染色质免疫沉淀从以下轴索损伤的背根神经节组织

该程序的总体目标是在神经损伤后从背根神经节组织中免疫沉淀交联蛋白 DNA 复合物。这是通过首先诱发坐骨神经或背柱损伤来实现的。第二步是交联样品并溶解蛋白质 DNA 复合物。

该程序的第三步是免疫沉淀特定的蛋白质 DNA 复合物。最后，DNA 被纯化和回收。最终，可以获得显示与蛋白质或 DNA 组蛋白修饰相关的 DNA 片段富集的结果。

这种方法可以帮助回答圆神经再生领域的关键问题，例如调节对促进轴突再生很重要的基因需要哪些 DNA 结合位点、转录因子和组蛋白修饰。首先，将麻醉的动物放在手术台上。在进行手术前通过鼻锥连续施用异氟醚氧气，在整个手术过程中保持麻醉。

用脚趾捏反射确认坐骨神经损伤的正确麻醉深度。小心剃掉后半身，并用脱毛剂去除任何残留的毛发。脱毛后，反复使用酒精清洁皮肤，然后服用 Betadine。

在平行于股骨后方的皮肤上做一个 4 毫米的切口。在大腿中部，用细镊子将肌肉分开，露出下面的白色坐骨神经。一旦分离，神经可以不切开作为假手术控制，也可以切断以诱发损伤。

最后，将皮肤拉在一起并用两个缝合夹闭合，以防止背柱损伤。如前所述，去除背部的毛发并清洁切口部位。在脊髓上方做一个 2.5 厘米的切口，从大约 T 7 到 T 13。

使用细镊子固定皮肤，同时分离脂肪。接下来，用两个钩子固定浅表脂肪。将脂肪拉回后，将血管定位在第六和第七椎骨之间的空间内，用作参考点。

在第 8 和第 10 椎骨上双侧切开肌肉，并插入两个钩子以保持其张开。使用小剪刀清理 T 8 到 T 10 处层压板上的肌肉，保持棘突。在 T 10 通过切割两侧的连接骨进行椎板切除术。

小心地抬起椎骨的上半部分，露出下面的脊髓。滴几滴 2% 赛洛卡因麻醉脊髓，然后去除硬脑膜。注意不要触摸脊髓。

此时停止将提供一种虚假的手术控制来伤害背柱。在脊髓上做一个 0.3 到 0.4 毫米深的切口。最后，缝合肌肉并释放浅表脂肪。

将皮肤拉在一起并用缝合夹闭合。将动物放回家笼中并监测，直到完全恢复。受伤后 48 小时，对动物实施安乐死并收集 L 4 和 L 5 背根神经节或 DRG。

第一步是暴露腹侧脊柱。接下来，从 T 12 到 L 6 去除椎骨的腹侧半部分。要暴露脊髓，请识别位于椎骨与脊髓一侧之间空间的 DRG。

使用细镊子轻轻抓住 L 4 和 L 5 DRG 提升。尽可能靠近 DRG 主体进行切割。从四只动物身上收集总共 16 个 DRG，并将它们放入冰冷的 HBSS 中。

对 DRG 进行短暂离心，加入 500 微升 1% 甲醛，并将样品孵育 30 分钟。在 37 摄氏度下，加入 125 毫摩尔甘氨酸以停止固定，并在室温下孵育 5 分钟。短暂离心后，吸出缓冲液，并用 500 μL 冰冷的 PBS 和蛋白酶抑制剂混合物洗涤组织两次。

接下来，吸出 PBS 并加入 400 微升 SDS 裂解、缓冲，并用大约 30 次微杵敲击破坏组织。然后以 70% 的输出用 8 个 10 秒脉冲对染色质进行超声处理。建议您分析样品，以确认 DNA 片段化为大约 200 至 1000 个碱基对的长度。

将剪切的染色质样品均匀地分装到新管中。对于要进行的每种免疫沉淀反应，使用 ChIP 缓冲液和蛋白酶抑制剂混合物将每管的体积增加到 500 μL。接下来，取出 5 μL 稀释样品并转移到新试管中。

这是您的 1% 起始样品，它将储存在零下 20 摄氏度，直到需要为止。后。向每个试管中加入抗体或正常 IgG 对照，并在 4 摄氏度下旋转孵育过夜。第二天。

Immuno 通过添加 30 μL 蛋白 G 磁珠并在 4 摄氏度下旋转孵育 2 小时来沉淀复合物。接下来，将试管放在磁架上，拉下结合的染色质珠复合物。当溶液澄清后，小心地去除上清液，用 1 毫升低盐缓冲液洗涤珠子 3 次，在 4 摄氏度下孵育 3 到 5 分钟，每次洗涤旋转。

接下来用 1 毫升高盐缓冲液洗涤 1 次。此时，从零下 20 摄氏度中检索 1% 的输入样品，并添加 150 μL 芯片洗脱缓冲液。将试管在室温下放在一边以备后用。

返回 IP 样品，向每个试管中加入 150 μL 的 1 x 芯片洗脱缓冲液。将样品在 65 摄氏度下孵育 30 分钟，轻轻涡旋，以洗脱珠子上的染色质。拉下磁珠架上的磁珠，小心地将洗脱染色质转移到新试管中，以转移到所有试管中，包括输入样品。

每个反应加入 200 毫摩尔氯化钠和 40 微克蛋白酶 K，孵育后在 65 摄氏度下孵育 2 小时，使用标准程序回收 DNA 以便在此处进行进一步分析。显示了坐骨神经病变后 DRG 组织的半定量 PCR 结果。泳道 1 和 2 显示来自输入样品的 PCR 信号。

泳道 4 中的 PCR 信号显示，乙酰化 P 53 仅在坐骨神经损伤后才与 gap 43 近端启动子区域结合。当动物受到泳道 3 所示的假损伤以及泳道 5 和 6 所示的正常 IgG 血清时，不存在 PCR 信号。来自同一 DRG 组织的对照 PCR 显示，乙酰化 P 53 不与位于 gap 43 基因的三引物非翻译区的 DNA 对照区结合。

在尝试此过程时，重要的是要记住成功的三个关键步骤。从足够量的组织开始，确保 DNA 蛋白复合物有效片段化和溶解，并为目标蛋白选择良好的免疫沉淀抗体。