Name: 老年帕金森病大鼠的超声波发声的有针对性的培训 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学习针对老年帕金森病大鼠的超声波发声训练方法，通过正强化行为训练结合声学分析技术，研究发声缺陷的神经机制与康复效果。该方案为帕金森病及衰老相关语音障碍提供系统性研究模型。

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由美国国立卫生研究院（NIDCD，P30-DC010754，T32-DC009401）资助。

1. 训练前/训练后记录
<ol>
<li>使用 Avisoft Recorder 并按照图 2 所示配置开始超声监测。</li>
<li>超声波发声可通过实时声谱图进行视觉监测，或通过插入超声记录接口的耳机进行听觉监测。</li>
<li>将一只性接受期（动情期）的雌鼠放入待测雄鼠的饲养笼中。动情期的迹象包括脊柱前凸（lordosis）、耳朵抖动以及快速窜动。与非性接受期雌鼠相比，处于动情期的雌鼠更能诱发雄鼠发出发声行为。</li>
<li>当雄鼠对雌鼠表现出兴趣（例如嗅探、追逐和/或爬跨）后，移走雌鼠，并记录雄鼠 1–2 分钟的发声。</li>
<li>如果雄鼠未立即发声，可短暂地将雌鼠重新放回雄鼠的饲养笼中以刺激其发声。</li>
</ol>
2. 发声训练
<ol>
<li>使用 Avisoft Recorder 开始超声波监测，配置与图 2 所示相同。</li>
<li>将雄性大鼠置于其位于麦克风下方的家中笼内。</li>
<li>将一只处于动情期的雌性大鼠放入雄性大鼠的家中笼内。如前所述，雌性大鼠应处于动情期，以最大程度激发雄性大鼠的发声反应。</li>
<li>一旦雄性大鼠表现出对雌性大鼠的兴趣，即移走雌性大鼠。</li>
<li>在雄性大鼠发出目标发声后，立即同时给予奖励，方式为笔点击声和短暂呈现饮水瓶或食物奖励。训练初期，任何 50-kHz 频率调制（见图 5B）的叫声均应给予奖励；随着训练进展，仅对越来越复杂的连续叫声进行强化，例如连续快速发出 5 至 10 次的叫声串。</li>
<li>持续训练直至完成 30 次强化。该过程通常耗时 5 – 10 分钟。</li>
</ol>
3. 准备进行声学分析
<ol>
<li>始终存档原始声音文件，并在工作副本上进行编辑和测量，因为分析过程中需要对每个文件进行滤波并去除噪声。</li> 
<li>使用 Avisoft SASLab Pro 的批处理模式，对所有待分析的声音文件进行高通滤波，截止频率设为 25 kHz，以去除低于超声波发声频率的无关噪声。</li>
<li>为了使用 SASLab Pro 的自动检测功能，必须首先确定噪声阈值。为此，打开一个声音文件，并使用图 3 所示的设置生成频谱图。</li>
<li>应根据图 4 所示的设置配置“自动参数测量”显示界面。</li>
<li>在频谱图中找到一个没有发声信号或噪声的区域，该区域即为背景噪声。</li>
<li>使用“自动（单阈值）”选项，在“自动参数测量”设置对话框的“元素分离”部分，通过调节频谱图上方功率谱窗口中的黑线，将阈值设定在略高于背景噪声的水平。在图 4 中，阈值已设置为 -55 dB。</li>
<li>在对话框底部，将“若峰值振幅低于则拒绝”的值设置为比上一步确定的阈值低 1 dB。假设所有录音设置相同，则这两个数值应适用于所有待分析的声音文件。</li>
</ol>
4. 发声识别
<ol>
<li>要使用上述自动阈值标记发声，请首先使用上述设置创建一个声谱图。</li>
<li>手动删除符合以下任一标准的噪声：1）被错误识别为发声信号；2）影响发声起始和/或结束时间的判断；和/或 3）被错误识别为发声的最高或最低频率（分别由上方和下方的红线指示）。或者，可在下方步骤 4.5 创建永久标签后，手动调整发声标签的起止时间。然而，影响高低频率测量的噪声必须手动清除。</li>
