禽流感监测与FTA卡:实地方法，生物安全，和运输问题解决了
August 2nd, 2011
维护，检测和序列禽流感病毒的RNA的方法进行了验证和扩展，从鸟类的自然粪便样本。这种技术消除了保持冷静的链和处理传染性病毒的必要性和可应用在一个96孔高通量设置。
人类流感大流行，包括最近的猪流感流行，最初源于禽流感病毒 A IV，它是甲型流感病毒的一种。已经实施了大型监测计划，以收集有关 A IV 生态学的信息并检测高致病性菌株。在本视频中，介绍了一种从野生鸟类中分离和鉴定 IV 样本的方法。
首先，鸭子被困住了。他们的粪便被收集并贴在 FTA 卡上，该卡保存病毒 RNA 以供干燥储存 从 FDA 卡中取出样本并提取粪便材料。提取 RNA 并使用磁珠进行纯化。
进行逆转录酶 PCR 以生成 CD NA，然后对其进行测序。然后将所得序列与已知的 IV 序列进行比较，以揭示样本中存在的 IV 类型。与传播传染性病毒等现有方法相比，该技术的主要优点是无需保持严格的培养，并且很容易对偏远地区进行采样。
此外，带有 FDA 卡的生物安全法规更容易实施。该方法有助于回答疾病生态学领域的关键问题，例如发生哪些流感毒株。其中 虽然这种方法可以为禽流感的研究提供见解。
它也可以应用于其他系统，例如由病毒和其他微生物引起的不同野生动物疾病。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为捕捉和采样活鸭或其他鸟类需要练习，而且 RNA 的实验室工作很困难。当我们成功地从储存在 Watman FDA 看守物上的动物粪便中采样和分离出常规 DNA 时，我们第一次有了这种方法的想法：通过用 lu 鸭或食物吸引涉水的鸭子或其他鸟类，将它们困在笼子里。
在这里，onus 属的鸭子被困住了。将诱捕鸭放入单独的纸板箱中。将鸭子的翅膀紧紧地贴在身体上，将鸭子从盒子中取出。
在大多数情况下，新鲜的液体粪便会出现在盒子的底部。每次使用新的无菌拭子，捡起粪便并将其贴在 watman FTA 卡上，直到卡目标表面湿透。如果盒子底部没有粪便，请进行泄殖腔拭子检测。
首先打开鸭子，它的背部允许进入 clo 英亩。clo acre 是一个突出的结构，位于腹部下方靠近尾巴基部。如果需要，有经验的人可以同时抱着这只鸟并对其进行取样。
第二个人可以协助取样，而第一个人则抱着鸟。小心地插入大约 1 厘米的无菌塑料人造丝棉签，并在 clo 英亩处轻轻划出 SW。取出棉签，然后将其滚动在 watman FTA 卡的表面上。
在室温下干燥 FTA 卡至少 1 小时。将每个样品放入纸信封中。然后将信封存放在室温下进行短期存放或长期冷冻。
FTA 卡可以通过普通邮件发送，因为病原体变得不活跃。接触 FDA 卡表面后，在通风橱下工作。通过使用 Harris 两毫米打孔机打孔三个圆盘提取 FDA 卡材料（包括粪便）来开始病毒 RNA 分离程序，并将它们全部放入每个新样品之间的不含 RNA 的 96 孔板的孔中。
用酒精和 Kim 精密抹布仔细清洁打孔器。生成阳性对照。将实验室菌株作为阴性对照应用于 FTA 卡。
从空的 FTA 卡中打卡出光盘。像以前一样将它们放入板中，确保留出另一个孔用于 PCR 对照。在实验后期，向孔中加入 70 μL RNA 快速提取溶液。
然后使用热封机热封板，将板放在摇床上并设置速度，确保不会造成溢出。将板在室温下振荡孵育 5 分钟。孵育后，使用 ambience Mag Max 96 试剂盒在 130 μL 制备的裂解结合溶液中分离病毒 RNA，该溶液在试剂盒中提供到试剂盒中空板的每个孔中。
然后将 50 微升提取的 FDA 卡材料转移到每个卡上。将板放在摇床上 1 分钟。接下来，将试剂盒中制备的微珠混合物加入每个样品中，上下吹打并摇晃 5 分钟，混合。
在此孵育过程中，RNA 分子将结合到磁珠中。接下来，将板移至磁性 96。当溶液完全澄清时，可以很好地捕获珠子。
使用移液管取出并丢弃旋后物。然后从磁力架上取下板。向每个样品中加入 150 微升准备好的洗涤液 1 杯来洗涤珠子，摇晃 1 分钟，然后在磁力架上捕获珠子。
当溶液完全澄清时，取出并丢弃上清液。重复此洗涤一次。然后使用溶液 2 进行两次洗涤。
最后一次洗涤后，使用移液管去除尽可能多的溶液，并将干燥板在室温下放在摇床上 2 分钟，以风干珠子。磁珠干燥后，从试剂盒中加入 50 μL Elucian 缓冲液，摇动 4 分钟，以从磁珠中释放 RNA。像以前一样捕获微珠。
上清液现在包含分离的 RNA，可直接用于下游应用生成和扩增。病毒基因的 CDNA。如随附的书面方案所述，使用一步法访问 R-T-P-C-R 系统在 25 μL 反应中进行逆转录 PCR。
PCR 完成后，可以筛选样本的 IV 阳性并进行纯化。为了确定样品是否为 IV 阳性，将两微升 PCR 产物混合在用 1% 溴化粥样块染色的 1% aro 凝胶上，在 120 伏电压下运行一小时。使用凝胶成像系统进行可视化，然后鉴定具有预期大小范围内的扩增片段的样品。
这里的目标片段是 244 个碱基对。因此，寻找条带在 200 个碱基对和 300 个碱基对之间的样品，例如，如红色圆圈中的样品。接下来，加载 PCR 反应的剩余部分。
将约 23 微升候选物质放在 2% 溴化粥样块染色的 aros 凝胶上，并运行两个小时。将凝胶放在 UV 透射照明器上。然后用手术刀切除正确大小的条带，并使用 DNA 回收试剂盒将它们放入单独的 1.5 mL 反应管中。
从凝胶片段中纯化 DNA 用于测序和鉴定。在此处对目标片段进行 Sanger 测序。正向引物 M 52 C 用于对 A IV 基质基因进行测序。
获得测序结果后。使用本地或基于 Web 的工具（如美国国家生物技术中心的 blast）将 cDNA 序列与 GenBank 等核苷酸数据库进行比较，基因片段序列可以与现有条目相匹配。因此，可以表征特定的 A IV 菌株并获得有关序列特征的宝贵信息。
