所有流感的定量分析类型使用通用抗体的一种病毒Hemagglutinins和Neuraminidases，在简单的狭缝杂交分析

该程序的总体目标是使用靶向保守表位的抗体定量测定疫苗中的流感病毒血凝素和神经氨酸酶含量。这是通过首先识别保守的表位来实现的。该程序的第二步是稀释参比样品和疫苗样品，以提高检测灵敏度。

第三步是组装槽式印迹仪并将样品装入槽中。该程序的第四步是使用各自的通用抗体检测膜上的 HA 或 NA。该程序的最后一步是通过光密度测定法量化 HA 或 NA 的量。

最终，可以获得显示 HA 或 NA 针对其各自参考抗原定量的结果。嗨，我叫 Anwar Hashem。我是 Sean Lee 博士实验室的博士生。

嗨，我叫 Caroline Grab，是加拿大卫生部疫苗评估中心 Sean Lee 博士实验室的一名技术员。今天，我们将演示用于量化流感病毒的 HA 和 NA 抗原的老虎机机器人程序。与现有方法（如单一径向免疫扩散 SRID）或物理化学方法相比，该技术的主要优点是它不需要与 SRID 或物理化学方法等复杂仪器相反的菌株或亚型特异性抗体。

此外，由于这些抗体靶向 RA 唯一普遍保守的表位，因此它们可用作感兴趣的研究人员的基础研究工具。通常，刚接触这种方法的人会遇到困难，因为他们可能会遇到技术问题，例如难以封闭沉淀的疫苗样品、插槽之间的样品泄漏和印迹步骤中的真空损失，以及免疫检测后观察到的弥散带的高背景。但是，关注一些关键步骤可以帮助解决这些问题。

我们今天将为您演示该程序。那么让我们开始吧。为了确定保守区域，我们使用聚类 W 比对分析了来自 NCBI 的总共 6， 000 多个甲型流感 HA 序列，发现 HA 两个亚基的 N 末端是高度保守的区域。

计算已鉴定的共有序列中每个氨基酸位置的 Shannon 熵和守恒率。选择红色所示的 UNI one 表位来开发用于狭缝印迹测定的 HA 通用抗体。使用类似的方法，在所有流感中鉴定出两个普遍保守的序列，一个 NA，一个靠近酶活性位点，另一个位于末端肽，具有这些氨基酸序列，用作抗原，产生针对 NA 的通用抗体，用于狭缝印迹测定。

在开始槽印迹程序之前，准备 20 毫升 TBS 中的四种 MO 尿素溶液用于血凝素或 HA 槽印迹，或 20 毫升 0.01% ergen 的 TBS 溶液用于神经氨酸酶或 NA 槽印迹，然后通过添加 20 至 A TBS 溶液至终浓度为 0.1% 来制备 2 升洗涤缓冲液下一个， 通过在洗涤缓冲液中将脱脂奶粉溶解至终浓度为 5% 重量比，制备 80 毫升封闭缓冲液。激活 PDF 膜和甲醇 15 秒，然后用双蒸水冲洗 2 分钟。将膜浸泡在 TBS 中，直到使用预先湿润的三张 T 印迹 SF 滤纸在 TBS 中，直到使用具有预定 HA 含量的流感疫苗参考标准与待测疫苗株相对应。

购自美国生物制品评价与研究中心或英国国家生物标准与控制研究所，用于通过狭缝印迹对 HA 参考抗原和检测疫苗样品进行 HA 或 NA 定量。在四个 molo urea TBS 中制备 650 微升稀释的 HA 参比抗原原液，浓度为所列浓度。然后在四种尿素 TBS 中以三种不同的稀释度（如 10 倍、20 倍和 40 倍）制备 650 微升测试疫苗样品，以实现两倍差异，并使样品浓度落在 NA 参考抗原和测试疫苗样品的标准曲线内。

在 0.01% sugen TBS 中制备 650 微升 650 微升 NA 抗原标准品储备液，并使用 SDS 页面结合密集细胞术分析在内部制备抗原标准品。然后在 0.01% sugen TBS 中以三种不同的稀释度（如 10 倍、20 倍和 40 倍）制备 650 微升测试疫苗样品，以实现两倍差异，并使样品浓度落在标准曲线内。将垫圈支撑板放入真空歧管中，将天花板垫圈放在顶部，组装先前清洁和干燥的 bio SF 微滤仪。

将三张湿润的 BIO SF 滤纸放在垫圈上。然后是预浸的 PVDF 膜。然后将样品模板放在膜顶部，并使用对角线交叉图案用手拧紧四个螺钉，以确保在膜表面均匀施加压力在连接设备之前，验证三通阀是否设置为将真空歧管暴露在真空源中。

打开泵并连接生物点仪。确保流量阀位于样品孔下方的水平面上，以便在以下步骤中快速、适当地排出样品。使用对角线交叉模式重复螺钉拧紧步骤。

在施加真空时拧紧螺钉可确保更紧密的密封并防止孔之间的交叉污染。然后更换流量阀，使真空歧管暴露在空气中并关闭泵。接下来，使用多通道移液器将 100 微升 TBS 涂抹到所有孔中，以对膜进行再水化。

