Name: 全山原位杂交E8.5，E11.5小鼠胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: 学习全山原位杂交技术用于小鼠胚胎基因表达研究，适用于E8.5至E11.5天胚胎。该方法通过特异性核糖探针设计和免疫组化检测，帮助发育生物学研究者精确定义基因表达模式。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R21MH082360（BGC）和 R01HD056315（NRM），以及佐治亚大学提供支持。

<ol><li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues%3A+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li>
<li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li>
<li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pax%5Bzf-a%5D%3A+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis%2FTWis+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li>
<li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li>
<li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li>
<li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo%3A+gene+expression+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li>
<li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis%2C+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本实验方案中所述方法借鉴了多种不同来源的技术，并针对E8.5至E11.5天龄的小鼠胚胎整体标本进行了优化。in situ杂交技术用于脊椎动物胚胎的整体标本检测，最早于20世纪90年代初期出现2,5-12。本方案主要借鉴了非洲爪蟾（Xenopus）胚胎7,8以及小鼠胚胎2,11的相关方法。在本方案中，特别强调对探针进行严格的质量评估。根据本方案的初始步骤，仔细制备高质量、高特异性活性的RNA探针，将显著提高实验数据的质量，并从长远来看节省大量时间和精力。本方案还包括使用PCR扩增生成的DNA模板，用于噬菌体RNA聚合酶的体外转录。该方法快速且具有高度可扩展性，适用于大规模in situ杂交筛选中大量RNA探针的制备13-15。
当背景信号较高而特异性信号较低时，应考虑本方案中的多个步骤。首先需关注探针本身。只要RNA探针符合本方案中规定的设计标准，并通过全部三项质量控制检测（产量、比活性和探针长度），我们从未遇到过高背景的问题。另一个影响背景水平的因素是探针渗透...

<table><tbody><tr><td>地高辛-11-尿苷-5&amp;rsquo;-三磷酸</td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>核糖核苷三磷酸混合物</td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td>11277057001</td><td></td></tr><tr><td>用于放射性标记RNA纯化的快速旋转柱</td><td>耗材</td><td>Roche Group</td><td>11274015001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA聚合酶</td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA聚合酶</td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td>10810274001</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA聚合酶</td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td>11031163001</td><td></td></tr><tr><td>CTP, [&amp;#945;-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 &amp;mu;Ci</td><td>试剂</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008X250UC</td><td></td></tr><tr><td>重组DNase I，无RNase</td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>尿素，无色至白色晶体或结晶性粉末</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP169-500</td><td></td></tr><tr><td>凝胶上样缓冲液</td><td>试剂</td><td>Ambion</td><td>AM8547</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-N+, Amersham</td><td>耗材</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN82B</td><td></td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>设备</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>试剂</td><td>Acros Organics</td><td>41121-0010</td><td></td></tr><tr><td>30% 水溶液过氧化氢</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2633-500</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛，8% 电镜级</td><td>试剂</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0/710</td><td>请按照制造商&amp;rsquo;的说明谨慎使用</td></tr><tr><td>封闭试剂</td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td>11096176001</td><td>配制成5%储存液，于-20&amp;#x00B0;C保存</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td>3115852001</td><td></td></tr><tr><td>RNase A </td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td>10109142001</td><td>配制成10 mg/ml储存液，于-20&amp;#x00B0;C保存。</td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td>10109193001</td><td></td></tr><tr><td>超纯甲酰胺</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15515-026</td><td></td></tr><tr><td>盐酸左旋咪唑</td><td>试剂</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155228</td><td></td></tr><tr><td>来自酿酒酵母的核糖核酸，VI型</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6625</td><td>经多次苯酚/氯仿抽提并沉淀，重悬于DEPC处理的去离子水中，于-20&amp;#x00B0;C保存</td></tr><tr><td>抗地高辛-碱性磷酸酶Fab片段</td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP底物（沉淀型），即用型溶液</td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td>11 442 074 001</td><td></td></tr><tr><td>4 mL透明闭口储存瓶便捷套装</td><td>耗材</td><td>National Scientific Company</td><td>B7800-2</td><td></td></tr><tr><td>Shake N Bake杂交炉</td><td>设备</td><td>Boekel Scientific</td><td>136400</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Sure-Tek活检盒</td><td>耗材 </td><td>Fisher Scientific</td><td>15-200-402C</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus组织包埋介质</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-021-400</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way一次性塑料组织包埋模具</td><td>耗材</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18646A</td><td></td></tr><tr><td>Colorfrost Plus显微镜载玻片</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-17</td><td></td></tr><tr><td>核固红</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>试剂</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8310-16</td><td></td></tr></tbody></table>

