Name: 大脑中动脉闭塞的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学习小鼠大脑中动脉闭塞的线栓法手术操作，通过颈外动脉插入单丝阻断MCA血流，建立局灶性脑缺血模型，并使用TTC染色评估梗死体积。该方法无需开颅，为脑卒中病理机制和治疗研究提供可靠工具。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 NS057195、加州大学旧金山分校（UCSF）REAC 奖项以及肯特州立大学启动资金对 W.H. Chou 的资助。

1. MCAO 方法
本方案已获得加州大学旧金山分校和肯特州立大学的机构动物护理与使用委员会批准，并遵守美国国立卫生研究院关于实验动物使用指南。
<ol>
	<li>将5-0单丝缝合线（Harvard Apparatus，Holliston，MA）剪成20 mm的节段。通过在电灼器附近加热（Braintree Scientific, Inc.，Braintree，MA）使每个节段的末端变圆。使用千分尺（Applied Image Inc.，Rochester，NY）测量末端的直径。对于体重为25-30 g的小鼠，我们使用末端直径为0.21-0.22 mm的缝合线。</li>
	<li>通过高压灭菌（至少121 °C，15 PSI，持续15分钟）对所有外科器械进行灭菌。使用70%乙醇对手术台及相关设备进行消毒。</li>
	<li>使用V-10麻醉系统（VetEquip, Inc.，Pleasanton，CA），以5%异氟烷（Aerrane，Baxter，Deerfield，IL）在30% O2 / 70% N2O混合气体中对8-12周龄小鼠（25-30 g）进行麻醉。诱导麻醉后，将异氟烷浓度降低并维持在1.5%。</li>
	<li>将小鼠仰卧位放置于加热垫上。插入直肠探针，并使用TR-200恒温控制系统（Fine Science Tools Inc.，Foster City，CA）监测并维持体温在36.5-37.5 °C之间。</li>
	<li>使用电动剪刀（Braintree Scientific）剃除颈部腹侧区域的毛发以暴露皮肤。使用70%乙醇对术区进行三次消毒。</li>
	<li>在体视解剖显微镜（Nikon，日本）下，在颈部做一条长约1 cm的正中切口。使用牵开器（Braintree Scientific）暴露手术视野，识别右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。仔细分离动脉周围的神经和筋膜组织。</li>
	<li>进一步向远端分离ECA，并使用双极电凝器（Howard Instrument Inc.，Tuscaloosa，AL）对ECA及其甲状腺上动脉（STA）分支进行电凝。在电凝段处切断ECA和STA。</li>
	<li>在ECA残端周围松松地绑两根8-0丝线缝合线。在CCA分叉为ECA和ICA处应用血管夹（Fine Science Tools）。</li>
	<li>使用Vannas型弹簧剪刀（Fine Science Tools）在ECA残端末端做一个小切口。测量并记录末端已变圆的5-0单丝缝合线的长度。将缝合线插入切口并推进至夹闭处。将两根丝线缝合线适度收紧，以固定但不阻碍留置单丝缝合线的移动。</li>
	<li>移除分叉处的血管夹。轻柔地将单丝缝合线从ECA管腔推进至ICA，超过CCA分叉处9-10 mm，以阻塞大脑中动脉（MCA）起始部。手术持续时间约为30-45分钟。</li>
	<li>缝合颈部切口，将小鼠置于35 °C的护理箱中恢复麻醉，随后放回笼中。小鼠通常需要5-10分钟恢复意识。若需建立短暂性MCAO模型，研究人员可在一定时间后（通常为0.5-2小时）重新麻醉小鼠，并将缝合线撤回ECA残端内。</li>
	<li>MCAO造模24小时后，使用5%异氟烷麻醉小鼠，并通过颈椎脱臼法实施安乐死。断头取脑，将脑组织置于冰上，使用脑切片模具（Braintree Scientific）冠状切成四个2 mm厚的切片。将脑切片在室温下用含2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）（Sigma-Aldrich）的1×PBS溶液孵育20分钟，以评估梗死范围和大小。随后将脑切片在4 °C条件下用10%中性缓冲福尔马林溶液（Sigma-Aldrich）固定，直至成像。梗死面积的定量分析可参照JoVE实验方案955（<a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955</a>）9中的方法进行。</li>
</ol>
2. 代表性结果
MCAO 诱导的梗死灶出现在纹状体和背外侧皮层。纹状体对缺血的敏感性高于大脑皮层。30 分钟的 MCAO 仅会导致纹状体发生梗死，而超过 1 小时的 MCAO 则会同时损伤纹状体和皮层。在永久性 MCAO 24 小时后，总梗死面积约占半球体积的 ~40±5%，术后死亡率约为 ~10%。如果在手术过程中出现大量出血、手术时间超过 90 分钟、小鼠在 15 分钟内未能从麻醉中恢复，或在死后检查中发现脑切片或 Willis 环基底部存在出血，则将小鼠排除在后续研究之外。
<img src="/files/ftp_upload/2761/2761fig1.jpg" alt="脑缺血进展的四层示意图，展示组织损伤梯度。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 永久性大脑中动脉阻塞（MCAO）24小时后TTC染色脑切片的代表性图像（冠状面第1-4层）。在活体组织中，TTC通过脱氢酶的酶促反应被还原为1,3,5-三苯基四氮唑（TPF），呈现红色；而在坏死区域，由于缺乏此类酶活性，TTC保持白色。因此，梗死区域因无法将TTC转化为TPF而呈现白色，可据此识别。注意：TTC对热和光较不稳定，应尽可能避免染色切片暴露于热源和光照下。

