的方法。通过整合化学合成、重组表达及标准化功能检测，该方法为肽类分子及小分子模拟物的制备与测试提供了简化的操作流程。...

抗菌肽及其模拟物的制备与检测

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