一种从黄热病蚊子 Aedes aegypti 收集并染色血细胞的实验方案

本实验的总体目标是从蚊虫中收集并染色血细胞。首先将少量抗凝稀释液注入经冷藏的蚊虫体内，以松解附着的血细胞，并使所有血细胞进入溶液状态。

该操作的第二步是去除蚊子的足、翅和腹部末端。第三步是在蚊子的另一部位注射新鲜稀释液，以启动灌注过程。最后一步是将稀释的血淋巴引导至已准备好的载玻片上，以便固定和染色所收集的血细胞。

最终，通过基础滑动显微镜技术可以获得结果，显示目标蚊种中存在的主要血淋巴细胞类型及其数量。该技术相较于现有方法（如灌注法）的主要优势在于，它结合了灌注法的简便性与高注射方法所带来的准确性，同时减少了达到最终目标所需的步骤。我们的目标是鉴定在免疫刺激下血细胞的类型及其丰度。

演示该技术的是来自我实验室的本科生 Amina Abdul Kum。在开始实验方案之前，将血淋巴稀释液配制成每份 1 毫升的等分试样，于 -20 摄氏度保存，已使用的等分试样剩余部分不得再次冷冻。

现在，在厚度为1毫米的显微镜载玻片上划出直径1厘米的圆圈。每只蚊子需要一个载玻片。准备好拉制的针头。

将每根拉制好的针尖端折断，以形成针的开口。将一根针安装到与其连接的持针器中，该持针器与显微注射仪的管路和注射器组件相连。接着，使用矿物油去除管路和持针器组件中的气泡。

用这支手持注射器吸取矿物油，并确保不要产生任何气泡。在针头下方放置一个物体以接住滴落的油。打开微量注射器的这一部分，然后将油注入此处，以排除所有气泡。

然后像安装其他吸头一样，将此部件卡到手持式注射器上。缓慢注入矿物油，使其流经塑料管，以排除其中存在的任何气泡。接着再次向顶部加满矿物油，直至油滴下为止。

然后将其重新连接到该玻璃注射器上，以避免产生气泡。接着用矿物油回填已组装的部件，直至针头导管和注射器完全充满矿物油。此时微型注射器已准备就绪，可用于稀释液的递送。

接下来，准备实验动物：将15只雌性成虫吸入一个小型实心笼状容器中，并将其完全浸入冰中。蚊虫在低温作用下会失去活动能力而被麻醉，通常在八分钟或更短时间内即可完成。将一只麻醉后的蚊虫置于凹面载玻片上，以进行显微注射操作。

在显微镜下，用显微注射器吸取12微升血淋巴稀释液。用镊子轻轻固定显微镜下的蚊子，并注入3至3.5微升稀释液。在第七和第八腹节之间，蚊子的腹部会膨胀。

注入稀释液时，可同时注射三只蚊子。在重新装填微量注射器之前，将所有已注射的蚊子放入盛有冰块的干净塑料杯中，让蚊子恢复约五分钟。在孵育期间，抗凝稀释液会释放黏附于内部组织的血细胞。

在第一批动物于培养箱中恢复期间，通常可对另外三到五只蚊子进行注射。注射后，在蚊子仍置于杯中的五分钟内，使用显微剪刀剪去其附肢、翅膀以及腹部第八节末端的尖端部分。注意不要将附肢和翅膀剪得过于靠近胸部或血淋巴。

可能会有蚊子逃逸。现在用70%乙醇清洗一张蚀刻载玻片，并用无尘纸擦干。在显微镜下，将一只解剖好的蚊子置于蚀刻圆圈的外边缘处。

用12微升新鲜稀释液填充显微注射器。用镊子夹住蚊子，将8至10微升注入中胸的侧面。注意在此注射后不要注入任何石蜡油。

用镊子轻轻挤压腹部，使血淋巴从腹部流入刻蚀圆圈内，并引导和促进血淋巴的流出。现在让收集到的血淋巴在载玻片上自然干燥，大约需要10分钟。

然后即可进行染色。用Hema three对每张载玻片分别染色。每张载玻片在固定液中浸渍五次，每次仅一秒钟。

随后在溶液一中浸洗三次，每次一秒，接着在溶液二中同样浸洗。现在仅用去离子水冲洗载玻片背面，不要冲洗正面。干燥正面后，用封片介质将盖玻片封固，轻轻按压盖玻片，使介质完全覆盖染色组织。

现在让载玻片至少干燥三小时以获得最佳效果。染色后的细胞应在制备后两周内进行观察和成像。本实验所用成年雌性个体的细胞即通过此方案鉴定。

第一张图像显示了一个原红细胞，其依据是细胞形态呈圆形且核质比高。此图像为中幼红细胞，依据是其细胞形态呈圆形以及胞质与细胞核的比例。最后，这是粒细胞类型的造血细胞。

与之前的高注射方法相比，其质地更呈颗粒状，形态上更接近OID。该方案获得的肝细胞总数相似，并且同样鉴定出颗粒状位点为最常见细胞类型。一旦掌握，若操作得当，该技术可在一小时内完成约15至20只蚊子的处理。

观看本视频后，您应充分了解如何正确地使用显微注射法向蚊虫注射物质，如何采集其血淋巴，以及如何对血淋巴样本进行处理以实现可视化观察与成像。