2007 年 12 月，秋季 B 鸟类观测站从每只野鸭中采集了 84 只绿头鸭的样本，按照本协议中的说明在 FTA 卡上采集样本。发货后，FTA 卡在零下 20 摄氏度的冰箱中保存了两年。此处显示了来自天然样品的这 84 个样品的 PCR 产物的凝胶图片。
由于粪便中存在各种微生物污染，可以观察到大量非特异性条带。此处使用的引物对的目标片段为 244 个碱基对。预期大小的长条带以红色圈出。
蓝色圆圈表示小于 100 个碱基对的非特异性扩增子或引物二聚体伪影。对红色箭头指示的样本进行分离和测序。绿色箭头表示阳性对照。
通过将所选样品的 cDNA 序列与 NCBI 核苷酸数据库进行比较，确认所选样品为 IV 阳性。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在两小时内完成，从加载 FDA 卡到清洁 RNA 模板。在尝试此程序时，重要的是要记住注意清洁工作空间、使用手套、分离 PCR 前后工作环境、过滤器吸头并在安全罩下工作遵循此程序。
其他下游应用（如将片段克隆到载体中）可用于回答其他问题，例如在开发后是否有多种流感毒株感染一个宿主。该程序可以为疾病生态学领域的研究人员在 AI 采样不可行的偏远地区探索 AI 感染铺平道路。以前。看完这个视频后，你应该对如何从泄殖腔分离物中对出生的禽流感进行采样，从 FDA 卡中纯化 RNA 分子，并确定它们是否被感染以及通过哪个地形被感染。
不要忘记，与野生鸟类一起工作可能会面临处理感染禽流感或其他人畜共患疾病的个体的风险。正因为如此，在执行此程序时始终穿着防护服非常重要。
概述
本研究提出了一种方法，用于使用鸟类粪便样本保存、检测和测序禽流感病毒（A IV）的RNA。该技术允许进行高通量处理，无需维持冷链或处理传染性病毒。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 生态学
- 传染病学
背景
- 禽流感病毒在研究人类流感大流行中具有重要意义。
- 监测计划对于监测A IV的生态学至关重要。
- 目前的方法通常需要严格的生物安全措施。
- 需要简化在偏远地区采样的技术。
研究目的
- 开发一种从野生鸟类粪便中分离和鉴定A IV的方法。
- 便于更容易地采样和分析病毒RNA。
- 加深对野生动物中流感菌株的理解。
使用的方法
- 捕捉鸭子并在FTA卡上收集粪便样本。
- 使用磁珠从样本中提取RNA。
- 进行逆转录酶PCR以生成cDNA。
- 进行测序并将结果与已知的A IV序列进行比较。
主要结果
- 该方法成功从粪便样本中分离出RNA。
- 它允许进行不涉及传染性病毒处理的高通量分析。
- 结果可以识别样本中存在的A IV类型。
- 该技术可以适用于其他野生动物疾病。
结论
- 该方法简化了研究禽流感的过程。
- 它为传统病毒培养方法提供了一种更安全的替代方案。
- 未来的应用可能扩展到野生动物中的其他病毒性疾病。
常见问题
Executive Industry Relevance
FTA card-based avian influenza surveillance enables decentralized, high-throughput viral RNA collection and analysis without cold chain or infectious sample handling. This approach addresses critical biosafety and logistical barriers in global pathogen monitoring, supporting early detection and risk assessment of emerging influenza strains. The method enhances portfolio-wide surveillance reach and operational flexibility for biopharma R&D teams focused on zoonotic disease threats.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables field-based collection of viral RNA for rapid strain identification and ecological mapping.
- Supports functional validation of surveillance targets by direct detection of circulating AIV subtypes.
- Facilitates mechanistic de-risking by bypassing the need for infectious virus propagation.
- Improves predictive confidence in early warning systems for zoonotic spillover events.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, scalable sample input for downstream molecular assays such as RT-PCR and sequencing.
- Enhances reproducibility and comparability of surveillance data across sites and time points.
- Enables high-throughput screening of field samples using 96-well plate workflows.