<li>在某些情况下，发声信号无法与周围噪声（例如动物移动时垫料产生的声音）分离。此时该发声无法被准确分析，应予以删除。</li>
<li>当所有发声信号均已识别后，通过从“工具”下拉菜单中选择“从波形中移除已擦除的声谱图部分…”命令，将声谱图中已删除的部分永久从声音文件中移除。如果在关闭声谱图之前未执行此操作，所有擦除操作将丢失。</li>
<li>在“自动参数测量”设置窗口的“元素分离”部分，单击“编辑”按钮，在声音文件中创建永久标签。</li>
<li>通过视觉和听觉逐一检查每个已标记的发声信号，确定其类别：简单型、频率调制型（FM）或谐波型，并使用预定义的文本模块分配相应的标签。各类发声示例见图5。</li>
<li>关闭声谱图，保存声音文件，然后继续处理下一个待分析的声音文件。</li>
</ol>
5. 声学测量
<ol>
<li>在所有音频文件中的发声均已识别后，使用批处理工具（工具：批处理）自动测量所有文件的声学参数。</li>
<li>在批处理对话框中，从下拉菜单中选择“自动参数测量”。</li>
<li>选中“处理所选文件夹中的所有文件”复选框，然后点击“文件夹”按钮，并选择保存音频文件的文件夹。</li>
<li>点击“开始”，每个文件将根据上次在“自动参数测量设置”对话框中使用的设置自动进行分析。</li>
<li>测量结果将保存在一个文本文件中，该文件路径可通过 DDE 参数/日志文件设置命令进行定义。此文本文件随后可导入统计分析软件进行分析。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
大鼠的超声发声受与衰老及6-OHDA帕金森病模型相关的生理变化影响。13 通常，我们观察到超声发声质量下降，表现为以下定量声学参数的降低：带宽、峰值频率、持续时间和强度。图6显示了帕金森病模型大鼠在三个不同时间点的频率调制发声情况：基线期、帕金森病诱导后以及发声训练后。在帕金森病状态下，发声的带宽、持续时间和强度均有所降低，此外，频率调制也变得不规则。
除了特定声学参数的退化外，我们还观察到老年大鼠和帕金森病模型大鼠所发出的叫声类型整体复杂性降低。例如，在帕金森病诱导后，大鼠发出的简单叫声数量增多，而频率调制的复杂叫声减少。经过发声训练后，许多声学参数（如持续时间和强度）接近基线水平，复杂叫声的数量也有所增加（图6）。老年大鼠在其超声发声中也表现出类似的声学参数退化。目前我们正在研究发声训练对老年大鼠的影响。
<img src="/files/ftp_upload/2835/2835fig1.jpg" alt="发声增长分析；线形图显示每周发声次数和发声速率随时间的变化趋势。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 在一组年轻（9月龄）和老年（32月龄）Fischer 344/Brown Norway F1大鼠中，经过6周的训练，每次训练 session 的发声次数（所有大鼠每周均达到目标）以及发声速率（显示均值和标准误）均逐渐增加。
<img src="/files/ftp_upload/2835/2835fig2.jpg" alt="声谱图显示声学信号分析的频率（kHz）与时间（sec）；标注部分为 A、B、C。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 三类 50 kHz 啮齿类发声的代表性示例；（A）简单型，（B）频率调制型，（C）谐波型。
<img src="/files/ftp_upload/2835/2835fig3.jpg" alt="声谱分析图，频率与时间关系，显示声音模式和带宽测量结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 单只大鼠在（A）基线期、（B）帕金森病诱导后以及（C）发声训练后的代表性调频发声图谱。

