Name: 染色质免疫沉淀从以下轴索损伤的背根神经节组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学习从轴索损伤后的背根神经节组织中分离蛋白-DNA复合物的染色质免疫沉淀方法。该技术可识别转录因子结合位点及表观遗传修饰，为研究周围神经和中枢神经系统的轴突再生机制提供重要工具。

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我们感谢Andrea Tedeschi在实验室建立初始ChIP实验过程中提供的帮助，以及Ricco Lindner在优化ChIP实验条件方面的贡献。本研究得到了赫蒂基金会（Hertie Foundation）、蒂宾根大学福琼基金（Fortune Grant）以及德国研究基金会（DFG DI 1497/1-1）项目的资助（以上项目均授予Simone Di Giovanni）。

1. 坐骨神经与背柱神经损伤
<ol>
 <li>将动物置于手术巾上，其下方全程放置恒温垫，以维持小鼠体温在37°C。所有动物均通过持续吸入异氟烷/O2进行手术麻醉。手术器械在使用前均经高压灭菌处理。</li>
 <li>进行坐骨神经损伤操作时，需仔细剃除双侧后肢的毛发，并使用普通脱毛剂完成脱毛，随后用酒精清洁皮肤，再用碘伏溶液消毒3次。</li>
 <li>通过在股骨中段后侧平行于股骨方向做4 mm的皮肤切口，并用精细镊子分离股二头肌的肌肉组织，从而暴露坐骨神经。</li>
 <li>暴露的坐骨神经随后被损伤，皮肤则用两个缝合夹闭合。</li>
</ol>
注意：采用相同的切口暴露坐骨神经，但缝合伤口以保持神经完整，用于假手术损伤对照。
<ol start="5">
 <li>对于背柱损伤，需小心剃除小鼠背部的毛发，并使用普通脱毛剂完成脱毛，然后用酒精喷雾/擦拭清洁皮肤。</li>
 <li>通过从约T7至T13处做一条2.5 cm的切口暴露脊髓。将皮肤分开，沿T9至T11椎骨去除结缔组织。</li>
 <li>在T10水平进行椎板切除术</li>
</ol>
注意：在大多数实验中，椎板切除术被视为假手术损伤。
<ol start="8">
 <li>向组织中加入几滴利多卡因（Xylocain），以麻醉脊髓，同时小心去除硬脊膜，注意不要触碰脊髓。</li>
 <li>损伤背柱后，缝合肌肉，再次注意避免接触脊髓。最后使用缝合夹将皮肤闭合。应给予布托啡诺（Buprenorphine）（0.1 mg/kg 体重），每日两次，持续48小时，或直至不再需要为止。</li>
</ol>
2. 交联
<ol>
 <li>处死小鼠后，解剖取出L4和L5节段的背根神经节（DRG）。将总共16个DRG收集至冰上预冷的HBSS缓冲液中，并加入蛋白酶抑制剂混合物（每只动物取2个损伤侧DRG和2个假手术侧DRG，共4只动物）。</li>
 <li>短暂离心DRG样本，小心吸除HBSS，加入500 μl含蛋白酶抑制剂混合物的1%多聚甲醛PBS溶液，于37°C孵育30分钟。</li>
</ol>
关键步骤。 使用新鲜的分子生物学级甲醛。
<ol start="3">
 <li>加入 125 mM 甘氨酸以终止固定，室温孵育 5 分钟。</li>
 <li>短暂离心，吸除缓冲液，用 500 μl 冰冷的 PBS + 蛋白酶抑制剂混合液洗涤组织两次。</li>
</ol>
3. 细胞核制备与染色质剪切
<ol>
 <li>吸去 PBS，加入 400 μl SDS 裂解缓冲液，转移至预冷的微量离心管中，用微型研杵进行约 30 次研磨以破碎组织。</li>
</ol>
关键步骤。 组织的裂解和破碎对于获得高产量的交联染色质至关重要。
<ol start="2">
 <li>使用超声波处理样品，70% 输出功率下进行 8 次脉冲，每次 10 秒（Bandelin, Sonoplus GM70）。</li>
</ol>
注意。 染色质的剪切需根据您特定的超声破碎条件进行优化，在进行实际的免疫沉淀实验之前，应先检测染色质是否已得到适当的片段化（参见第3节）。
注意。 染色质的片段化也可通过微球菌核酸酶（MNase）消化实现。一般而言，超声处理更适合固定组织的染色质片段化，而MNase消化则更适用于天然组织的染色质免疫沉淀。交联并剪切的染色质可在-80°C下保存长达2个月，但应避免反复冻融。
4. 染色质消化分析（推荐）
<ol>
 <li>取10 μl剪切后的染色质样品用于分析。向样品中加入200 mM NaCl，并在65°C下孵育2小时以逆转交联。</li>
 <li>纯化DNA（见第8节），并进行1%琼脂糖凝胶电泳。DNA应被片段化至约200-1000 bp的长度（图1）。</li>
</ol>
注意。 染色质过度片段化可能导致信号减弱，而片段化不完全则会导致分辨率降低和背景信号升高。
5. 免疫沉淀
<ol>
 <li>确定免疫沉淀反应的数量（见下文注意事项），并将样品等分至新的离心管中。每管用 ChIP 缓冲液加蛋白酶抑制剂混合物补足至 500 μl。</li>
 <li>取 5 μl 稀释后的样品转移至新管中。此为 1% 输入样品，将其储存于 -20°C，待后续使用（第 7 节）。</li>
 <li>针对每个免疫沉淀反应，加入相应的抗体或正常 IgG 对照，并于 4°C 条件下旋转孵育过夜。</li>
</ol>
注意。 在确定免疫沉淀反应数量时，应设置阳性对照（例如组蛋白 H3 抗体）和阴性对照（正常 IgG）。每次免疫沉淀所用抗体的用量因抗体而异，需通过实验确定。但通常用量范围为 2-10 µg/次免疫沉淀。
