Name: 新型抗癌药物使用手术标本肿瘤植的发展方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学习使用肿瘤外植体方法在恶性胶质瘤手术标本中进行药物疗效测试。该方法保留肿瘤微环境，通过免疫组织化学和流式细胞术评估替莫唑胺等候选药物的治疗效果。

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美国癌症协会（MRSG-08-108-01）、Vincent J. Sgro/美国脑肿瘤协会以及Khan家族基金会资助I Nakano的研究。

1. 培养基的制备
<ol>
<li>使用10% FBS（16140-071- GIBCO）与DMEM/F-12（1X），液体1:1（10565-042- Invitrogen）配制培养基，并加入0.6%纯化颗粒状琼脂溶液（1.01614.1000- EMD）。整个实验过程中保持无菌条件。</li>
<li>培养基配制时，将5 mL FBS（16140-071- GIBCO）加入45 mL DMEM/F-12（1X），液体1:1（10565-042- Invitrogen）中，终体积为50 mL。配制好的培养基置于37°C水浴中保温。</li>
<li>琼脂溶液采用微波加热法配制。将0.3克颗粒状琼脂溶于50 mL蒸馏水中，使用微波炉溶解。随后将琼脂溶液放入水浴中冷却至37°C。</li>
<li>取第1.2步和第1.3步中等体积的培养基与琼脂溶液配制工作液。0.6%琼脂溶液（0.5 mL）与10% FBS-DMEM/F-12培养基（0.5 mL）按1:1比例混合，使每孔6孔板中的总体积为1 mL。</li>
</ol>
2. 组织处理
<ol>
<li>胶质母细胞瘤（GBM）组织术后立即由病理科提供，组织学分类确认为胶质母细胞瘤（GBM）。</li>
<li>使用镊子小心将组织转移至培养皿中，用冰浴预冷的5 mL 1×PBS清洗3次。</li>
<li>使用手术刀（Feather-2976#10）和镊子（Fisher Scientific）对解剖后的样本进行连续切片，制备直径约10 mm的肿瘤组织块。</li>
<li>将组织块转移至6孔板中，每孔加入1 mL步骤1.4中所述培养基。确保组织充分暴露于空气以维持其活性。</li>
<li>向肿瘤组织块中注射DMSO（5%）或TMZ（2.5 nM），随后在含5% CO₂的湿润空气中37 °C孵育16小时。使用胰岛素注射器（1 mL，0.37×12.7 mm，28G1/2，Comfort Point-26027）在不同位置向每个组织块注射0.1 mL DMSO（5%）或TMZ，共注射3次，以确保处理均匀。</li>
<li>孵育16小时后，用5 mL 1×PBS清洗组织块3次。清洗后将组织块置于50 mL离心管（Basix-5539802）中，加入10 mL 10%（v/v）福尔马林（Ricca Chemical Company）固定24小时，随后进行石蜡包埋并切片至4 μm厚度。</li>
<li>将福尔马林固定的组织切片置于烧杯中，放置于搅拌器上（“禁止加热”），依次在下列溶液中各处理30分钟：30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇和二甲苯。</li>
<li>用纸巾吸干组织块后，置于熔化的石蜡（58至60 °C，Fisher Paraplast石蜡）中30分钟。</li>
<li>使用Surgipath Blue Ribbon石蜡将组织包埋于模具中，随后冷却至室温。</li>
<li>切取4 μm厚的石蜡包埋组织切片，并置于Fisher Plus载玻片上。</li>
</ol>
3. 免疫组织化学
免疫组织化学实验按先前所述方法进行。 1 
<ol>
<li>脱蜡与复水 
将切片置于切片架中，并按以下步骤操作：二甲苯处理 3 次，每次 5 分钟（共 3×5 分钟），100% 乙醇处理 3 次，每次 5 分钟，95% 乙醇处理 1 次，每次 5 分钟，70% 乙醇处理 1 次，每次 5 分钟，最后用流动自来水冲洗 3 分钟。
</li>
<li>热诱导表位修复进行抗原修复 
将切片浸入盛于玻璃烧杯中的 1× 柠檬酸缓冲液（Thermo Scientific-AP9003-500，用蒸馏水稀释）。在电热板上煮沸 15 分钟（确保组织切片不从载玻片脱落）。室温下冷却 30 分钟。用 1× PBS 缓冲液冲洗切片 3 次，每次 5 分钟。
</li>
<li>内源性过氧化物酶抑制 
将切片浸入含 0.3% 过氧化氢（Fisher Scientific-BP2633-500，用蒸馏水稀释）的甲醇溶液（Fisher Scientific-A-452-4）中，于玻璃烧杯内孵育 15 分钟。随后用 1× PBS 缓冲液冲洗 3 次，每次 5 分钟。
</li>
<li>封闭 
用 10% 正常山羊血清覆盖组织切片。将切片转移至湿盒中，室温孵育 1 小时。用 1× PBS 缓冲液冲洗 3 次，每次 5 分钟。
</li>
<li>一抗孵育 
切片在 4°C 条件下与以下浓度的一抗孵育过夜：人特异性 Caspase-3（1:1,000，R&D Systems，AF835），Ki67（1:1，Dako，15626），用 1× PBS 稀释。次日用 1× PBS 缓冲液冲洗切片 3 次，每次 10 分钟。
