Name: 在体内脊髓的鼠标线使用双光子显微镜成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学习使用双光子显微镜对小鼠脊髓进行稳定活体成像的方法。通过深度麻醉和定制脊髓固定装置，有效减少呼吸引起的运动伪影，实现高分辨率纵向成像，用于研究小胶质细胞与血管动态相互作用及神经退行性疾病。

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本研究工作得到了美国国家多发性硬化症协会资助项目号 RG4595A1/T（授予 DD）以及美国国立卫生研究院/神经疾病与中风研究所资助项目号 NS051470、NS052189 和 NS066361（授予 K.A.）的支持。图片和视频改编和/或重印自 Davalos et al., J Neurosci Methods. 2008 Mar 30;169(1):1-7 版权所有 © 2008，经 Elsevier 出版社许可。

1. 构建脊柱稳定装置
<ol>
	<li>订购Narishige STS-A紧凑型脊髓夹和Narishige MA-6N头部固定适配器。</li>
	<li>自行设计并制作一块不锈钢底板，用于将两个Narishige部件对齐固定，以便在夹紧动物脊柱和尾部的同时支撑其头部。需注意整个装置应能置于显微镜物镜下方，通常需放置在降低的显微镜载物台上。</li>
</ol>
2. 动物手术
<ol>
	<li>使用空气加热装置预热显微镜腔室，并维持在 37 °C。</li>
	<li>称量动物体重，并按每公斤体重 100 mg 氯胺酮、15 mg 赛拉嗪和 2.5 mg 乙酰丙嗪的比例配制麻醉混合液，在无菌条件下用 0.9% NaCl 溶液稀释。</li>
	<li>通过腹腔注射麻醉混合液（KXA）对动物进行麻醉。实验过程中应定期进行足趾夹捏测试，以确保麻醉深度。每小时或根据需要追加初始剂量的一半。</li>
	<li>在手术过程中使用小动物加热垫提供体温支持。</li>
	<li>在眼睛上涂抹人工泪液软膏，以防止角膜脱水和损伤。</li>
	<li>先用修毛器、再用锋利刀片剃除动物背部毛发，彻底清除切口周围区域的毛发。</li>
	<li>清除剃除的毛发，并用酒精棉片消毒剃毛后的皮肤表面。</li>
	<li>在目标脊髓节段（本例显示为胸椎）上方的皮肤做一小段约 1.5 cm 的纵向切口。</li>
	<li>小心牵拉皮下结缔组织，暴露背部肌肉。</li>
	<li>在目标节段小心分离椎旁肌与脊柱。尽可能减少切口数量，仅在每个棘突两侧切断肌肉附着点，然后将游离的肌肉从椎板表面刮除。</li>
	<li>选择将要切除的椎板，并在脊柱两侧准备脊柱夹的插入位置，分别位于椎板切除部位的头侧和尾侧。小心移开肌肉组织，形成四个用于插入夹子的 pockets（小腔隙）。</li>
	<li>用直齿尖镊子轻轻抬起脊柱，以便将弯头钝尖剪刀安全地插入椎板下方而不接触脊髓。缓慢先在一侧、再在另一侧剪断骨质，完成椎板切除术。</li>
	<li>使用棉签或在切口旁放置预先剪好的小块可吸收明胶海绵（Gelfoam）以控制少量出血。如有必要，使用小血管电凝器止血。用预热的无菌人工脑脊液（ACSF）冲洗组织。</li>
</ol>
3. 脊柱的稳定化及准备 体内 成像
<ol>
	<li>将动物放置在脊柱稳定装置底板上的抬高垫上，并将其头部固定在头部固定适配器中。</li>
	<li>沿动物的前后轴方向，将 STS-A 装置的脊柱夹置于椎板切除术两侧预先制备好的口袋中 (图 1)。两个夹子应相对于动物的头尾轴呈约 45° 角放置，以便为将水浸物镜 lowered 至暴露的脊髓上方留出足够空间（图 1）。</li>
	<li>将 STS-A 装置的第三个夹子置于尾部基部，以便在移除抬高垫后，可在整个成像实验期间将动物身体悬空固定（图 1）。</li>
	<li>使用 Gelseal（Amersham Biosciences Corp.）在暴露的脊髓周围构建一个小的围堰，以利于将脊髓维持在 ACSF 中，并使显微镜物镜浸入该溶液中进行 体内 成像。</li>
</ol>
4. 在 利用双光子显微镜对小鼠脊髓进行活体成像
<ol>
	<li>将动物连同脊柱稳定装置一起转移至覆盖显微镜的预热腔室内，并将其固定在降低的显微镜载物台上，使椎板切除部位正对物镜下方（图1）。</li>
	<li>小心地将水浸物镜浸入ACSF溶液中，确保其不接触脊柱夹具或Gelseal密封材料。</li>
	<li>使用落射荧光识别目标区域并进行聚焦。切换至激光扫描模式，根据成像组织中存在的荧光染料，选择适当的双光子激光激发波长、二向色镜和带通滤光片，进行in vivo成像。</li>
</ol>
5. 重复成像与术后护理
<ol>
	<li>成像实验结束后，将小鼠从脊柱稳定装置中取出，并小心擦去椎板切除区域周围的Gelseal。彻底清洁该区域。</li>
	<li>将背部肌肉复位并缝合覆盖椎板切除区域。</li>
	<li>将皮肤复位并缝合覆盖椎板切除区域，用碘伏擦拭消毒。</li>
	<li>皮下注射1 ml乳酸林格氏液（Baxter Healthcare），作为营养和补水补充，并给予镇痛治疗（0.1 mg/kg布托啡诺）。</li>
	<li>腹腔注射抗菌药物进行抗感染处理（每只小鼠0.03 ml，2.27%恩诺沙星注射用抗菌溶液）。</li>
	<li>将动物置于加热垫上直至从麻醉中完全恢复，之后单独饲养。</li>
	<li>术后前3–5天每日重复给予抗菌药物，术后2–3天内每8–12小时给予一次镇痛治疗。每天监测动物状态，确保其行为正常并完全恢复。</li>
	<li>若需通过同一椎板切除区域再次成像，可重新切开已缝合的皮肤和肌肉，并重复第2–4节中描述的步骤。</li>
	<li>利用血管系统作为定位参考，重新定位先前成像的区域，方法如前所述10。</li>
</ol>
6. 代表性结果
所有动物实验均按照加州大学旧金山分校机构动物护理与使用委员会制定的指南进行，并符合联邦法规。图1展示了脊柱稳定装置的照片以及小鼠在显微镜镜头下固定于该装置上的示意图。在动物身体下方留出足够的空间以保证呼吸运动，可确保稳定 体内 脊髓成像 图2 显示了小胶质细胞与血管系统之间的密切关系，该图像为成像结果 体内 脊髓中 Cx3cr1GFP/+ 转基因小鼠18，其中小胶质细胞被内源性地标记为GFP。 图3 展示重复性的示例 体内 在表达脊髓轴突荧光蛋白（YFP-H 系）的小鼠中，于相同的脊髓区域进行成像 3）以及小胶质细胞（在中枢神经系统中） Cx3cr1GFP/+ 小鼠
 