<ol start="4">
 <li>为了免疫沉淀您的抗体/蛋白质/DNA复合物，加入30 μl ChIP级Protein G磁珠，在4°C下旋转孵育2小时。</li>
</ol>
6. 清洗
<ol>
 <li>为沉淀结合染色质的磁珠复合物，将离心管置于磁力架上。待溶液变澄清后，小心移除上清液。</li>
 <li>向磁珠中加入 1 ml 低盐洗涤缓冲液（ChIP 缓冲液），在 4°C 下旋转孵育 3–5 分钟，然后按步骤 6.1 操作沉淀磁珠并吸除洗涤液。重复此步骤，共洗涤 3 次。</li>
 <li>向磁珠中加入 1 ml 高盐洗涤缓冲液（ChIP 缓冲液 + 350 mM NaCl），旋转孵育 3–5 分钟，然后按步骤 6.1 操作沉淀磁珠并吸除洗涤液。</li>
</ol>
7. 洗脱与交联的逆转
<ol>
 <li>从 -20°C 取出您的输入样品，加入 150 μl ChIP 洗脱缓冲液，并在室温下放置至第 7.5 步。</li>
 <li>为第 6.3 步中的每个免疫沉淀样品加入 150 μl 1x ChIP 洗脱缓冲液。</li>
 <li>将离心管放入恒温混匀仪中，于 65°C 孵育 30 分钟并轻柔涡旋，以使染色质从磁珠上洗脱。</li>
 <li>将磁珠置于磁力架上，小心地将洗脱的染色质（上清液）转移至新的离心管中。</li>
 <li>向所有离心管（包括您的输入样品）中加入 200 mM NaCl 和每反应 40 μg 蛋白酶 K，并在 65°C 孵育 2 小时。</li>
</ol>
注意。 洗脱步骤也可在室温下进行，但效率可能较低。
8. DNA 回收
<ol>
 <li>向第7.5步的样品中加入1体积的苯酚/氯仿，涡旋振荡30秒。</li>
 <li>在室温下，以微量离心机最高速度离心5分钟。</li>
 <li>小心转移水相（上层）至新的离心管中，向水相中加入1体积氯仿，涡旋振荡30秒。</li>
 <li>在室温下，以微量离心机最高速度离心5分钟。</li>
 <li>小心转移水相（上层）至新的离心管中，然后加入300 mM NaOAc、每反应20 μg的糖原以及2.5体积的预冷100%乙醇。</li>
</ol>
注意。 需添加载体（如糖原）以增强相对较小的DNA片段的沉淀。
<ol start="6">
 <li>在 -80°C 下孵育 2 小时以沉淀 DNA。</li>
</ol>
注意。 沉淀步骤也可在 -20°C 下过夜进行。
<ol start="7">
 <li>将样品在4°C下以微量离心机最高速度离心20分钟。</li>
 <li>小心去除上清液，并用300 μl预冷的70%乙醇洗涤沉淀的DNA沉淀物。</li>
 <li>将样品在4°C下以微量离心机最高速度离心10分钟。</li>
 <li>尽可能小心地移除上清液，并让沉淀物在空气中干燥。</li>
 <li>用20 μl无菌H2O重悬DNA。样品现可用于PCR，或可于-20°C保存。</li>
</ol>
9. 代表性结果
坐骨神经损伤后背根神经节（DRGs）中染色质免疫沉淀（ChIP）实验的代表性结果如图1和图2所示。首先，我们展示了DNA被片段化至约200-1000 bp的长度（图1）。其次，仅在坐骨神经损伤后，从生长相关蛋白-43（GAP-43）近端启动子区域的ChIP产物中检测到PCR信号（图2，5'，第4泳道）。当动物仅接受假手术损伤时（第3泳道），或使用正常IgG血清进行免疫沉淀（IP）时（第5和第6泳道），均未检测到PCR信号。为验证抗体的特异性，我们使用同一DNA样本，但采用一组对照引物，该引物扩增目标基因3'-非翻译区（3'-UTR）的一个区域，该区域预期无蛋白结合。除作为标准PCR对照的输入样本（input，代表未进行IP的DNA样本，图2第1-2泳道）外，所有泳道均未出现PCR信号（图2，3'，第3-6泳道）。如示意图（图3）所示，该ChIP实验流程可用于坐骨神经损伤或脊髓背柱损伤后的样本分析。
<img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig1.jpg" alt="电泳、DNA片段、凝胶图谱、ladder标记物、超声处理后的DNA分离、大小分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 经超声处理将DNA剪切至合适片段长度范围后，进行逆转交联的琼脂糖凝胶电泳结果。
<img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig2.jpg" alt="染色质免疫沉淀结果；5'-近端，3'-非翻译区；DNA-蛋白质相互作用分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 坐骨神经损伤后背根神经节（DRG）组织的半定量PCR结果，显示乙酰化p53在神经损伤后48小时结合于GAP-43近端启动子区域。来自相同DRG组织的对照PCR显示，乙酰化p53不结合于GAP-43基因3’-非翻译区（UTR）的对照DNA区域（S = 假手术组，I = 损伤组）。
<img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig3.jpg" alt="脊髓横切面示意图，显示神经损伤研究中背柱的损伤部位。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 示坐骨神经和背柱上损伤部位位置的通用示意图。