</li>
<li>二抗反应 
用 2–3 滴 HRP 标记的二抗（EnVision 系统）覆盖组织切片。将切片放入湿盒中，室温孵育 1 小时。用 1× PBS 缓冲液冲洗 3 次，每次 10 分钟。
</li>
<li>检测 
使用 DAB 显色试剂盒（Vector Laboratories-SK-4100）进行显色，以检测一抗信号，操作步骤遵循制造商说明书。
</li>
<li>复染 
将切片浸入苏木精染液中染色 10–15 秒（注意避免 DAB 信号被过度掩盖）。用流动自来水冲洗 3 分钟。
</li>
<li>脱水 
按以下顺序依次浸入溶液：70% 乙醇 5 分钟，95% 乙醇 5 分钟，100% 乙醇 3 次，每次 5 分钟，二甲苯 3 次，每次 5 分钟。
</li>
<li>用封片剂 Permount（Fisher Scientific-SP-15-100）封片。</li>
<li>使用 Olympus 荧光显微镜（DP-72）采集图像（3.11）。所有实验均通过省略一抗的阴性对照确认特异性染色信号。</li>
</ol>
4. 典型结果：
我们收集了多形性胶质母细胞瘤（GBM）的手术标本。这些患者此前未接受过包括替莫唑胺（TMZ）在内的任何化疗，此次为首次手术。图1a中钆增强MRI的T1加权图像显示术前右侧额叶存在强化肿瘤。术后影像（图1b）证实病灶已实现次全切除。手术组织被送往病理科用于临床诊断，剩余标本则根据俄亥俄州立大学医学中心经批准的机构审查委员会（IRB）方案进行组织采集。苏木精和伊红（H&amp;E）染色显示存在坏死、假栅栏样排列的细胞以及微血管增生（图1-c）。因此，这些肿瘤在组织病理学上被诊断为GBM。值得注意的是，肿瘤外植体在无TMZ条件下孵育不超过48小时时，仍能维持GBM的细胞结构。相比之下，当孵育时间达到72小时或更长时，我们观察到标本中固缩细胞核数量增加，提示部分肿瘤细胞开始发生凋亡。因此，经过较长时间孵育的肿瘤组织中出现散在的细胞缺失区域，这些区域优先出现在坏死区及其周围（数据未显示）。
为了验证这些肿瘤外植体样本是否可被可靠地用于药物疗效测试，我们检测了替莫唑胺（TMZ）处理的效果。图-2 展示了本研究中实验的流程。最近一项研究表明，与全身给药相比，TMZ 瘤内注射对恶性胶质瘤生长的抑制作用更强2。外植体经 16 小时孵育后，进行石蜡包埋并制备连续切片用于染色。对 TMZ 处理的胶质母细胞瘤（GBM）组织进行免疫组化分析，结果显示 Ki-67 阳性肿瘤细胞数量较对照样本显著减少。而使用凋亡标志物 Caspase-3 进行的免疫组化分析则未显示 TMZ 处理的胶质瘤样本与对照样本之间存在显著差异（图-3）。
通过将该类器官培养实验与体外培养或流式细胞术相结合，进一步表征了替莫唑胺（TMZ）的治疗效果。具体而言，我们旨在确定其对肿瘤干细胞样细胞（SCLTC）的影响。因此，在瘤内给予TMZ处理后，我们对这些肿瘤类器官进行了成球实验和流式细胞术分析。将经TMZ处理的样本解离为单个细胞，并以低密度（每微升1个细胞或更低）接种于96孔板中，在添加bFGF和EGF的无血清培养基中进行培养。在对照组中，肿瘤类器官在培养7天后观察到肿瘤成球现象。由于成球能力是SCLTC的特性之一3 4，药物处理后肿瘤成球数量的变化可反映其对SCLTC的影响。类似地，采用细胞表面标志物CD133对解离后的肿瘤类器官进行流式细胞术分析，以验证药物对SCLTC的作用。如果药物处理能够选择性清除胶质母细胞瘤（GBM）异质性肿瘤细胞中的SCLTC，则可预期流式细胞术检测到CD133阳性细胞比例下降（数据未显示）。
<img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig1.jpg" alt="脑部MRI和组织学；肿瘤分析；增强前/后MRI，组织病理学图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1 胶质母细胞瘤（GBM）患者的磁共振成像（MRI）。 代表性图像显示术前图-1a和术后图-1b。图-1c为新鲜GBM组织样本的苏木精-伊红（H&amp;E）染色。原始放大倍数为40倍。
<img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig2.jpg" alt="使用镊子将样本转移至多孔板中的组织培养实验示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图2 肿瘤组织块培养实验的实验流程。 图2a：病理科提供的新鲜手术切除胶质母细胞瘤（GBM）组织图像。图2b：使用手术刀将肿瘤组织块解剖为约10 mm的小块。图2c：使用胰岛素注射器对肿瘤组织块进行药物（TMZ）处理。
<img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig3.jpg" alt="组织学分析，caspase-3/Ki-67染色，DMSO/替莫唑胺处理，显微镜图像，细胞凋亡。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3 免疫组织化学分析。 对注射DMSO或替莫唑胺（TMZ）的胶质母细胞瘤（GBM）组织块进行活化型Caspase-3与Ki67的免疫组织化学染色。细胞核染色使用苏木精。原始放大倍数为40×。