<ol><li>Fox, C. M., Morrison, C. E., Ramig, L. O., Sapir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspectives+on+the+Lee+Silverman+Voice+Treatment+%28LSVT%29+for+individuals+with+idiopathic+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Speech+Lang+Pathol%22%5BJournal%5D)">Current perspectives on the Lee Silverman Voice Treatment (LSVT) for individuals with idiopathic Parkinson disease.</a> Am J Speech Lang Pathol. 11, 111-123 (2002).</li>
<li>Roy, N., Stemple, J., Merrill, R. M., Thomas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+voice+disorders+in+the+elderly%3A+preliminary+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of voice disorders in the elderly: preliminary findings.</a> Laryngoscope. 117, 628-633 (2007).</li>
<li>Ramig, L. O., Sapir, S., Fox, C., Countryman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+vocal+loudness+following+intensive+voice+treatment+%28LSVT%29+in+individuals+with+Parkinson%27s+disease%3A+a+comparison+with+untreated+patients+and+normal+age-matched+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Mov.+Disord%22%5BJournal%5D)">Changes in vocal loudness following intensive voice treatment (LSVT) in individuals with Parkinson's disease: a comparison with untreated patients and normal age-matched controls.</a> Mov. Disord. 16, 79-83 (2001).</li>
<li>Sapir, S., Ramig, L. O., Fox, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lee+Silverman+Voice+Treatment%C2%AE+for+voice%2C+speech+and+other+orofacial+disorders+in+patients+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Neurology%22%5BJournal%5D)">The Lee Silverman Voice Treatment® for voice, speech and other orofacial disorders in patients with Parkinson's disease.</a> Future Neurology. 1, 563-570 (2006).</li>
<li>Panksepp, J., Burgdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50-kHz+chirping+%28laughter%3F%29+in+response+to+conditioned+and+unconditioned+tickle-induced+reward+in+rats%3A+effects+of+social+housing+and+genetic+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables.</a> Behav. Brain Res. 115, 25-38 (2000).</li>
<li>Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+repertoire+of+vocalizations+in+the+BTBR+T%2Btf%2FJ+mouse+model+of+autism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Unusual repertoire of vocalizations in the BTBR T+tf/J mouse model of autism.</a> PLoS One. 3, e3067-e3067 (2008).</li>
<li>Wohr, M., Houx, B., Schwarting, R. K., Spruijt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+experience+and+context+on+50-kHz+vocalizations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Effects of experience and context on 50-kHz vocalizations in rats.</a> Physiol. Behav. 93, 766-776 (2008).</li>
<li>Lahvis, G. P., Alleva, E., Scattoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+mouse+vocalizations%3A+prosody+and+frequency+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Translating mouse vocalizations: prosody and frequency modulation.</a> Genes Brain Behav. 10, 4-16 (2011).</li>
<li>Brudzynski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+of+adult+rats+by+ultrasonic+vocalization%3A+biological%2C+sociobiological%2C+and+neuroscience+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Communication of adult rats by ultrasonic vocalization: biological, sociobiological, and neuroscience approaches.</a> ILAR J. 50, 43-50 (2009).</li>
<li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Russell, J. A., Hammer, M. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic+output+from+the+excised+rat+larynx%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acoust.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic output from the excised rat larynx.</a> J. Acoust. Soc. Am. 128, EL75-EL79 (2010).</li>
<li>Fulceri, F., Biagioni, F., Lenzi, P., Falleni, A., Gesi, M., Ruggieri, S., Fornai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nigrostriatal+damage+with+6-OHDA%3A+validation+of+routinely+applied+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Nigrostriatal damage with 6-OHDA: validation of routinely applied procedures.</a> Ann N Y Acad Sci. 1074, 344-348 (2006).</li>
<li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Commun.+Disord%22%5BJournal%5D)">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> J. Commun. Disord. 43, 319-326 (2010).</li>
<li>Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+dopamine+synaptic+activity%3A+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behav. Neurosci. 123, 328-336 (2009).</li>
<li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations%3A+effects+of+amphetamine+and+social+context%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology (Berl). 211, 1-13 (2010).</li>
<li>Burgdorf, J., Kroes, R. A., Beinfeld, M. C., Panksepp, J., Moskal, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+molecular+basis+of+positive+affect+using+rough-and-tumble+play+in+rats%3A+a+role+for+insulin-like+growth+factor+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Uncovering the molecular basis of positive affect using rough-and-tumble play in rats: a role for insulin-like growth factor I.</a> Neuroscience. 168, 769-777 (2010).</li>
<li>Wöhr, M., Schwarting, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic+communication+in+rats%3A+effects+of+morphine+and+naloxone+on+vocal+and+behavioral+responses+to+playback+of+50-kHz+vocalizations%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic communication in rats: effects of morphine and naloxone on vocal and behavioral responses to playback of 50-kHz vocalizations.</a> Pharmacol Biochem Behav. 94, 285-295 (2009).</li>
</ol>