<ol><li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li>
<li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarey%2C+MF+%22Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%22">Chromatin immunoprecipitation (ChIP)</a>. , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).</li>
<li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+%28%26mu%3BChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li>
<li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Makwana, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+J%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li>
<li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+p53-CBP%2Fp300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression%2C+axon+outgrowth%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li>
<li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本方案提供了一种方法，用于直接探究成年神经系统在轴突损伤后轴突再生过程中的染色质环境。该方法结合背根神经节（DRG）损伤模型与染色质免疫沉淀技术，以研究周围神经系统（PNS）或中枢神经系统（CNS）损伤后的转录及表观遗传环境。该方案特别适用于希望表征其感兴趣的转录因子潜在结合位点，并确定这些位点的占据是否在损伤后发生的科研人员。同时，也可对这些位点处组蛋白和DNA的表观遗传修饰进行同步监测。类似方案亦可用于面神经损伤后实验，其中可从脑干分离面神经核，并按我们先前报道的方法进行染色质免疫沉淀分析（Tedeschi et al., 2009）。
与典型的染色质免疫沉淀实验类似，本方案中的两个关键步骤是：（1）DNA-蛋白质复合物的有效片段化和溶解；（2）针对目标蛋白的优质免疫沉淀抗体的可获得性。可能影响这两个步骤的一个限制因素是起始材料量过少。与其他组织（如脑或脊髓）相比，背根神经节（DRG）所能提供的组织量相对较少。此外，DRG 包含多种类型的神经元以及胶质细胞，这些细胞可能具有不同的染色质环境，从而可能导致免疫沉淀信号的异质性；然而，这种局限性在大多数来自神经系统...