<ol><li>Hemmati, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancerous+stem+cells+can+arise+from+pediatric+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15178-15183 (2003).</li>
<li>Heimberger, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temozolomide+delivered+by+intracerebral+microinfusion+is+safe+and+efficacious+against+malignant+gliomas+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Temozolomide delivered by intracerebral microinfusion is safe and efficacious against malignant gliomas in rats.</a> Clin Cancer Res. 6, 4148-4153 (2000).</li>
<li>Nakano, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+embryonic+leucine+zipper+kinase+is+a+key+regulator+of+the+proliferation+of+malignant+brain+tumors%2C+including+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells.</a> J Neurosci Res. 86, 48-60 (2008).</li>
<li>Laks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+formation+is+an+independent+predictor+of+clinical+outcome+in+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li>
<li>Phillips, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+subclasses+of+high-grade+glioma+predict+prognosis%2C+delineate+a+pattern+of+disease+progression%2C+and+resemble+stages+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis.</a> Cancer Cell. 9, 157-173 (2006).</li>
<li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteomic+Analysis+of+Glioblastoma+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycoproteomic Analysis of Glioblastoma Stem Cell Differentiation.</a> J Proteome Res. , (2010).</li>
<li>Ma, Y. H., Xu, Q. S., Zheng, J. S., Zhou, Y. Q., Zhan, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+stem+cell+markers+and+proliferative+labeling+on+glioma+cell+lines%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Bing+Li+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Expression of stem cell markers and proliferative labeling on glioma cell lines].</a> Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 37, 333-334 (2008).</li>
<li>Vik-Mo, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cells+maintain+overall+phenotype+and+tumorigenicity+after+in+vitro+culturing+in+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cells maintain overall phenotype and tumorigenicity after in vitro culturing in serum-free conditions.</a> Neuro Oncol. 12, 1220-1230 (2010).</li>
<li>Hovinga, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+notch+signaling+in+glioblastoma+targets+cancer+stem+cells+via+an+endothelial+cell+intermediate.+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells.</a> 28, 1019-1029 (2010).</li>
<li>de Groot, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+invasion+after+treatment+of+glioblastoma+with+bevacizumab%3A+radiographic+and+pathologic+correlation+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice.</a> Neuro Oncol. 12, 233-242 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