<ol><li>Howard, G., Howard, V. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoward%2C+G+%22Distribution+of+stroke%3A+hetrogeneity+of+stroke+by+age%2C+and+sex%22">Distribution of stroke: hetrogeneity of stroke by age, and sex</a>. , Elsevier Inc. New York. 3-12 (2004).</li>
<li>Thom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2006+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association+Statistics+Committee+and+Stroke+Statistics+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2006 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.</a> Circulation. 113, e85-e151 (2006).</li>
<li>Mohr, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMohr%2C+JP+%22Middle+cerebral+artery+disease%22">Middle cerebral artery disease</a>. , Elsevier Inc. New York. 123-166 (2004).</li>
<li>Longa, E. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20, 84-91 (1989).</li>
<li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+protein+kinase+Cdelta+as+a+mediator+of+stroke-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Neutrophil protein kinase Cdelta as a mediator of stroke-reperfusion injury.</a> J. Clin. Invest. 114, 49-56 (2004).</li>
<li>Hudgins, W. R., Garcia, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+electrocautery%2C+atmospheric+exposure%2C+and+surgical+retraction+on+the+permeability+of+the+blood-brain-barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">The effect of electrocautery, atmospheric exposure, and surgical retraction on the permeability of the blood-brain-barrier.</a> Stroke. 1, 375-380 (1970).</li>
<li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+stroke%3A+size%2C+mechanism%2C+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx. 2, 396-409 (2005).</li>
<li>Durukan, A., Tatlisumak, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ischemic+stroke%3A+overview+of+major+experimental+rodent+models%2C+pathophysiology%2C+and+therapy+of+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Biochem.+Behav%22%5BJournal%5D)">Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia.</a> Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).</li>
<li>Taniguchi, H., Andreasson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypoxic-ischemic+encephalopathy+model+of+perinatal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

我们没有需要披露的潜在利益冲突。

小鼠MCAO模型常用于模拟人类的局灶性脑缺血。由于存在多种转基因和基因敲除小鼠品系，小鼠在脑卒中研究中的使用日益增多。本实验方案中有几个关键细节需要注意：
<ol>
	<li>手术期间以及小鼠完全从麻醉中恢复之前，必须维持其体温。体温会影响梗死范围；低温会减小梗死面积，而高温则会增大梗死范围。</li>
	<li>暴露和分离颈总动脉（CCA）与颈外动脉（ECA）时，应避免损伤邻近的迷走神经和气管，否则可能增加梗死面积并降低存活率。</li>
	<li>单丝缝合线插入位置不得超过分叉点10 mm。缝合线插入过深可能穿破大脑前动脉，导致脑出血。当缝合线推进至分叉点远端约9–10 mm时，会遇到一定阻力。若出现此情况，研究人员应停止推进缝合线，并确认插入距离。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>异氟烷</td><td>化学试剂</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>95045-588</td><td></td></tr><tr><td>V-10 麻醉系统</td><td>设备</td><td>VetEquip</td><td>901807</td><td></td></tr><tr><td>TR-200 温度控制器</td><td>设备</td><td>Fine Science Tools</td><td>21060</td><td></td></tr><tr><td>电动剪毛器</td><td>设备</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>CLP-9931</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>设备</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>牵开器系统</td><td>设备</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>ACD-014</td><td></td></tr><tr><td>双极电凝器</td><td>设备</td><td>Howard Instrument</td><td>64000</td><td></td></tr><tr><td>丝线缝合线</td><td>材料</td><td>Harvard Apparatus</td><td>510479</td><td></td></tr><tr><td>单丝缝合线</td><td>材料</td><td>Harvard Apparatus</td><td>723351</td><td></td></tr><tr><td>血管夹</td><td>设备</td><td>Fine Science Tools</td><td>00396-01</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪刀</td><td>设备</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>脑组织切片模具</td><td>设备</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>BS-2000C</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-三苯基氯化四氮唑</td><td>化学试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>化学试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠大脑中动脉闭塞模型