 
<img alt="用于精确脑部手术的大鼠立体定位装置；设备示意图与手术图解" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 小鼠脊柱的固定 体内 使用双光子显微镜进行成像。 （A） 定制的钢制底板用于支撑并校准STS-A Narishige紧凑型脊髓夹具和MA-6N Narishige头部固定适配器，如图所示。 （B） 使用KXA麻醉剂对成年转基因小鼠进行麻醉后，将其正确固定于脊柱稳定装置上。插图显示了脊柱夹钳的位置，分别位于椎板切除部位的头侧和尾侧，以及暴露的脊髓组织。
<img alt="荧光显微镜下突出显示的神经细胞，血管结构呈红色，细胞呈绿色。" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 活体成像显示麻醉小鼠脊髓中高密度的小胶质细胞与血管结构。投影但未对齐的z轴层扫图像显示：(A) 在CX3CR1GFP/+小鼠脊髓中，大量表达GFP的致密小胶质细胞（绿色），紧邻血管结构（红色，通过尾静脉注射罗丹明葡聚糖标记）；(B) 单个小胶质细胞的高倍放大图像，标记方式同(A)，该细胞附着于血管壁，并延伸出突起环绕血管并朝向脊髓实质。比例尺：10μm。
<img alt="显示随时间变化的胶原纤维和荧光标记血管的神经生长显微图像。" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 在不同天数对麻醉小鼠脊髓中相同的轴突节段和小胶质细胞进行重复活体成像，观察其迁移与重新成像情况。（A）YFP标记的轴突在第0天和第5天的图像。（B）在第0天和第1天对Cx3cr1GFP/+小鼠脊髓中相同的血管结构及其周围的小胶质细胞进行活体成像。比例尺，10μm。
视频 1. 代表性延时序列采集 体内 来自小鼠脊髓。该序列详细展示了在富含荧光结构的组织内，小胶质细胞精细突起的动态（绿色）及其随时间与血管系统（红色，通过尾静脉注射罗丹明葡聚糖标记）的相互作用。原始图像仅对背景噪声、亮度和对比度进行了校正，时间序列视频通过依次获取的图像堆栈进行z轴投影构建，未进行图像对齐、平均化处理或单个z平面的选择。血管所处的z平面范围与小胶质细胞图像相近。z平面深度： 38 μm. <a alt="视频 1" href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_1.mov">点击此处观看视频。</a>
视频 2. 时间序列显示在单个 z 平面水平上成像方法的原始稳定性。CX3CR1GFP/+ 小鼠在 KXA 麻醉下固定于脊柱稳定装置上，对其脊髓同一单 z 平面进行快速采集，以每秒 1 帧的扫描速率连续成像，结果显示连续帧之间的图像位移极小，该扫描速率快于小鼠的呼吸频率。残余的微小位移可能源于心跳。<a alt="视频 2" href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">点击此处观看视频。</a>