- Reduces biosafety and transport constraints, supporting broader assay deployment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns surveillance outputs with translational biomarker discovery for zoonotic risk assessment.
- Supports continuity from ecological sampling to preclinical model development for influenza research.
- Provides sequence-level data for comparative genomics and strain tracking.
- De-risks advancement decisions by enabling rapid, field-to-lab data integration.
Pipeline & Workflow Integration
This FTA card workflow bridges field surveillance and laboratory analytics, integrating sample collection, RNA extraction, RT-PCR, and sequencing within a unified pipeline. It supports the continuum from early discovery through lead identification and translational research in infectious disease portfolios.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on AIV strain prevalence and ecological distribution.
- Screening: Delivers assay-ready RNA samples for high-throughput molecular analysis.
- Analytics: Provides quantitative PCR and sequence data for robust strain comparison and surveillance reporting.
- Translational Research: Enables linkage of field surveillance to preclinical model selection and biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for pathogen surveillance across diverse geographies and disease systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in zoonotic surveillance.
- Operational Value: Streamlines logistics, enhances biosafety, and supports scalable sample throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for surveillance expansion and resource allocation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of surveillance targets and rapid response to emerging threats.
Implementation Considerations
- Requires field expertise in wildlife sampling and RNA handling.
- Needs access to molecular biology infrastructure for RT-PCR and sequencing.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample collection and processing protocols.
- Adaptable to various wildlife and pathogen systems with protocol optimization.
- Potential for reduced sensitivity compared to traditional virus culture methods, as noted in source.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:17
Duck Trapping and Cloacal Swabbing
4:02
Viral RNA Isolation and RT-PCR
7:28
Screening for AI-positive Samples and Purification of Targeted Fragments from Gel
8:40
Screening and Identification of PCR Products
9:21
Representative Results
10:41
Conclusion