<table><tbody><tr><td>10x ChIP 缓冲液</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7008</td><td></td></tr><tr><td>2x ChIP 洗脱缓冲液</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7009</td><td></td></tr><tr><td>ChIP 级 Protein G 磁珠</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9006</td><td></td></tr><tr><td>Magna Grip 架（8 孔）</td><td>EMD Millipore</td><td>20-400</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>UN 1888</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>CP10.1</td><td></td></tr><tr><td>10x 甘氨酸溶液</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7005</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14185</td><td></td></tr><tr><td>组蛋白 H3 抗体（兔源）</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2650</td><td></td></tr><tr><td>正常兔 IgG</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2729</td><td></td></tr><tr><td>苯酚/氯仿/异戊醇</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche Group</td><td>04 693 116 001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K（20 mg/ml）</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>10012</td><td></td></tr><tr><td>SDS 裂解缓冲液</td><td>Upstate, Millipore</td><td>20-163</td><td></td></tr></tbody></table>

脊髓背根神经节组织在轴突损伤后的染色质免疫沉淀

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

中枢神经系统（CNS）中的轴突在损伤后无法再生，而外周神经系统（PNS）中的轴突则能在一定程度上再生（Teng et al., 2006）。目前已认识到，在PNS中，损伤后会重新激活对神经突和轴突生长至关重要的转录程序（Makwana et al., 2005）。然而，可用于在活体（in vivo）条件下分析神经元基因调控的工具仍然有限，且常常具有挑战性。
背根神经节（DRG）是一种优良的损伤模型系统，因为中枢神经系统（CNS）和外周神经系统（PNS）均由起源于同一胞体的分叉轴突所支配。神经节代表了一组离散的细胞体集合，所有转录事件均在此发生，因此提供了一个明确定义的转录活性区域，可从动物体内简便且可重复地分离获取。在外周神经系统（如坐骨神经）中，神经纤维损伤后能够发生轴突再生，这应会揭示出一组与中枢神经系统（如脊髓）中类似损伤所引发的不同的转录程序，因为在中枢神经系统中再生无法发生。通过染色质免疫沉淀（ChIP）技术，可以鉴定在PNS或CNS损伤后转录因子结合位点以及组蛋白和DNA发生的修饰变化。
本文介绍了一种利用轴突损伤后固定的小鼠背根神经节（DRG）组织进行染色质免疫沉淀（ChIP）的实验方案。这一强有力的方法组合为表征促进轴突再生所必需的促再生染色质环境提供了有效手段。

我们介绍了一种在轴突损伤后从背根神经节组织中进行染色质免疫沉淀的方法。该方法可用于鉴定特定转录因子的结合位点以及组蛋白和DNA的表观遗传修饰，这些修饰对于周围和中枢神经系统中受损轴突的再生具有重要意义。