动物实验严格遵循《公共卫生服务政策关于实验动物的人道护理与使用》、《NIH 实验动物护理与使用指南》以及《动物福利法》所规定的准则与要求。本实验动物使用方案已获得威斯康星大学麦迪逊分校医学院与公共卫生学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

大鼠的超声波发声似乎容易受到衰老和疾病过程（如帕金森病）的影响。这些超声波发声为发声功能提供了一种行为学模型，包括伴随疾病和衰老所引起的生理变化而出现的功能缺陷。此外，超声波发声中的声学变化易于测量和量化。同时，超声波发声还可通过行为干预进行调节。因此，大鼠的超声波发声为研究疾病、衰老以及治疗干预对行为及潜在神经生物学机制的影响提供了一个有用的模型。
我们的发声训练方法采用一种条件刺激（一个点击声），并将其与正向强化（水或食物奖励）相结合。通过点击声后给予奖励的方式，来强化日益复杂的发声行为。我们将复杂发声定义为包含“颤音”（频率调制）成分的发声（图5B），与保持单一频率的“平直”发声相对（图5A）。这种频率调制成分因其正弦波形而易于识别。尽管50-kHz发声可能完全呈正弦波形（图5B），但更常见的是部分包含频率调制成分，同时伴有较大的频率跳跃或短暂的平直成分的更复杂50-kHz发声。这些更复杂的发声在各成分之间可能存在短于10毫秒的短暂间断，但仍被视为单个发声事件。尽管这些发声可在事后进行更详细的亚分类14，但为了减少在线主观分类的需求并降低强化过程的变异性，我们将所有包含频率调制成分的50-kHz发声统一归类为复杂发声。在您自己的实验室中，应根据研究目的选择合适的研究设计，以确定数据的分类与分析方法。
使用本方案时需考虑多种因素。首先，尽管大鼠在遗传上具有一致性且操作过程保持统一，但其对训练的反应仍存在个体差异。一些大鼠天生比其他个体发出更多的叫声5，或对雌性暴露的动机强于对食物或水奖励的动机。为应对这种变异性，我们通过分析每只大鼠在基线水平、损毁后及训练后的声学参数变化来进行评估。虽然本方案未讨论，但我们还采用行为检测方法来量化大鼠对雌性的兴趣，例如爬跨潜伏期。此外，根据大鼠的年龄和活动水平，在训练期间可能需要在饲养笼上加装金属网盖以防止逃逸。尽管存在个体差异，我们已成功将本方案应用于多种品系和年龄段的大鼠，均能使其发声能力相对于各自基线水平得到改善。
大鼠对环境中看似微小的变化非常敏感，例如气味、温度和人员变动。应尽量避免使用有香味的个人护理产品，如润肤露、护发产品和香水。在开始训练之前，操作者必须能够熟练地与大鼠互动并进行抓取操作。此外，人员或环境的任何不一致都可能影响大鼠的发声反应。
由于大鼠具有夜行性，应将其置于颠倒的光照周期中，以便在它们最活跃的黑暗阶段进行训练。我们使用红光照射训练室。此外，如果在训练中使用水作为奖励，则应限制大鼠接触水的时间。我们的大鼠在每次训练前限制饮水21小时。根据本机构动物护理与使用委员会的规定，训练后随机时间段（10至30分钟）给予饮水，随后在光照周期的黑暗阶段自由饮水3小时；该3小时的饮水时间被确定为对动物健康或福利无明显损害、同时又能使水有效作为行为学研究中强化物的最小限制时长。应每天检查大鼠是否出现脱水迹象，并每隔一天称重一次，确保体重下降不显著（不超过10%）。若使用食物作为奖励，则无需进行食物限制。市面上有专为大鼠设计的零食，但我们发现一小块含糖谷物早餐食品即可作为有效的奖励。
如上所述，处于动情期的雌性大鼠比非性接受期的雌性大鼠更能引发雄性大鼠的发声反应。通过在种群中维持大量雌性大鼠，几乎每天都有较大概率至少有一只雌性处于动情期。然而，也可通过药物诱导雌性大鼠动情：在训练前48小时，皮下注射10 μg β-雌二醇溶于0.1 cc无菌芝麻油中，随后在训练前4小时注射500 μg孕酮溶于0.1 cc无菌芝麻油中。此外，未曾接触过雌性大鼠的雄性大鼠必须在发声训练前获得性经验。这一过程通过将表现出性接受行为（如快速移动、脊柱前凸反应、耳朵抖动）的雌性大鼠放入雄性大鼠的饲养笼中，直至雄性完成骑跨并射精来实现。在最初几次实验中，雄性可能不会立即骑跨；若雄性表现出对雌性的兴趣（例如嗅闻和/或在笼内追逐雌性），则可在之后将雌性移除。性经验训练每日进行一次，持续两周。此期间 также 为大鼠适应实验人员及录音环境提供了机会。
该方法的一个局限性在于发声类型的判定具有主观性。此外，这一因素也限制了数据采集的速度，因为每次发声都必须被单独检查并手动分类。与此相关的是，需要有经过一致培训且在发声识别方面富有经验的评定人员。应在您自己的实验室中评估评定者内部和评定者之间的可靠性。
总之，啮齿类动物的超声发声在多种模型中被用于研究脑与行为之间的关系，包括情绪状态、奖赏与成瘾，以及自闭症等疾病状态。6,14-16 该新方法可用于研究针对声音缺陷（如衰老和帕金森病）进行靶向发声训练的潜在机制。该方法有望应用于其他影响交流和发声功能的疾病模型。