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
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<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+astrocytic+Ca2%2B+signaling+and+the+microvasculature+in+experimental+mice+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).</li>
<li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Fractalkine+Receptor+CX3CR1+Function+by+Targeted+Deletion+and+Green+Fluorescent+Protein+Reporter+Gene+Insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat. Med. 11, 572-577 (2005).</li>
<li>Kim, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).</li>
<li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li>
<li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4%2B+T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 203, 505-511 (2006).</li>
<li>Lindquist, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).</li>
<li>Schwickert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((vivo+imaging+of+germinal+centres+reveals+a+dynamic+open+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure.</a> Nature. 446, 83-87 (2007).</li>
</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法利用双光子显微镜，可在麻醉小鼠的脊髓中对密集分布的荧光标记细胞结构进行稳定且可重复的体内成像。所实现的成像稳定性得益于一种自制的脊柱稳定装置以及可减少呼吸运动伪影的麻醉方案。该脊柱稳定装置在小鼠身体下方留有呼吸空间，可使用市售的脊柱夹具和头部固定部件组装而成（图1）。该方法具有高度可重复性、微创性，且能持续获得原始数据，无需进行大量图像后期处理即可用于实验分析（图2和视频1）。因此，该技术可用于研究大量市售荧光标记小鼠品系中的细胞间相互作用（图1-3及视频1）。该方法不仅能解析密集分布的细胞结构，还可捕捉快速发生的细胞功能或反应（视频1、2）。例如，可用于定量测量小胶质细胞突起随时间的动态变化及其在趋化行为中移动的距离。定量分析方法可参照我们先前对活体脑组织中小胶质细胞反应成像的研究中所描述的方法8。此外，该方法还可与其他实验技术联合使用，例如结合荧光标记微球来在体内测量脊髓中小胶质细胞的吞噬功能。
能够在不同时间点对同一动物脊髓的完全相同区域进行重复的体内成像，使得研究生物现象的进展过程以及解...

<table><tbody><tr><td>罗丹明B-葡聚糖</td><td>Invitrogen</td><td>D1841</td><td>70 kDa，用&lt;br/&gt;ACSF 溶液稀释（3% w/v）</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Bioniche Pharma</td><td>NDC 编号：67457-001-10</td><td>注射用，50 mg/ml</td></tr><tr><td>Anased</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>NADA 编号：139-236</td><td>注射用赛拉嗪&lt;br/&gt;20 mg/ml</td></tr><tr><td>乙酰丙嗪</td><td>Vedco, Inc.</td><td>NADA 编号：117-531</td><td>注射用，10 mg/ml</td></tr><tr><td>人工泪液软膏</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Inc.</td><td>NDC 编号：57319-760-25</td><td>润滑剂</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-061617</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Westcott 剪刀</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>555500S</td><td>弯曲型钝头剪刀</td></tr><tr><td>直型镊子</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>555047FT</td><td>带齿尖镊子</td></tr><tr><td>小血管电凝器</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>明胶海绵</td><td>Pharmacia Corporation (Pfizer)</td><td>Mixer Mill MM400</td><td></td></tr><tr><td>紧凑型脊髓夹具</td><td>Narishige International</td><td>STS-A</td><td></td></tr><tr><td>头部固定适配器</td><td>Narishige International</td><td>MA-6N</td><td></td></tr><tr><td>Gelseal</td><td>Amersham</td><td>80-6421-43</td><td></td></tr><tr><td>乳酸林格氏液</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>2B8609</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺注射液</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>NDC 编号：12496-6757-1</td><td>布托啡诺，注射用</td></tr><tr><td>拜耳喹诺</td><td>Bayer AG</td><td>NADA 编号：140-913</td><td>恩诺沙星&lt;br/&gt;抗菌注射液&lt;br/&gt;2.27% (20 ml)</td></tr><tr><td>加热垫 - 大号</td><td>Fine Science Tools</td><td>21060-10</td><td></td></tr></tbody></table>

