脊髓灰质炎病毒识别粒子凝集法

以下实验方案的总体目标是通过一种简单的方法快速鉴定脊髓灰质炎病毒分离株。在本检测中，我们使用致敏明胶颗粒，其表面包被有嵌合分子，该分子包含与IgG2 Fc段连接的人脊髓灰质炎病毒受体的胞外域。由于这些颗粒对所有血清型的脊髓灰质炎病毒分离株均具有均一的亲和力，因此当与含有人脊髓灰质炎病毒的样本共孵育时，颗粒会发生凝集反应。

然而，如果样本中存在能够识别特定病毒的抗体，则会发生中和反应，并阻止此实验系统中的凝集现象，从而可在单步反应中快速鉴定脊髓灰质炎病毒分离株。与传统的中和试验等现有方法相比，该技术的主要优势在于操作和结果判读的简便性，旨在减少工作量并缩短获得结果所需的时间。为重悬抗PV1、PV2和PV3抗体，需向每支小瓶中加入0.5毫升水。

然后将每种抗体溶液分别转移至含有 4.5 毫升维持培养基的独立试管中。某些批次的抗 PV 抗体以重悬形式提供，对于这些批次的抗 PV 抗体，无需添加水进行重悬。

接下来，在新的标记管中制备总体积为3.6毫升的抗体混合溶液，各抗体按1:1比例混合。例如，将1.8毫升抗PV一型抗体与1.8毫升抗PV二型抗体混合。为制备抗PV一型加PV二型的组合抗体，需对所有可能的两两组合重复此操作；同时，通过将每种抗血清各取1.2毫升混合，制备包含三种抗体类型的混合溶液。

当四种混合物制备完成后，每种抗体溶液中均含有 720 微升 FCS。这有助于在检测过程中减少抗体对明胶颗粒的非特异性凝集。抗体混合物可在 -20 摄氏度下保存，直至用于凝集试验。

在本实验中，我们使用冻干的明胶颗粒，这些颗粒包被了人脊髓灰质炎病毒受体的胞外结构域以及小鼠Fc结构域的IgG二聚体。为确保凝集图像的一致性，务必在同一次实验中使用同一批次的颗粒，避免使用不同批次。每瓶颗粒加入1.5毫升复溶缓冲液进行复溶，轻轻振荡以充分混匀。

重悬的颗粒可在 4 摄氏度保存长达两周。首先，在 96 孔微孔板中设计实验。每个样本的第一孔仅含有病毒。

第2至第5孔将分别加入病毒和四种混合抗体溶液中的一种。务必保留一个孔作为阴性对照，仅加入培养基，不加病毒或抗体。待培养板设置完毕后，向第2至第5行的每个孔中加入12 µL相应的抗体溶液，以及12 µL的生长培养基。

将培养基加入仅含病毒的孔中，即第一行的孔，以及第六行的阴性对照孔。接着，在前五行的每个孔中加入12微升病毒样本，在第六行的阴性对照孔中加入12微升培养基。在抗体和病毒加样完成后，轻轻敲击使重组的明胶颗粒重悬，并立即向所有孔中每孔加入25微升颗粒悬液。

在将颗粒转移至孔板之前，必须注意防止颗粒沉降，以确保每个孔中的颗粒量相等。将检测板置于板式混匀器上，混匀30秒。然后将板放置在一张白纸上，于室温下孵育2小时，以使凝集反应发生。

在孵育期间或孵育结束后，切勿移动反应板，因为形成的凝集物不稳定。反应完成后，应拍摄多张反应板照片，以清晰显示各孔中凝集现象的质量。在未发生凝集的孔中，如图左侧所示，有色明胶颗粒会沉淀于孔底；而在发生凝集的孔中则不会出现此现象。

由于病毒与pvr、IgG二A包被的明胶颗粒之间的相互作用，呈现出如图中央所示的弥散着色模式。在本实验中，我们检测了病毒溶液PV一、二、三在抗体存在下诱导凝集的能力。如图所示，当无病毒或抗体时，不发生凝集，明胶颗粒发生沉淀；相反，在含有病毒但无抗体的孔中则出现凝集。

由于病毒的相互作用，发生了凝集现象。在实验孔中，PVR IgG 覆盖的明胶颗粒会阻止能够特异性中和该病毒的抗体所在孔中的病毒凝集。例如，含有抗 PV 1 型抗体的孔可阻止 1 型脊髓灰质炎病毒的凝集，而仅含有抗 PV 2 型和抗 PV 3 型抗体的孔则无法阻止其凝集。

脊髓灰质炎病毒2型和3型的情况也是如此。如果操作得当，掌握该技术后可在短短三小时内完成。