Name: 在培养的中枢神经系统的神经元树突棘形态分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学习利用GFP转染和共聚焦显微镜技术对原代培养皮层神经元进行树突棘形态与运动性分析的方法。该技术结合药理学处理，可精确测量树突棘结构变化，为研究突触可塑性及神经系统疾病提供重要实验手段。

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感谢 Kelly Jones 的细致编辑。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R01MH 071316、阿尔茨海默病协会、国家精神分裂症与抑郁症研究联盟（NARSAD）、国家自闭症研究联盟（NAAR）（P.P.）；美国心脏协会博士后奖学金（D.P.S.）；美国心脏协会博士前奖学金（K.M.W.）提供支持。

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336, 185-186 (1988).</li>
<li>Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kalirin-7+controls+activity-dependent+structural+and+functional+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines.</a> Neuron. 56, 640-656 (2007).</li>
<li>Spear, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+adolescent+development+and+alcohol+use+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Res+Health%22%5BJournal%5D)">Modeling adolescent development and alcohol use in animals.</a> Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).</li>
<li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+ss+activity+modulates+synaptic+signaling+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure.</a> J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).</li>
<li>Srivastava, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enhancement+of+two-step+wiring+plasticity+by+estrogen+and+NMDA+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).</li>
<li>Woolfrey, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epac2+induces+synapse+remodeling+and+depression+and+its+disease-associated+forms+alter+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines.</a> Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-specific+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+composition+by+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity.</a> J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).</li>
<li>Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+spine+structural+plasticity+is+regulated+by+small+GTPase+Rap1+and+its+target+AF-6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6.</a> Neuron. 48, 605-618 (2005).</li>
<li>Jones, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modulation+of+spine+morphology+by+the+5-HT2A+serotonin+receptor+through+kalirin-7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).</li>
<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2, 910-919 (2005).</li>
<li>Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+spines+and+dendrites+distribute+dye+evenly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Do spines and dendrites distribute dye evenly.</a> Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).</li>
</ol>

本作品的制作得到了 MetaMorph（Molecular Devices, Inc.）的支持。

上述技术针对固定或活体原代皮质神经元中的树突棘形态、线性密度及动态性的详细定量分析，旨在深入理解可能参与神经病理过程的突触后机制。类似方法也可用于定量分析任何多棘神经元中的树突棘形态或动态性，包括海马锥体神经元、浦肯野细胞以及中等多棘神经元。
本文所述方案可适用于研究突触蛋白的基本特性，以及药物处理对树突棘的影响。此外，该方案还可用于评估内源性突触蛋白定位的变化，范围涵盖从支架蛋白到谷氨酸受体的各类蛋白。同时，该方法不仅能够对固定后的树突棘进行详细的形态计量学分析，还能测量突触蛋白或药物处理对树突棘运动性的影响。这些时间推移成像技术还可进一步改进，用于研究蛋白质的转运过程，且可选择性地同时观察树突棘的形态变化。
对树突棘形态和运动性的详细分析是研究突变型突触蛋白潜在影响的重要工具，有助于了解这些与疾病相关的突触蛋白发生突变后如何影响突触的结构与功能，从而揭示多种脑部疾病的病理生理机制。

<table><tbody><tr><td>18 mm 圆形盖玻片，1.5 号</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0714 (CS-18R15)</td><td></td></tr><tr><td>22 mm 方形盖玻片，1.5 号</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0721 (CS-22S15)</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0899</td><td>分子量 70~150 Kda</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>21051024</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>D,L-APV (AP-5)</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-004</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-060-C 1</td><td>1M，pH 7</td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>EMD Millipore</td><td>FX0415-5</td><td>36%，组织学级</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>VWR international</td><td>100188-514</td><td>Jackson Immunoresearch Labs</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC21568-2500</td><td>Acros Organics</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L)，高度交叉吸附</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG (H+L)，*高度交叉吸附*</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td>特殊包装</td></tr><tr><td>封闭式成像载台腔室</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-30HV</td><td></td></tr><tr><td>温度控制单元</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

培养的中枢神经系统神经元中树突棘形态的分析

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

树突棘是大脑中大多数兴奋性连接的发生部位，并构成突触的突触后区室。这些结构富含肌动蛋白，且已被证明具有高度动态性。在经典的赫布可塑性以及神经调节信号的作用下，树突棘可发生形态和数量的改变，这被认为对神经环路的精细化以及大脑中信息的处理与存储至关重要。在树突棘内部，一个复杂的蛋白质网络将细胞外信号与肌动蛋白细胞骨架相连，从而调控树突棘的形态和数量。神经病理学研究显示，多种疾病状态，从精神分裂症到自闭症谱系障碍，均表现出树突棘形态或数量的异常。此外，近期的遗传学研究已鉴定出多个编码突触蛋白的基因突变，提示这些蛋白可能参与异常的树突棘可塑性，从而部分地构成了这些疾病的病理生理基础。为了研究这些蛋白在调控树突棘形态/数量中的潜在作用，培养皮层神经元具有多项优势。首先，该系统可用于对固定细胞中的树突棘进行高分辨率成像，也可对活细胞进行时间序列成像。其次，这种体外系统可通过表达突变蛋白、利用shRNA载体进行基因敲降，或施加药理学处理，从而便捷地调控蛋白功能。这些技术手段使研究人员得以初步解析疾病相关蛋白的作用，并预测这些蛋白的突变可能产生的功能影响。

关键词：树突棘，突触，肌动蛋白细胞骨架，可塑性，皮层神经元，神经发育障碍，突触蛋白，基因突变，体外培养，时间序列成像 体内.