体内 使用双光子显微镜对小鼠脊髓进行成像

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

利用双光子显微镜对经基因工程改造、可在特定细胞类型中表达荧光蛋白的小鼠进行体内成像1，已显著拓展了我们对多种组织在体内生理与病理过程的认识2-34-7。在中枢神经系统（CNS）的研究中，体内成像技术已广泛应用于大脑研究，获得了大量关于神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞等细胞在生理或病理条件下行为的新发现，其中许多结果出乎意料8-17。然而，由于主要存在技术上的困难，体内成像在活体小鼠脊髓研究中的应用仍受到限制。特别是脊髓与肺和心脏在解剖位置上邻近，会产生显著的运动伪影，使活体脊髓成像成为一项具有挑战性的任务。
我们开发了一种新方法，通过稳定脊柱并减少呼吸引起的运动，克服了脊髓成像的固有局限，从而便于利用双光子显微镜对小鼠脊髓进行成像 体内通过结合定制的脊柱稳定装置与深度麻醉方法，显著减少了由呼吸引起的身体运动。本视频方案展示了如何暴露活体脊髓的一小部分区域，并通过最大限度地减少组织损伤和出血，使该区域在较长时间内保持稳定的生理状态。所获取的代表性原始图像 体内 高分辨率地详细展示小胶质细胞与血管系统之间的紧密关系。时间序列成像显示了活体小鼠脊髓中小胶质细胞突起的动态行为。此外，对同一 z 平面进行连续扫描，展示了该方法所能达到的卓越稳定性，可生成无需在采集后进行图像对齐的图像序列或延时电影。最后，我们展示了如何利用该方法在后续时间点重复观察和成像脊髓的同一区域，从而实现对持续进行的生理或病理过程的纵向研究 体内.

一种微创方案，用于稳定小鼠脊柱并进行重复性操作 体内 使用双光子显微镜进行脊髓成像的方法被描述。该方法结合了脊髓稳定装置和麻醉方案，以最小化呼吸引起的运动，从而获得无需对齐或其他后处理的原始成像数据。