中枢神经系统（CNS）中的轴突无法再生，而外周神经系统（PNS）中的轴突在损伤后具有有限的再生能力。

本实验的总体目标是在神经损伤后，从背根神经节组织中免疫沉淀交联的蛋白质-DNA复合物。该过程首先诱导坐骨神经或背柱损伤，第二步是对样本进行交联并溶解蛋白质-DNA复合物。该实验步骤的第三步是免疫沉淀特定的蛋白质-DNA 复合物。最后，纯化并回收 DNA。最终可获得结果，显示与某种蛋白质或 DNA 组蛋白修饰相关的 DNA 片段富集情况。该方法有助于回答轴突再生领域中的关键问题，例如哪些DNA结合位点、转录因子和组蛋白修饰对于调控促进轴突再生的重要基因是必需的。首先，将麻醉后的动物置于手术台上。通过鼻罩持续给予异氟烷氧气以维持手术过程中的麻醉状态，然后继续操作。通过趾捏反射确认坐骨神经损伤实验中麻醉深度是否合适。仔细剃除后肢部位的毛发，并使用脱毛剂清除残留的毛发。毛发去除后，先用酒精反复擦拭皮肤，再使用聚维酮碘进行皮肤消毒。在股骨后方平行位置的皮肤上做一个4毫米的切口。在大腿中段，使用精细镊子将肌肉分开，暴露下方白色的坐骨神经。神经暴露后，可保持完整不切断，作为假手术对照；也可将其切断以诱导损伤。最后，将皮肤拉拢，使用两个缝合夹闭合，以处理背柱损伤。去除背部的毛发，并按之前所示清洁切口部位。在脊髓上方约 T7 至 T13 处做一个 2.5 厘米的切口。使用精细镊子夹住皮肤，同时分离脂肪组织。接着，用两个钩子固定浅层脂肪。待脂肪组织被拉开后，在第六和第七椎骨之间的间隙中找到血管，作为定位参考点。在第八和第十节椎骨处双侧切开肌肉，并插入两个钩子以保持切口开放。使用小剪刀，在T8至T10节段沿棘突小心清除椎板上的肌肉组织。通过切断T10两侧的连接骨质，进行椎板切除术。小心地将椎骨的上半部分移开，以暴露下方的脊髓。滴加几滴2%利多卡因以麻醉脊髓，然后去除硬脊膜，注意不要触碰脊髓。在此步骤停止可提供假手术对照，以损伤背柱。在脊髓上做一深度为 0.3 至 0.4 毫米的横切口。最后，缝合肌肉并松开浅层脂肪。将皮肤拉拢并用缝合夹闭合。将动物放回饲养笼中，并监测直至完全恢复。损伤后48小时，处死动物并采集腰段四（L4）和腰段五（L5）背根神经节或DRG。第一步是暴露腹侧脊柱。接下来，去除第12胸椎（T12）至第6腰椎（L6）的椎体腹侧半部分。为了暴露脊髓，需识别位于脊髓侧方椎体间隙中的背根神经节（DRGs）。使用精细镊子夹住 L4 和 L5 节段的背根神经节并轻轻提起，尽可能靠近背根神经节本体进行切断。从四只动物共收集 16 个背根神经节，并置于冰上预冷的 HBSS 中。短暂离心DRG，加入500 µL 1%甲醛，在37°C下孵育样品30分钟。加入125 mM甘氨酸以终止固定，在室温下孵育5分钟。短暂离心后吸去缓冲液，用500 µL预冷的含蛋白酶抑制剂混合物的PBS洗涤组织两次。接下来，吸除 PBS，加入 400 微升 SDS 裂解缓冲液，用微型研杵研磨约 30 次以破碎组织。然后以 70% 输出功率进行 8 次、每次 10 秒的超声处理来剪切染色质。建议分析一个样品，以确认 DNA 已被片段化为长度约 200 至 1000 个碱基对的片段。将剪切后的染色质样品等分至新的离心管中。针对每个要进行的免疫沉淀反应，用含有蛋白酶抑制剂混合物的ChIP缓冲液将每管体积补至500微升。接下来，取5微升稀释后的样品转移至新的离心管中。这是您的1%输入样品，将在-20°C保存，直至后续使用。随后，向每根试管中加入抗体或正常IgG对照，并在4°C条件下旋转孵育过夜。第二天。加入30微升蛋白G磁珠，4°C旋转孵育两小时，免疫沉淀该复合物。随后将离心管置于磁力架上，使结合了染色质的磁珠复合物沉降。待溶液澄清后，小心移除上清液，再用1毫升低盐缓冲液洗涤磁珠三次，每次洗涤均在4°C旋转孵育3至5分钟。随后用一毫升高盐缓冲液洗涤一次。此时，取出保存在负20摄氏度的1%输入样本，加入150微升染色质免疫沉淀洗脱缓冲液。将离心管置于室温下暂存，以备后续使用。回到IP样品，向每管中加入150微升1×芯片洗脱缓冲液。在65摄氏度下孵育样品30分钟，并轻轻涡旋震荡，以从磁珠上洗脱染色质。将磁珠置于磁力架上沉降后，小心地将洗脱的染色质转移至新的离心管中，包括输入样品管。加入200毫摩尔的氯化钠和每反应40微克的蛋白酶K，65摄氏度孵育两小时。孵育结束后，采用标准方法回收DNA用于进一步分析。此处显示的是坐骨神经损伤后背根神经节组织的半定量PCR结果。泳道一和泳道二显示输入样品的PCR信号。第四泳道的PCR信号表明，乙酰化P53仅在坐骨神经损伤后才会结合到gap 43基因近端启动子区域。当动物接受假手术损伤（如第三泳道所示）或使用正常IgG血清（第五和第六泳道所示）时，未检测到PCR信号。来自相同DRG组织的对照PCR显示，乙酰化P53不会结合到位于gap 43基因三端非翻译区的DNA对照区域。在进行该实验操作时，需牢记三个关键步骤以确保成功：起始组织量要充足，确保DNA-蛋白质复合物的有效剪切与溶解，并为您的目标蛋白选择一种性能优良的免疫沉淀抗体。