目前临床前实验模型中的药物疗效与患者体内的实际疗效之间存在差距。更具体而言，在脑肿瘤研究领域，亟需开发新颖且可靠的方法，以帮助弥补现有药物评价方法所获得的结果与患者疗效之间的差距。本研究中描述的检测方法是一项额外的有力工具，甚至可能是一种解决方案，有助于缩小实验数据与患者治疗效果之间的差异。

体外 细胞培养倾向于选择性扩增某些肿瘤细胞类型，而与培养条件无关，且仅代表整个肿瘤中的一部分细胞亚群。 5 此外，人工细胞扩增过程中会发生不可避免的遗传和表型转化，尤其是在长期细胞培养中。治疗恶性胶质瘤的主要障碍之一是肿瘤细胞的异质性，这种异质性既存在于单个肿瘤内部，也存在于不同肿瘤样本之间 6, 7因此，无论针对哪一种类型，对特定肿瘤细胞亚群进行选择性富集，可能都不是评估任何化疗药物对异质性肿瘤细胞疗效的适当方法。 8 9 源自肿瘤细胞亚群的脑肿瘤动物模型可揭示药物对特定亚群的疗效，但无法反映对整个肿瘤的治疗效果。 


然而，该肿瘤外植体方法仍存在若干局限性。其中之一是治疗观察期相对较短。由于恶性肿瘤细胞被认为会随着时间推移对大多数（即使不是全部）治疗手段产生耐药性，因此短期内对肿瘤细胞生长的抑制效果可能无法反映患者的长期预后情况，这一点在近期关于抗血管生成药物贝伐珠单抗的研究中已有报道。 10因此，有必要进一步研究改进该组织块培养实验的方案，以延长组织的保存时间。另一个问题是受试药物对肿瘤中SCLTC的特异性作用。鉴于SCLTC对目前恶性胶质瘤的治疗手段相对耐药，迫切需要鉴定出能够有效清除SCLTC的新型抗癌药物。为此，我们目前正在尝试将该组织块培养实验与后续步骤相结合 体外 实验，例如神经球形成实验（数据未显示）。我们期望通过这些联合实验进一步了解候选药物对SCLTC可能产生的影响。最后，使用小块肿瘤样本可能无法完全代表整个肿瘤细胞群体，这一点与传统的肿瘤细胞系或手术标本的原代培养情况类似。尽管存在这些问题，保留肿瘤间质（包括血管微环境）有助于表征肿瘤细胞所处的环境因素。因此，该实验方法在更接近生理条件的情况下评估各种治疗策略方面具有潜在应用价值。 


本研究建立了一种利用胶质母细胞瘤（GBM）手术标本的组织外植体进行药物疗效检测的实验方法。实际上，在检测所用的手术标本中，我们发现直接注射替莫唑胺（TMZ）可降低GBM样本中的细胞增殖活性。该组织外植体方法在理论上可适用于其他实体瘤，并有助于评估药物对患者肿瘤的疗效，有望避免癌症临床试验中的再次失败。

<table><tbody><tr><td>胎牛血清，经鉴定，热灭活</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1X) 液体 1:1</td><td>Invitrogen</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>琼脂-琼脂，纯化，颗粒状</td><td>EMD Millipore</td><td>1.01614.1000</td><td></td></tr><tr><td>染色用 DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>7211</td><td></td></tr><tr><td>10% w/v 甲醛 Caspase-3</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3810</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-3</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF835</td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Dako</td><td>15626</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Envision 系统-抗小鼠</td><td>Dako</td><td>2012-07</td><td></td></tr><tr><td>Envision 系统-抗兔</td><td>Dako</td><td>2011-12</td><td></td></tr><tr><td>DAB 试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 1.&lt;/strong&gt; 材料。</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR international</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Axygen Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤芯吸头</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 &amp;mu;m 聚酯网 Netwell 插件</td><td>Costar</td><td>3480</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基质</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 mL 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>皮下注射针头，铝制针座</td><td>Tyco Healthcare, Covidien</td><td>2000029</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>Basix</td><td>&lt;span&gt;5539800&lt;/span&gt;</td><td></td></tr><tr><td>薄壁管</td><td>Eton</td><td>1107A</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片，不锈钢</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2976#10</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>Comfort point</td><td>26027</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 平顶螺口管</td><td>Basix</td><td>5539802</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>DP-72</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 2.&lt;/strong&gt; 仪器设备。</td></tr></tbody></table>