将溶液涂抹在孔的中间并尽可能靠近底部，以便均匀覆盖插槽。使用干净的移液器吸头去除引入的任何气泡。更换流量阀，使歧管同时暴露在空气和真空中。

打开泵，用手指放在暴露在空气中的孔上，轻轻地将缓冲液从孔中排出，以调节真空度。然后更换流量阀，使歧管暴露在空气中。一旦缓冲液从所有孔中完全排出。

关闭泵或断开真空。每孔使用每种标准品或疫苗样品稀释液 200 μL。移取样品，一次一个，在每个孔的中心并尽可能靠近底部。

注意避免并移除 airable。将 200 μL 样品稀释缓冲液放入未使用的孔中，以确保对正在使用的孔进行适当的真空。调整流量阀，使歧管同时暴露在空气和真空中。

打开真空泵，用一根手指在暴露在空气中的孔上控制真空量，轻轻地让样品从孔中完全排出。从端口上取下手指以释放真空。一旦所有样品都立即排干。

向每个孔中加入 200 微升 TBS。使用多通道移液器，用一根手指在暴露在空气中的端口上控制真空量，施加温和的真空以排空和清洗孔。孔完全排空后，立即重复洗涤步骤一次，松开样品模板的螺丝并关闭真空以避免过度干燥。

孔立即去除膜并置于封闭缓冲液中。使用足够的缓冲液完全覆盖膜。在 4 摄氏度下轻轻摇动孵育过夜。

在过夜孵育和封闭缓冲液之后。按照列出的方法清洗膜两次，然后摇动所有洗涤和孵育。确保膜完全被溶液覆盖。

接下来，将膜与抗 HA 的 uni one 通用兔抗体或用于 NA 的通用抗体 HCA dash 2 或 HCA dash 3 在洗涤缓冲液中以 5% 重量比 BSA 稀释一小时，稀释 1 至 4， 000 兔抗血清可为这些抗体提供最佳结果。之后，在室温下洗涤膜 3 次，每次轻轻摇动 15 分钟。然后将膜与 1 至 50， 000 稀释的山羊抗 IgG、IgG 过氧化物酶偶联抗体和封闭缓冲液一起孵育，并在室温下孵育 30 分钟，孵育后轻轻摇动，在室温下洗涤膜和洗涤缓冲液 3 次，每次摇动 15 分钟。

然后用 TBS 清洗膜 5 分钟，轻轻摇动，以去除膜表面残留的 Tween 20 洗涤剂。接下来，使用超级信号 West Dura 延长持续时间底物试剂盒中的每种试剂 3 毫升制备显影底物并混合。将膜放在干纸巾上，轻轻去除多余的 TBS 缓冲液，然后转移到干燥的容器中，涂上底物，在室温下轻轻摇动孵育 5 分钟，然后通过印迹去除多余的底物。

完成后，将膜暴露在化学发光膜下。需要优化曝光时间以避免信号饱和，但通常在 10 秒到 10 分钟之间。按照制造商的说明，使用 flora chem 凝胶成像系统对显影胶片进行密集细胞术分析。

平均每组参考抗原重复的密度值并测试疫苗样品。需要三联试剂盒进行显著性检测和评估实验误差。绘制平均密度值与每个插槽中 HA 或 NA 抗原的量的关系图。

取自标准品。这里显示了一个用于免疫测定的四参数 logistic 模型，该模型使用参考疫苗浓度和密度，使用可变斜率、非线性回归曲线拟合方法从测试样品疫苗的密度中推断样品浓度。Graph PRISM 用于绘制标准曲线并从获得的密度数据中获得浓度，如下所示。

HA 通用抗体 UNI one 对病毒序列表现出显著的特异性，并且能够与 13 种不同流感亚型结合。从病毒感染的胚胎鸡蛋的耳鼻喉噜液中提取的 HA。NP 蛋白是上样对照。

阴性对照是来自未感染鸡蛋的耳鼻喉癌液，阳性对照是来自 N-I-B-S-C 的 H 1 参考标准。在 HA 蛋白迁移率中观察到的差异可能是由于它们的大小和/或加工阶段的变化。如此处所示，针对 NA 的两个保守表位的抗体 HCA dash 2 和 HCA dash 3 能够与 NA 的所有九种亚型结合，并且对 Alan Toic 或细胞蛋白显示出非常小的交叉反应性，P 蛋白对照显示在图 C 中.阳性对照是 Alan Toic 液，加标 R NA 新喀里多尼亚斜线 20 斜线 99 之一，并用相应的antisera NP 蛋白对照显示在底部。

该图显示了与流感疫苗参考标准和疫苗样品中 NA 抗原定量的 HA 相似的代表性结果。密度分析表明，通过狭缝印迹检测不同稀释度的疫苗参考标准品中的 NA 抗原所获得的信号强度与 Na 浓度成正比。在尝试此程序时，重要的是要记住对疫苗样品进行预处理以溶解沉淀物并确保从插槽中正确排出。

还必须注意批次，以防止样品在孔之间泄漏。对于用于检测的任何新抗体，为了获得理想强度的清晰信号，同时最大限度地减少显影后的背景，可能需要优化抗体稀释度和孵育时间。这项技术为流感疫苗研究领域的科学家铺平了道路。

HA 和 NA 抗原的未来进一步定量分析。观看本视频后，您应该对如何在不使用菌株特异性抗体的情况下通过简单的检测来定量流感病毒的重要表面蛋白有很好的了解。