整体封片 原位 e8.5 至 e11.5 小鼠胚胎的杂交

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

整体封片 原位 杂交是一种用于确定胚胎中基因表达模式的非常有用的方法。 原位 杂交操作步骤繁琐且技术要求高，多个关键步骤共同影响最终结果的质量。 本方案详细描述了优化探针标记及其性能的若干关键质量控制步骤。 总体而言，我们的实验方案详细描述了为可重复获得高质量结果所必需的关键步骤。首先，我们介绍了通过体外转录生成地高辛（DIG）标记RNA探针的方法。 体外 通过PCR生成的DNA模板的转录。我们描述了三种关键的质量控制检测方法，用于确定地高辛（DIG）标记探针的含量、完整性和特异性活性。这些步骤对于制备出具有足够灵敏度以检测小鼠全胚胎中内源性mRNA的探针至关重要。此外，我们还描述了E8.5至E11.5天龄小鼠胚胎的固定与保存方法。 原位 杂交。随后，我们详细描述了对复水胚胎进行有限的蛋白酶K消化的方法，以及杂交条件、杂交后洗涤和RNase处理的步骤，以去除非特异性探针杂交信号。使用碱性磷酸酶（AP）偶联的抗体对标记的探针进行显色，以显示内源转录本的表达模式。文中展示了成功实验的代表性结果以及典型的非理想实验结果。

此整体样本 原位 杂交实验方案讨论了确保小鼠胚胎（E8.5至E11.5天）基因表达研究获得可重复且高质量结果的关键步骤。

整体封片 原位 E8.5 至 E11.5 小鼠胚胎的杂交

整体原位杂交是定义胚胎基因表达模式的一种非常有效的技术。原位杂交实验步骤……

本实验的总体目标是确定小鼠整体胚胎中的基因表达模式。首先针对目的基因设计并制备特异性的核糖探针，随后收集胚胎并进行杂交处理，从而实现该目标。然后将标记的探针与胚胎进行杂交。最后一步是通过免疫组织化学检测来观察杂交的探针。最终可获得显示整个胚胎或胚胎切片中基因表达模式的结果。使用体视显微镜、解剖显微镜或常规明场显微镜成像后，通常初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为原位杂交实验流程耗时较长且技术要求较高，其中多个关键步骤共同决定了最终结果的质量。首先，使用在5'端带有噬菌体转录启动子序列的基因特异性PCR引物，通过PCR扩增获得目的序列，从而制备模板DNA。随后，按照书面实验方案纯化PCR产物，并加入蛋白酶K消化步骤。然后建立体外转录反应，并在最佳温度下孵育两小时。在DNA模板消化后，使用柱纯化方法纯化核糖探针，通过NanoDrop或微孔板吸收光度计估算探针产量。然后根据估算的产量将探针浓度调整至100纳克每微升。然后，按照书面方案中所述，通过变性丙烯酰胺凝胶电泳检测探针的质量，并测定RIBA探针的比活性。一个合格的探针在凝胶上应呈现单一清晰条带，拖尾现象应尽可能少。为测定比活性，对核糖探针进行系列稀释，获得从10⁻²至10⁻⁵的稀释梯度。随后，取每个稀释度1微升点样于直径为82毫米的高结合N+膜上，同时点样1微升未标记的DNA样本作为对照。点样后立即在紫外交联仪中以125毫焦耳能量进行交联。加入10毫升含1%封闭试剂的1×TN缓冲液，在室温下孵育30分钟，完成封闭。封闭结束后，移除封闭液，并在室温下用10毫升1×TN缓冲液洗涤滤膜15分钟。洗涤完成后，用10毫升1×TN缓冲液配制抗地高辛抗体Fab片段的一比五千稀释液。将膜在此溶液中孵育30分钟。孵育后，用10毫升一倍浓度的TN缓冲液将膜洗涤两次，每次15分钟。最后一次洗涤后，吸去培养皿中的洗涤液，并加入5毫升BM紫色底物溶液。将膜在此溶液中继续孵育30分钟。30 分钟后，检查膜上对应于 10 的负 4 次方稀释度的点位是否有可见信号。如果可见信号出现，用五倍 TE 缓冲液洗涤两次，每次五分钟，以终止显色反应。如果 30 分钟后仍无可见信号，则应弃用该探针。在预冷的PBST中收集小鼠胚胎。然后根据基因型将胚胎分选至含有PBST的4毫升带螺帽的离心管中。除非另有说明，使用含4%PARALDEHYDE的PBST固定胚胎。所有孵育和洗涤步骤均使用溶液填充至小瓶瓶颈的较低位置，体积约为四毫升。固定后，将胚胎在4°C下过夜孵育。用玻璃移液管吸除含4%多聚甲醛的PBST溶液，并替换为PBST。将小管置于冰上孵育五分钟以进行洗涤。重复此步骤，对组织进行第二次洗涤。接着，吸除 PBST，并通过 PBST 中的甲醇梯度逐步将胚胎脱水至 100% 甲醇。注意，移液器吸头应保持在小瓶的对侧，以避免对胚胎造成损伤。如有需要，胚胎可