<table><tbody><tr><td>电容式超声波麦克风 CM16/CMPA</td><td>Avisoft BioAcoustics</td><td>40011</td><td></td></tr><tr><td>UltraSoundGate 116Hb</td><td>Avisoft BioAcoustics</td><td>41161</td><td></td></tr><tr><td>Avisoft-RECORDER</td><td>Avisoft BioAcoustics</td><td>10201</td><td></td></tr><tr><td>Avisoft-SASLab Pro</td><td>Avisoft BioAcoustics</td><td>10101</td><td></td></tr></tbody></table>

针对老年及帕金森病大鼠的超声 vocalizations 定向训练

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

声音障碍是帕金森病（PD）和衰老的常见并发症，会因影响沟通能力而显著降低生活质量。1, 2 针对性训练（言语/声音治疗）可改善特定的声音障碍，3, 4 但行为干预的潜在机制尚不明确。对声音障碍及治疗进行系统性研究时，应考虑许多在人类中难以控制的因素，例如年龄、家庭环境、发病后病程、疾病严重程度以及用药情况。本文介绍的方法采用一种发声的动物模型，可用于系统研究在针对性声音训练下潜在的感觉运动机制如何变化。本方案中概述的超声波记录与分析流程适用于任何关于啮齿类动物超声发声的研究。
啮齿类动物的超声波发声正成为研究行为神经基础的有价值模型。5-8 啮齿类动物和人类的发声均具有符号意义，并通过喉部收缩调节呼出气流而产生。9, 10 因此，啮齿类动物的发声可能是研究感觉运动背景下声音障碍的有用模型。此外，大鼠模型使我们能够研究通过靶向训练实现功能缺陷恢复的神经生物学机制。
为了建立帕金森病（PD）模型，我们使用Long-Evans大鼠（Charles River Laboratories International, Inc.），通过向内侧前脑束单侧注射7 μg的6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导帕金森样症状，从而导致纹状体突触前神经元发生中度至重度变性（具体方法见Ciucci, 2010）11, 12。在衰老模型中，我们采用Fischer 344/Brown Norway F1大鼠（美国国家衰老研究所提供）。
我们诱发发声的主要方法是让有性经验的雄性大鼠接触处于性接受状态的雌性大鼠。当雄性大鼠对雌性产生兴趣时，将雌性移走，雄性则会继续发声。通过以食物或水奖励复杂的发声行为，可同时增加复杂发声的数量和发声频率（图1）。
安装在雄性大鼠笼舍上方的超声波麦克风用于记录其发声。在移走雌性大鼠后开始录音，以单独获取雄性发出的声音。发声信号可实时观察用于训练，也可录制后离线分析。通过在发声训练前后记录并进行声学分析，可评估疾病的影响以及通过训练恢复正常功能的效果。该模型还允许我们将观察到的行为（发声）改善与大脑及神经肌肉系统的改变相关联。