最近的多项研究已发现与脑部病理相关的突触蛋白存在突变。原代培养的皮层神经元为研究这些致病相关蛋白对树突棘形态和运动性的影响提供了极大的灵活性。

树突棘是大脑中大多数兴奋性连接的位点，构成突触的突触后区室。这些……

本实验的总体目标是评估各种分子和药物学操作对树突棘形态和运动性的影响。通过用GFP转染原代培养的皮层神经元，单独或联合外源表达DNA质粒，以标记神经元形态并调控内源性蛋白质的表达与功能，从而实现上述目的。在第二步中，可对细胞进行药物处理，随后固定用于免疫染色，或准备进行活细胞时间序列成像。然后进行药理学处理，以实现树突棘的可视化，并观察树突棘形态和运动性所发生的变化。接下来，使用共聚焦显微镜获取固定细胞的Z系列图像或活细胞在特定时间点的图像。可通过Z系列图像的二维投影进行树突棘形态的详细测量。实验结果展示了基于树突棘形态或运动的定量形态学分析，分子或药物干预对树突棘形态或运动性的影响。该方法有助于回答神经科学领域的关键问题，例如：突触可塑性是如何被调控的？兴奋性突触是如何发育形成的？突触是如何维持或被消除的？神经递质或基因等分子如何调控突触结构？尽管该方法可揭示突触调控背后的基本机制，也可用于研究与疾病相关的基因在改变突触结构中的作用，而突触结构的改变是自闭症、精神分裂症或阿尔茨海默病等多种精神疾病和神经系统疾病的重要特征。首先，通过用 10 毫摩尔无菌 hippies 平衡 DMEM 的 pH 值来制备 H-D-M-E-M，并将其升温至 37 摄氏度。接着，将带有细胞的 18 毫米盖玻片转移至 600 微升已预热至 37 摄氏度、不含抗生素的培养基中。将细胞在37摄氏度下孵育，并补充5%二氧化碳，孵育30分钟。对于每张盖玻片，将指定量的DNA加入50微升H-D-M-E-M中，静置5分钟。然后将4微升lipo 2000加入另外50微升H-D-M-E-M中，同样静置5分钟。将两个试管中的溶液充分混匀，置于37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育至少20分钟。随后，将混合液逐滴加入细胞中。在相同条件下继续孵育细胞4小时，将先前配制的300微升培养液与400微升37°C的溶液混合。新鲜的培养液。然后将带有细胞的盖玻片转移至含有旧培养液和新鲜培养液的培养基中。继续表达质粒 2 到 3 天。用200微摩尔的D-L-A-P-V配制CSF，将其升温至37摄氏度。随后，将盖玻片在900微升预热的CSF中预孵育30至60分钟。用人工脑脊液稀释储备液，将药理学试剂配制成10倍工作浓度。轻柔地将试剂加入细胞中，终体积为1000微升，终浓度为1倍试剂。在室温下，用800微升含4%甲醛和4%蔗糖的磷酸盐缓冲液固定神经元，孵育10分钟。用 PBS 清洗两次，在处理甲醛废液时需谨慎。然后在冰浴中用 800 微升预冷的甲醇于 4 摄氏度固定神经元 10 分钟。每次用 800 微升 PBS 清洗盖玻片，共清洗两次，每次 10 分钟。接下来，在含有2%正常山羊血清和800微升0.1% Triton X-100的PBS中，于室温下同时对通透化的眼组织和细胞封闭1小时。随后，向含有2%正常山羊血

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科研

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Neuroscience

神经科学

在培养的中枢神经系统的神经元树突棘形态分析

来源： Pekarek, B. T., et. al., 通过CLARITY组织透明化技术对完整神经元树突进行成像与定量分析。J. Vis. Exp.

完整小鼠脑组织中树突分支及树突棘形态的共聚焦显微成像

来源：Gouder, 等. 来自人诱导性多能干细胞的锥体神经元树突棘的三维定量分析。J. Vis. Exp.

使用共聚焦显微镜成像定量树突棘

本文介绍了一种用于成像海马神经元树突棘的工作方案 体外...

使用结构光照明显微镜成像大鼠原代海马神经元的树突棘

我们介绍了两种用于可视化和定量分析小鼠模型海马中树突分支的方法：实时成像和扩展景深成像。前者可实现复杂的拓扑追踪，并对分支程度进行定量分析，后者则能够快速可视化树突树结构。...

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我们提出了一种标记和分析锥体神经元的方案，这对于评估可能介导神经化学和行为异常的神经元及树突棘形态学改变至关重要。...

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树突棘是大多数兴奋性突触的突触后区室。在神经发育、衰老、学习过程以及许多神经和精神疾病中，树突棘形态会发生改变，这凸显了可靠分析树突棘的重要性。本方案描述了如何使用自动三维神经元重建软件，准确且可重复地量化树突棘形态。...

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