利用手术标本肿瘤外植体进行新型抗癌药物研发的方法

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

目前针对恶性胶质瘤的治疗方法仅具有姑息性效果。在治疗方案的开发过程中，一个主要障碍是现有药物疗效检测方法所确定的疗效与患者实际疗效之间存在差异。因此，在临床前阶段迫切需要建立新颖且可靠的药物疗效评估方法。体外培养肿瘤组织（包括细胞系）会因细胞培养的人工环境导致肿瘤细胞在表型、遗传和表观遗传层面发生显著改变，可能无法真实反映原位肿瘤的生物学特性。使用免疫缺陷小鼠建立的异种移植模型也存在局限性，例如缺乏完整的免疫系统，以及微环境中的种间遗传和表观遗传差异。本文介绍一种新颖的方法，即利用恶性胶质瘤手术标本作为未解离的肿瘤组织块来评估治疗效果。为验证该方法的有效性，本文描述了使用当前一线化疗药物替莫唑胺（TMZ）所获得的实验数据。


我们采用新近切除的恶性胶质瘤手术标本进行实验。对手术标本进行瘤内注射替莫唑胺（TMZ）或其他候选药物，随后进行孵育和分析。在此，我们旨在建立一种肿瘤组织外植体方法，作为评估新型抗癌疗法有效性的平台，从而有望至少克服当前部分局限性，填补现有实验数据与实际患者肿瘤疗效之间的空白。该方法可能有助于加快发现用于实体瘤治疗的新型化疗药物。

本文建立了一种利用脑肿瘤手术标本进行药物疗效检测的方法，称为“肿瘤外植法”。通过该方法，我们可在不破坏实体瘤微环境的前提下评估药物疗效。为验证该方法的可靠性，我们展示了使用当前一线化疗药物替莫唑胺处理胶质瘤标本所获得的代表性数据。