嗓音障碍在衰老和帕金森病中具有显著致残性。大鼠的超声发声也受这些状况影响，可用于研究此类嗓音障碍、其神经基础，以及行为干预下功能恢复的性质。

声音障碍是帕金森病（PD）和衰老的常见并发症，其通过影响……可显著降低生活质量

本实验的总体目标是训练大鼠增加其超声波发声（ultrasonic vocalizations，USVs）的数量和复杂性。首先记录大鼠的基础发声情况，作为基线数据；下一步则通过正向强化法对目标发声行为进行训练。训练结束后，记录训练后的发声情况。该实验流程的最后一步是对基线与训练后的发声进行声学分析和比较。最终，可获得实验结果。该研究表明，通过增加带宽、峰值频率和持续时间等声学参数，训练能够提高超声波发声的数量和复杂性。该方法有助于回答交流障碍领域中的关键问题，例如发声练习如何调节潜在的神经机制。尽管该方法也可为帕金森病和衰老相关的颅感觉运动缺陷提供见解。该方法也可应用于其他使用超声波发声作为行为指标的疾病模型和实验条件。本次发声训练演示将由本实验室成员Emerald Dahl和Jamie Shire进行。开始超声波监测时，首先加载Avisoft Recorder软件，选择“永久无限”触发模式，以便手动启动和停止录音。接下来，在基础目录中指定所采集音频文件的保存位置。采样率必须至少为 200,000 赫兹，以捕捉最高频率的发声。这些参数设置完成后，取下雄性大鼠饲养笼的顶盖，并将其直接置于麦克风下方。接着，通过观察雌性大鼠是否出现脊柱前弯反射、耳朵抖动以及快速冲刺行为，来确定其是否处于性接受状态。将发情期雌鼠放入实验雄鼠的饲养笼中。当雄鼠通过嗅闻、追逐或骑跨表现出对雌鼠的兴趣时，移出雌鼠，并记录雄鼠的发声1至2分钟。通过实时观察声谱图，以视觉方式监测其超声波发声。如果雄性不发声，应立即将雌性大鼠短暂地放回雄性大鼠的居住笼中以刺激其发声。首先，将一只雄性大鼠带入训练室。其他所有雄性大鼠应暂时安置在相邻房间，直至其训练时段开始。应预先限制大鼠接触水，以利于将水用作奖励。训练期间，按前述方式设置 Avis 软件录音设备。随后，将饲养笼置于麦克风下方。当雄性大鼠处于合适位置后，将一只可接受交配的雌性大鼠放入笼中。一旦雄性大鼠对雌性表现出兴趣，立即将雌性移除，并监测目标发声情况。最初，任何50千赫兹的频率调制叫声均应给予奖励。通过同时点击一支笔并短暂出示一瓶水或食物来呈现奖励。仅在训练进展到一定程度时才给予奖励，且只对越来越复杂的叫声序列进行强化，例如连续快速发出的五个或十个叫声组成的序列。持续训练，直至给予30次强化。这通常需要五到十分钟来分析基线和训练后的记录。首先，生成原始声音文件的存档，并在工作副本上进行编辑，以去除超声波发声以下的噪声频率。使用 AVI Soft SaaS Lab Pro 的批处理模式，对声音文件进行高通滤波，截止频率为 25 千赫兹。为了确定使用 SaaS Lab Pro 的自动元素检测功能所需的噪声阈值，请打开一个声音文件并生成频谱图。