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全山原位杂交E8.5，E11.5小鼠胚胎

本视频展示了双色整体原位杂交技术，该方法可用于在年轻的鸡胚中可视化两种不同基因的空间和时间表达模式。该方法最初由 David Wilkinson、Domingos Henrique、Phil Ingham 和 David Ish-Horowicz...

早期鸡胚双重整体原位杂交

我们展示了一种染色质免疫沉淀（ChIP）方法，用于鉴定小鼠胚胎组织中组织特异性基因表达启动期间或之后，组织特异性基因上的因子相互作用。该方案在正常胚胎发育过程中研究组织特异性基因激活时具有广泛的适用性。...

利用小鼠早期胚胎对组织特异性基因进行染色质免疫沉淀实验

在此，我们开发了所需的工具 离体...

ex vivo 活体成像小鼠神经上皮中的单细胞分裂

本文介绍了一种优化的实验方案，用于对胎鼠进行基因分型、染色及样本制备，以实现对整个动物体内周围伤害性感受器轴突投射的成像，从而有效评估遗传工程小鼠发育过程中感觉轴突生长的表型特征。...

小鼠胚胎感觉轴突投射的全组织成像

我们展示了一种将培养细胞移植至早期小鼠胚胎特定部位的方法，以确定其 体内...

精确局部转移细胞或DNA至早期着床后小鼠胚胎的方法

我们介绍了一种利用高分辨率显影显微镜获取小鼠胚胎三维（3D）图像的详细方案。该改进方案采用改良的组织制备方法，以增强荧光染料的渗透性，从而允许对大小不同的样本进行形态计量分析。...

快速获取三维图像的高分辨率表面荧光显微技术

脊索中胚层节点和脊索板是发育中的小鼠胚胎中存在的短暂信号调控中心，可通过多种技术进行观察。本文详细描述了用于研究其结构和形态发生过程的两种技术：1）扫描电子显微镜（SEM）；2）整体免疫荧光染色（WMIF）。...

利用扫描电子显微镜和整体免疫荧光技术在原肠形成期小鼠胚胎中观察脊索中胚层与脊索板

我们介绍了利用从心室特异性MLC-2v-tdTomato报告基因敲入小鼠中分离出的胚胎，通过整体封片表层荧光显微镜观察小鼠心脏发育的实验方案。该方法使我们能够直接可视化小鼠心脏发育过程中心室形成的各个阶段，而无需繁琐的组织化学方法。...

利用整体胚胎落射荧光技术分析小鼠胚胎发生过程中的心脏腔室发育

传统上，小鼠胚胎瓣膜原基的内皮细胞层通常通过横断面、冠状面或矢状面切片进行分析。我们提出了一种新的方法，可在瓣膜形成区域对内皮细胞层进行en...

En Face 小鼠胚胎心内膜垫平面形态发生分析的制备

本文建立了一种用于制备受精后小鼠胚胎单细胞和细胞核高质量悬液的流程，以进行单细胞和单细胞核测序。...

从上胚层到原肠胚形成结束：突变小鼠全胚胎的单细胞RNA测序

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