目前针对恶性胶质瘤的治疗方法仅具有姑息性效果。在治疗策略的开发中，一个障碍在于所测定疗效存在的差异……

本实验的总体目标是建立一种名为肿瘤离体培养法（tumor X explan method）的新型药物疗效检测方法，该方法利用脑肿瘤手术标本进行。首先，在手术过程中获取新鲜切除的恶性胶质瘤标本，用于临床前实验。随后，将这些样本运送至组织获取核心实验室，以便将其分样用于临床诊断和科研用途。随后在研究实验室中，将肿瘤组织块解剖成多个较小的组织，并转移至优化的培养基中。最后，对组织块进行瘤内注射候选药物，并孵育16小时。最终可通过血铁染色和伊红染色，以及使用细胞类型特异性标志物的免疫组织化学方法获得结果，从而揭示治疗效果。我们还可以使用流式细胞术和神经球形成实验在体外评估药物疗效。目前大多数药物疗效检测方法在当前的临床前实验模型中的药物疗效与住院患者中的疗效之间仍存在差距。特别是当我们对恶性胶质瘤等实体瘤中的候选药物进行测试时，细胞间以及细胞内信号转导的相互作用不容忽视。为避免破坏实体瘤的微环境，我们利用肿瘤组织外植块建立了抗性培养方法。肿瘤从患者体内切除后，样本被转移至病理科，我们将肿瘤组织分割成两部分。其中一部分用于临床诊断的冰冻切片和石蜡包埋，其余的肿瘤组织则送至研究实验室供科研人员使用。利用该方法，我们能够保存肿瘤的微环境，包括邻近的肿瘤血管内皮细胞和免疫细胞，以及围绕肿瘤或迁移到肿瘤腔隙中的正常脑细胞。在处理胶质母细胞瘤组织之前，准备液体、培养基和琼脂溶液，并以1:1的比例混合。然后向六孔板的每个孔中加入一毫升。收到新鲜的多形性胶质母细胞瘤组织后，用镊子将其转移至培养皿中，并用手术刀片和镊子以五毫升冰浴的1倍PBS小心清洗三次。从解剖的样本中切割出直径约10毫米的连续切片，制成肿瘤组织块，将每块组织转移至含有琼脂培养基的六孔板的一个孔中，使其充分暴露于空气中，以保持其活性。接下来，使用1毫升胰岛素注射器和28号半英寸针头，向肿瘤组织块中分别加入5% DMSO、2.5纳摩尔替莫唑胺或一种新型抗癌候选药物，每种处理重复注射三次，随后将组织块置于含5%二氧化碳的湿润空气中，37°C孵育16小时。孵育结束后，用5毫升1倍PBS溶液洗涤组织块三次。然后将组织块放入50毫升离心管中，每管加入10毫升体积分数为10%的甲醛固定液（4%甲醛），固定24小时。将组织进行石蜡包埋并切取四微米厚切片，以脱蜡、复水。将切片置于切片架中，并依次在以下溶液中孵育。每次五分钟，共用苏木精染色三次。每次五分钟，用100%乙醇洗涤三次；用95%乙醇洗涤一次，每次五分钟；用70%乙醇洗涤一次，每次五分钟。最后用流动的自来水冲洗三分钟。有关抗原修复和内源性过氧化物酶抑制的详细步骤，请参见随附的书面实验方案。为封闭组织切片，使用10%正常山羊血清覆盖组织，将载玻片放入湿盒中，在室温下孵育一小时。随后用1× PBS缓冲液洗涤载玻片三次，每次五分钟。接着，加入用一倍浓度 PBS 稀释的特异性一抗，如人源性 caspase-3 或 KI-67，4°C 下孵育过夜。次日，用一倍浓度 PBS 漂洗切片，每次 10 分钟，共洗 3 次。随后，在组织上覆盖 2 至 3 滴 HRP 标记的二抗。将切片放入湿盒中，室温孵育1小时。用1倍PBS洗涤3次，每次5分钟。根据生产商说明书，使用DAB显色试剂盒对样本进行显色复染。将切片浸入苏木精中10至15秒。然后用流动的自来水冲洗三分钟。通过将切片浸入以下溶液中进行脱水处理，最后用封片剂和盖玻片封片。然后使用荧光显微镜对切片进行成像。本图中经钆增强的T1加权MRI图像显示了一名患者术前右侧额叶存在强化的多形性胶质母细胞瘤或GBM肿瘤。术后图像证实手术后病灶已实现次全切除。血红素和伊红染色显示存在坏死、假栅栏状细胞及微血管增生。因此，这些肿瘤在组织病理学上被诊断为胶质母细胞瘤（GBM），以评估这些肿瘤外植体样本是否可用于可靠的研究。为了进行药物疗效测试，我们检测了替莫唑胺（temozolomide，TMZ）的作用。对经TMZ处理的GBM组织进行免疫组化分析，结果显示与对照样本相比，KI67阳性肿瘤细胞显著减少。另一方面，使用凋亡标志物caspase-3进行的免疫组织化学染色显示，替莫唑胺处理的胶质瘤标本与对照样本之间无显著差异。通过将该离体实验与体外培养或流式细胞术相结合，可进一步表征替莫唑胺的治疗效应。我们可以将该离体方法与异种移植模型及体外成球实验相比较，用于新型抗癌药物的筛选。在实验室获得肿瘤组织后，本实验的步骤可在一小时内完成。该新检测方法在处理后的肿瘤植入物解离后相对容易操作且具有可重复性。我们可以将其与体外实验相结合。该检测方法的一个主要优势在于其能够保持肿瘤微环境的完整性。我们对经替莫唑胺（Temodar）处理的肿瘤外植体获得了阳性数据，结果与接受手术后使用替莫唑胺治疗的相同患者的临床转归一致。最后，该方法适用于其他实体瘤，因此可能有助于加快发现用于实体瘤治疗的新型化疗药物。

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