使用双光子显微镜对经基因工程改造后在特定细胞类型中表达荧光蛋白的小鼠进行活体成像……

本实验的目的是利用双光子显微镜在活体小鼠脊髓中进行稳定的在体成像。首先使用一种麻醉混合物对动物进行麻醉，以实现稳定且平缓的呼吸节律。实验的第二步是在目标节段暴露脊柱，随后进行椎板切除术以暴露下方的脊髓，从而实现活体成像。第三步是将动物放置在脊柱稳定装置上。最后一步是分离暴露的脊髓节段。为进行活体成像，最终可通过双光子显微镜进行延时活体成像，获得详细描述活体脊髓中细胞动态行为及其与其他细胞类型或结构相互作用的结果。与以往尝试对脊髓进行活体成像的技术相比，该技术的主要优势在于能够生成无需后期处理的活体成像数据，可立即进行评估并用于进一步分析。该技术的应用意义延伸至脊髓损伤或疾病后的治疗领域，例如，它使我们能够在损伤后实时研究轴突的变性或再生过程，而不仅限于脊髓损伤本身。该技术可用于研究炎症性或神经退行性过程在疾病动物模型中的进展，例如多发性硬化症或肌萎缩侧索硬化症，因为在这些疾病中，病理变化在脊髓中尤为显著。开始实验前，先称量动物的体重。随后，通过腹腔注射麻醉剂混合物对动物进行麻醉。在整个实验过程中，定期进行足趾夹捏测试，以确保动物处于深度麻醉状态，并根据需要每小时补充原剂量一半的麻醉剂。然后在眼睛上涂抹人工泪液软膏，以防止角膜脱水和损伤。使用修毛工具修剪动物背部的毛发，并用锋利刀片剃除剩余毛发。对剃毛区域进行消毒后，将动物置于显微镜下，从目标脊髓节段处做一个约1.5厘米长的纵向小切口，开始手术操作。通过仔细牵开皮下结缔组织，暴露背部肌肉。然后在目标节段小心地将椎旁肌肉从脊柱上分离。从每个棘突两侧分离肌肉时，应尽量减少切口数量。随后，将脱离的肌肉从筋膜表面刮除。如有必要，使用小型血管电凝器控制轻微出血。持续刮除肌肉，直至充分暴露下方的筋膜层，并能清晰辨认出需要切除的筋膜。为准备脊柱夹在脊柱两侧的进入位置，将一对弯剪的尖端插入椎旁肌之间，小心分离肌肉组织，以形成四个用于放置夹子的 pockets。使用直齿尖镊子抬起脊柱，以便将弯头钝头剪安全地插入椎板下方，同时避免接触脊髓。随后，通过缓慢地先在一侧再在另一侧切割骨组织进行椎板切除术，并使用棉签或在切口旁插入预先裁剪的小块可吸收明胶海绵以控制少量出血。随后，使用预热的无菌人工脑脊液冲洗组织。脊柱稳定装置为定制设计，主要部件包括Nagate STSA复合型脊髓夹和Nagate MA六N型头部固定适配器。不锈钢底板用于固定两个Nagate部件，使其对齐，从而在夹紧动物脊柱和尾部的同时支撑其头部。请注意，整个装置应能置于显微镜物镜下方，并位于降低的显微镜载物台上，以稳定动物。首先，将装置放置在脊柱稳定装置底板的垫高垫片上。在将动物头部固定于头部固定适配器后，将 SDSA 装置的脊柱夹沿动物的前后轴方向放入预先准备好的口袋中，位于椎板切除部位的两侧。将两个夹子以大约 45 度的角度放置在动物 ROS 绳状轴的两侧，以便为浸水物镜留出足够的空间，使其能够覆盖暴露的脊髓。然后将第三个夹子置于尾部基部，以便在成像实验中移除垫高垫后悬吊动物身体。接下来，在暴露的脊髓周围用凝胶密封构建一个小的围堰，以利于将脊髓维持在人工脑脊液（A CSF）中。然后，当你准备开始活体成像时，移除抬高垫，将稳定装置移至预热的显微镜腔室，并放置在降低的显微镜载物台上。务必使椎板切除部位与物镜对齐。小心地将水浸物镜浸入 aCSF 溶液中，并确保其不接触脊柱夹具或凝胶密封层。使用落射荧光识别感兴趣区域，随后对其进行聚焦。切换至激光扫描模式，并针对成像组织中存在的荧光染料，采用适当的双光子激光激发波长、二向色镜和带通滤光片进行活体成像。成像实验结束后，将动物从脊柱稳定装置中取出。仔细擦拭椎板切除区域周围的凝胶密封物并进行清洁。将背部肌肉在椎板切除部位上方仔细缝合。然后缝合皮肤切口，并用聚维酮碘擦拭，此处显示为Zack图像的投影，这些图像在体内获取后，沿Z轴投影而未进行图像对齐。图像显示了脊髓中大量密集的绿色GFP阳性小胶质细胞，它们与红色的血管紧密相邻。这是一张高倍放大的图像，展示了一个附着在血管壁上的单个小胶质细胞，其部分突起围绕血管延伸，另一些则朝向脊髓实质。以下是同一YFPH品系小鼠脊髓中相同YFP标记的轴突节段在相隔五天的两次成像会话中被重新定位并再次成像的重复性活体成像示例。这是另一个重复成像的示例，展示了在连续两天对同一血管结构和小胶质细胞在脊髓中进行的活体成像。以下是从脊髓体内获取的一个代表性延时成像序列。该序列详细展示了绿色的小胶质细胞细小突起的动态行为，以及它们与红色血管系统的相互作用。随着时间推移，原始图像仅针对背景噪声、亮度和对比度进行了校正，并通过逐层去除图像堆栈（未进行图像对齐）构建了延时视频。对澳洲选择的各个层面进行平均，血管所经过的Z平面范围与小胶质细胞图像的Z平面范围相似。图像体积的深度为38微米。这是一段延时序列，显示了成像方法在单个Z平面水平上的稳定性。对一只使用KXA混合物麻醉并固定在脊柱稳定装置上的CX3CR1-GFP杂合小鼠的脊髓同一单Z平面进行快速连续成像，结果显示连续帧之间图像位移极小。值得注意的是，该序列的采集速率为每秒一帧，快于小鼠的呼吸频率。残余的微小位移可能源于动物的心跳。在进行该操作时，重要的是要记住将切口数量限制在最低程度，并在出现任何轻微出血时立即加以控制。现在，在观看本视频后，您应该已充分了解如何利用双光子显微镜对小鼠脑部进行稳定的活体成像。

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体内使用双光子显微镜对小鼠脊髓进行成像

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