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

脑卒中是美国最常见的致命性神经系统疾病1。大多数脑卒中（88%）由脑内血管阻塞引起（即缺血性脑卒中）2。由于大多数缺血性脑卒中（约80%）发生在大脑中动脉（MCA）供血区域3，因此已开发的许多动物脑卒中模型均集中于该动脉。大脑中动脉闭塞（MCAO）的经腔单丝模型是将手术缝线经颈外动脉插入，并沿颈内动脉（ICA）向前推进，直至其尖端阻塞大脑中动脉起始部，从而导致MCA供血区域血流中断并继发脑梗死4。该技术可用于模拟永久性或短暂性闭塞5。若在一定时间间隔后（30分钟、1小时或2小时）撤出缝线，则可实现再灌注（短暂性MCAO）；若将缝线留置原位（24小时），则适用于建立永久性MCAO模型。该技术无需开颅术——一种切除部分颅骨的神经外科手术，而开颅可能影响颅内压和温度6。该方法已成为在大鼠和小鼠中模拟永久性和短暂性局灶性脑缺血最常用的技术7,8。为评估脑梗死范围，我们采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）对脑切片进行染色，以识别缺血脑组织9。在本视频中，我们将演示MCAO方法以及通过TTC染色测定梗死面积的操作过程。

我们在视频中演示了一种使用血管内单丝线栓在成年小鼠中建立大脑中动脉闭塞的方法。同时展示了如何通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色来评估脑梗死范围。

中风是美国最常见的致命性神经系统疾病¹。大多数中风（88%）由脑血管阻塞引起……

大家好，我叫Terrence Jam。我叫Hai Joe。今天我们将向您展示如何进行小鼠大脑中动脉闭塞模型的操作。那么，让我们开始吧。本实验首先进行缝合线的准备。先将缝合线剪成20毫米长的片段。接下来，将缝线尖端移向电灼器进行烧灼修整。随后，测量缝线尖端的长度。现在我们已准备好开始手术，将动物面朝上固定。沿中线做切口。使用镊子暴露颈外动脉。颈外动脉（ECA）上有许多分支。其中一个分支是甲状腺上动脉（STA）。需使用双极电凝镊对STA进行凝固处理，随后切断STA，以便更好地分离颈外动脉（ECA）。接下来，将颈外动脉（ECA）凝固，并尽可能远离颈总动脉（CCA）。此时，可考虑分离颈外动脉以获得更好的操作视野。然后，在颈外动脉上相距几毫米处松松地绑两根缝线。将夹子置于颈总动脉（CCA）分叉为颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）的位置。随后夹闭ECA残端的末端。接下来，重新调整ECA位置，使其与ICA对齐。这使得缝线能够从颈外动脉（ECA）连续进入颈内动脉（ICA）。在插入前测量缝线的总长度。将缝线插入通过夹闭ECA残端所形成的开口中。当缝线穿过远端结扎处时，通过收紧来固定该结。接着，移除夹钳并将缝线进一步插入颈外动脉（ECA）。当缝线穿过近端结扎处时，通过收紧来固定该结。打紧两个结后，小心地将缝线沿动脉插入，直至穿过 9 到 10 毫米的缝线长度。该分叉点可通过从缝线总长度中减去至分叉点处的缝线长度来确定。当缝线到达大脑中动脉（MCA）起始处时。大脑中动脉被阻断。24小时后，处死动物并分离脑组织。进行TTC染色时，将分离出的脑组织置于模具中，用剃刀片切片。然后将脑组织置于2% TTC中，室温下孵育20分钟。最后，脑组织在中性缓冲甲醛中固定，过夜。缝合准备是一个精细的过程。以下是一些有用的提示。将缝合线和电灼器按如下方式放置。然后在保持电凝器不动的情况下，缓慢将缝线靠近。接下来，测量缝线以确保其尺寸合适。本实验中所用缝线的尺寸约为 0.21 至 0.22 毫米。手术开始时，将动物仰卧放置，使用30%氧气和70%氮气诱导麻醉。沿中线做切口，然后使用牵开器打开手术区域以获得充分暴露。操作后应呈现如下所示效果。用镊子小心分离组织。然后在分离颈外动脉（ECA）的过程中，用镊子暴露并游离ECA，同时需要凝固并切断颞浅动脉（STA）。这样可以游离出更长的一段ECA。接下来，需要借助双极电凝镊对颈外动脉（ECA）进行凝固。凝固后，需切断ECA。然后，游离ECA，并在其周围松松地结扎两根缝线，两线间距为数毫米。结果应类似于如下所示。现在将夹子夹在颈总动脉分叉为颈内动脉和颈外动脉的位置。确保夹子完全阻断血流进入颈外动脉。然后夹闭颈外动脉残端的末端。在ECA上开口后、插入缝线前测量缝线长度。插入缝线并使其穿过远端结扎处的开口。当缝线通过远端结后，拉紧打结。接下来，移除夹具。确认远端结牢固后，将缝线沿颈外动脉继续插入至近端结的远侧。然后，拉紧近端结。现在小心地将缝合线沿颈外动脉（ECA）插入至颈内动脉（ICA）。继续沿颈内动脉插入缝合线，直至缝合线超过分叉点9到10毫米。可通过从缝合线总长度中减去至分叉点的长度来确定插入距离。接下来，修剪缝线，使其不会损伤周围组织。然后缝合切口，并让小鼠恢复。术后24小时准备进行TTC染色。首先通过颈椎脱位法处死小鼠，然后从颅骨中分离出脑组织并置于模具中，接着用剃刀片进行切片，并在室温下用2%TTC染色20分钟。然后用10%中性缓冲福尔马林固定过夜。本次演示到此结束。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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医学

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