激光消融斑马鱼前肾以研究肾上皮再生

本实验的总体目标是针对斑马鱼胚胎肾脏（前肾）中的肾细胞进行特异性标记，以研究急性肾损伤后肾上皮的再生过程。该方法首先通过显微注射将荧光标记的葡聚糖共轭物注入斑马鱼胚胎中。在过夜培养期间，这些共轭物会被肾单位近端小管细胞选择性吸收。

第二天，在落射荧光显微镜下观察细胞，并使用脉冲激光系统消融选定的细胞。随后，通过组织学、整体原位杂交和免疫组织化学方法评估形态学和分子变化。该技术相较于现有方法（如使用肾毒性抗生素庆大霉素诱导急性肾损伤）的主要优势在于，后者会引发灾难性损伤并导致动物死亡，从而无法对肾脏再生过程进行随时间推移的分析。

该方法有助于解答肾脏研究领域中的关键问题，例如鉴定上皮再生过程中发生的分子信号事件。我们最初想到这一技术，是源于希望在培养皿中对肾上皮再生进行详细分析。在不含亚甲蓝的改良E3溶液中收集受精的斑马鱼胚胎。

将受精后的胚胎在28.5摄氏度下培养，直至受精后48至55小时，此时胚胎的肾脏系统已开始发挥作用。在开始注射前，使用带有三角形凹槽的模具制备aros注射板，以固定胚胎。接着，准备标准的显微注射针和用于标记近端小管的注射溶液。实验开始时，先进行胚胎的准备工作。

首先，使用精细镊子去除未孵化卵上的卵膜。然后用30毫升改良E3溶液冲洗卵膜碎片和培养皿中的残留物，并重新注满培养皿。其次，用5毫升三卡因麻醉幼鱼。

通过检查触碰反应确保幼虫已完全麻醉。如果幼虫未充分麻醉，在注射过程中会出现抽搐。第三步，使用塑料移液管将幼虫放入模具中。

将动物头部置于凹陷最深的位置，躯干沿孔的侧边摆放。随后进行肌肉内显微注射：将预先准备好的针头吸取 2 至 3 微升（µL）荧光素标记的葡聚糖溶液，定位针头后，向每只动物的躯干体节内注射约 1 纳升（nL）溶液。葡聚糖偶联物可被肾元近端小管迅速内吞，从而实现对该类上皮细胞群体的选择性标记。

应瞄准斑马鱼幼体的上部区域，避免刺入卵黄囊延伸部分，否则肾单位小管会受到破坏，如这只注射不当的幼体所示。完成注射后，将幼体转移至洁净的培养皿中，用新鲜的E3培养基清洗三次，以彻底去除三卡因残留。随后，用锡箔纸覆盖皿盖，在28摄氏度条件下将幼体避光孵育过夜。

开始本操作前，准备固定化培养基，并将部分等分试样置于室温下以备立即使用，其余等分试样则在4摄氏度下长期保存。首先，用30毫升E3中含5毫升三卡因麻醉斑马鱼幼鱼。与之前相同，务必确认鱼类对触觉刺激无反应。

现在在荧光下观察注射后的动物，挑选近端小管易于观察的幼虫。将最多12条幼虫转移至一个新的培养皿中，该培养皿含有相同浓度的trica，并在配备fitzy滤光片、明场照明和激光装置的共聚焦荧光显微镜下进行观察。消融实验开始时，先将幼虫转移并用麻醉剂处理，然后放入含有固定介质的培养皿中。

等待两分钟，然后将样品转移至载有固定液一滴的凹面载玻片上。用细探针轻轻将动物背侧朝上摆放并聚焦于背侧。接着使用校准的脉冲式微点激光系统消融其中一个肾单位，另一个保持完整作为对照。

当肾上皮细胞被消融时，您将观察到荧光的弥散。然后轻柔地将动物转移至12孔板的一个孔中，并用E3培养基清洗三次，以去除甲基纤维素。继续消融肾单位，直至填满第一个12孔板。

然后麻醉另外12只动物并重复该过程。注射Dextra Fitzy以特异性标记近端小管。受精后三天，对每只动物的肾单位进行激光消融。

消融后一天。消融后四天未见明显再生，但在原位消融细胞后已发生再生。采用原位杂交技术分析固定样本在单个时间点的变化。

该胚胎未进行消融处理。相比之下，这个胚胎的大部分小管上皮被消融，而另一个胚胎仅有小段小管上皮被消融。在此操作之后，可进行其他方法，如整体原位杂交，以回答更多问题，例如在肾单位再生过程中基因表达变化的特征。

请注意，接触化学品可能具有极高的危险性。建议在操作过程中采取预防措施，例如穿戴个人防护装备，包括实验服和手套。