将 FFT 长度设置为 512，帧大小为 75%，时间重叠率为 93.75%。启用波形编辑功能，以便从频谱图中擦除的噪声也能从波形中移除。按此处所示设置自动参数测量。需要测量的三个参数是：元素持续时间、峰值频率和峰值振幅。在测量位置部分，可设置整个元素的最大振幅，以及最小和最大参数。在元素分离选项中，选择自动单阈值并显示阈值。在频谱图中找到没有叫声或噪声的区域，该区域即为背景噪声。将阈值设置为略高于背景噪声的水平。通过调节频谱图上方功率谱窗口中的黑线，可在此处找到上一步所设阈值的分贝水平。将“拒绝幅度小于”值设置为比阈值低1分贝。这两个数值现在应适用于所有被分析的声音文件。假设所有录音设置均相同，为标记发声信号，需使用先前设定的自动阈值及之前显示的相同参数生成频谱图。手动删除符合以下任一标准的噪声：一、被错误识别为发声信号的噪声；二、影响发声信号起始或结束时间判断的噪声；三、被错误识别为发声信号最高或最低频率的噪声，该频率分别由上方和下方的红线标示。在某些情况下，发声可能无法与周围噪声（例如动物运动时垫料产生的声音）分离。此类发声无法被准确分析，应在所有发声信号被识别后，从声音文件中永久删除声谱图中已标记删除的部分。通过从工具下拉菜单中选择“移除”选项，可从波形中删除声谱图片段，从而在声音文件中创建永久性标签。打开自动参数测量设置窗口，在元素分离部分通过视觉和听觉方式点击编辑按钮。逐个审阅已标记的发声片段，确定其类别，并使用预定义的文本模块分配相应的标签。我们在分析中使用的类别包括：简单频率、调制和谐波。关闭频谱图，保存声音文件，然后继续分析下一个声音文件。在所有声音文件中的发声信号均被识别后，使用批处理工具自动测量所有文件的声学参数。在批处理对话框中，从下拉菜单中选择自动参数测量。选中“处理所选文件夹中的所有文件”复选框。然后点击文件夹按钮，选择保存声音文件的文件夹。点击开始，每个文件将根据上次使用的设置自动进行分析。在自动参数测量设置对话框中，测量结果将保存为一个文本文件，该文件可通过 DDE 参数斜杠日志文件设置命令进行定义。然后可将此文本文件导入统计分析软件。这些图表表明，在为期六周的训练期间，每次会话中的发声次数以及每分钟的发声频率均有所增加。此处从左至右展示了我们所使用的三类50千赫兹发声的代表性示例，分别为简单频率型、调制型和谐波型。本示例展示了同一只大鼠在帕金森综合征诱导前、帕金森综合征诱导后以及发声训练后的频率调制型发声。与图A中的基线发声相比，图B帕金森综合征条件下的发声表现出带宽、持续时间和强度的降低。图C所示的训练后发声表明，在进行发声训练后，持续时间、强度、带宽和频率调制恢复至基线水平。观看本视频后，您应能够充分理解如何对大鼠的超声发声进行训练、记录和分析。

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