chromatin-immunoprecipitation-from-dorsal-root-ganglia-tissue

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

染色质免疫沉淀从以下轴索损伤的背根神经节组织

我们展示了一种从成年大鼠坐骨神经中分离轴浆的方案，该方法基于神经束的解剖以及在低渗培养基中孵育，以释放髓鞘并裂解非轴突结构，随后提取剩余的富含轴突的物质。...

大鼠坐骨神经轴浆的分离

本文描述了一种用于在背根挤压损伤后监测初级感觉轴突的体内成像方案。该方法利用宽场荧光显微镜和thy1-YFP转基因小鼠，可对周围神经系统中长达4...

脊神经后根切断术后背根轴突的活体成像

本文描述了一种利用培养的成年小鼠背根神经节神经元进行轴突再生遗传学研究的体外模型。该方法包括重新悬浮和再接种步骤，以允许经历遗传操作的神经元重新生长轴突。该策略对于利用基于RNA干扰的蛋白敲低技术进行轴突再生的缺失功能研究尤为有用。...

成年背根神经节神经元培养体系中的轴突再生遗传学研究

来源： 李 Q. 等研究哺乳动物轴突再生： 体内 成年小鼠背根神经节的电穿孔 视频实验杂志...

小鼠坐骨神经挤压损伤后的轴突再生

来源：Li, Q. et al. 研究哺乳动物轴突再生：成年小鼠背根神经节的体内电穿孔。 J. Vis. Exp.

电穿孔介导的小鼠背根神经节转染以促进感觉轴突再生

本文描述了一种利用果蝇幼虫腹神经索的损伤模型，用于研究中枢神经系统（CNS）的再生与修复。通过穿刺损伤，结合活体及固定样本的时间序列激光共聚焦显微镜成像，并利用专门开发的软件与遗传学工具进行定量分析，以探究中枢神经系统再生与修复的分子机制。...

一种用于研究中枢神经系统修复的损伤范式 果蝇

本方案介绍了一种在成年大鼠中通过背根神经节（DRG）注射病毒载体并同时造成背根 crush...

背根神经节注射与背根挤压损伤作为感觉轴突再生的研究模型

电穿孔是一种将目的基因有效导入细胞的方法。通过应用该技术 体内 在成年小鼠背根神经节（DRG）神经元上，我们描述了一种用于研究轴突再生的模型 体内.

研究哺乳动物轴突再生：体内电穿孔成年小鼠背根神经节

本文介绍了如何稳定获取高质量的背根神经节冰冻切片的方法。...

小鼠背根神经节冷冻切片操作流程

本方案描述了一种用于模拟轴突损伤后神经元代谢动态的微流控系统，可实现成像、多组学分析以及内在代谢重塑的机制研究。...

用于构建轴突损伤模型并实现多组学分析的微流控芯片

背根神经节（DRG）包含初级感觉神经元的胞体，并将外周感觉信号传递至脊髓。本方案描述了一种适用于小鼠背根神经节的解剖方法，可实现结构完整神经节的标准化分离、解剖节段的准确定位、为初学者提供直观操作指导，并减少操作过程中的组织损伤。...

小鼠背根神经节的解剖与分离

学习从轴索损伤后的背根神经节组织中分离蛋白-DNA复合物的染色质免疫沉淀方法。该技术可识别转录因子结合位点及表观遗传修饰，为研究周围神经和中枢神经系统的轴突再生机制提供重要工具。

脊髓背根神经节组织在轴突损伤后的染色质免疫沉淀

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