利用手术标本肿瘤外植体进行新型抗癌药物研发的方法

本实验的总体目标是建立一种名为肿瘤离体培养法（tumor X explan method）的新型药物疗效检测方法，该方法利用脑肿瘤手术标本进行。首先，在手术过程中获取新鲜切除的恶性胶质瘤标本，用于临床前实验。随后，将这些样本运送至组织获取核心实验室，以便将其分样用于临床诊断和科研用途。

随后在研究实验室中，将肿瘤组织块解剖成多个较小的组织，并转移至优化的培养基中。最后，对组织块进行瘤内注射候选药物，并孵育16小时。最终可通过血铁染色和伊红染色，以及使用细胞类型特异性标志物的免疫组织化学方法获得结果，从而揭示治疗效果。

我们还可以使用流式细胞术和神经球形成实验在体外评估药物疗效。目前大多数药物疗效检测方法在当前的临床前实验模型中的药物疗效与住院患者中的疗效之间仍存在差距。特别是当我们对恶性胶质瘤等实体瘤中的候选药物进行测试时，细胞间以及细胞内信号转导的相互作用不容忽视。

为避免破坏实体瘤的微环境，我们利用肿瘤组织外植块建立了抗性培养方法。肿瘤从患者体内切除后，样本被转移至病理科，我们将肿瘤组织分割成两部分。其中一部分用于临床诊断的冰冻切片和石蜡包埋，其余的肿瘤组织则送至研究实验室供科研人员使用。

利用该方法，我们能够保存肿瘤的微环境，包括邻近的肿瘤血管内皮细胞和免疫细胞，以及围绕肿瘤或迁移到肿瘤腔隙中的正常脑细胞。在处理胶质母细胞瘤组织之前，准备液体、培养基和琼脂溶液，并以1:1的比例混合。

然后向六孔板的每个孔中加入一毫升。收到新鲜的多形性胶质母细胞瘤组织后，用镊子将其转移至培养皿中，并用手术刀片和镊子以五毫升冰浴的1倍PBS小心清洗三次。从解剖的样本中切割出直径约10毫米的连续切片，制成肿瘤组织块，将每块组织转移至含有琼脂培养基的六孔板的一个孔中，使其充分暴露于空气中，以保持其活性。

接下来，使用1毫升胰岛素注射器和28号半英寸针头，向肿瘤组织块中分别加入5% DMSO、2.5纳摩尔替莫唑胺或一种新型抗癌候选药物，每种处理重复注射三次，随后将组织块置于含5%二氧化碳的湿润空气中，37°C孵育16小时。孵育结束后，用5毫升1倍PBS溶液洗涤组织块三次。然后将组织块放入50毫升离心管中，每管加入10毫升体积分数为10%的甲醛固定液（4%甲醛），固定24小时。

将组织进行石蜡包埋并切取四微米厚切片，以脱蜡、复水。将切片置于切片架中，并依次在以下溶液中孵育。每次五分钟，共用苏木精染色三次。

每次五分钟，用100%乙醇洗涤三次；用95%乙醇洗涤一次，每次五分钟；用70%乙醇洗涤一次，每次五分钟。最后用流动的自来水冲洗三分钟。

有关抗原修复和内源性过氧化物酶抑制的详细步骤，请参见随附的书面实验方案。为封闭组织切片，使用10%正常山羊血清覆盖组织，将载玻片放入湿盒中，在室温下孵育一小时。随后用1× PBS缓冲液洗涤载玻片三次，每次五分钟。

接着，加入用一倍浓度 PBS 稀释的特异性一抗，如人源性 caspase-3 或 KI-67，4°C 下孵育过夜。次日，用一倍浓度 PBS 漂洗切片，每次 10 分钟，共洗 3 次。随后，在组织上覆盖 2 至 3 滴 HRP 标记的二抗。

将切片放入湿盒中，室温孵育1小时。用1倍PBS洗涤3次，每次5分钟。根据生产商说明书，使用DAB显色试剂盒对样本进行显色复染。

将切片浸入苏木精中10至15秒。然后用流动的自来水冲洗三分钟。通过将切片浸入以下溶液中进行脱水处理，最后用封片剂和盖玻片封片。

然后使用荧光显微镜对切片进行成像。本图中经钆增强的T1加权MRI图像显示了一名患者术前右侧额叶存在强化的多形性胶质母细胞瘤或GBM肿瘤。术后图像证实手术后病灶已实现次全切除。

血红素和伊红染色显示存在坏死、假栅栏状细胞及微血管增生。因此，这些肿瘤在组织病理学上被诊断为胶质母细胞瘤（GBM），以评估这些肿瘤外植体样本是否可用于可靠的研究。为了进行药物疗效测试，我们检测了替莫唑胺（temozolomide，TMZ）的作用。对经TMZ处理的GBM组织进行免疫组化分析，结果显示与对照样本相比，KI67阳性肿瘤细胞显著减少。

另一方面，使用凋亡标志物caspase-3进行的免疫组织化学染色显示，替莫唑胺处理的胶质瘤标本与对照样本之间无显著差异。通过将该离体实验与体外培养或流式细胞术相结合，可进一步表征替莫唑胺的治疗效应。我们可以将该离体方法与异种移植模型及体外成球实验相比较，用于新型抗癌药物的筛选。

在实验室获得肿瘤组织后，本实验的步骤可在一小时内完成。该新检测方法在处理后的肿瘤植入物解离后相对容易操作且具有可重复性。我们可以将其与体外实验相结合。

该检测方法的一个主要优势在于其能够保持肿瘤微环境的完整性。我们对经替莫唑胺（Temodar）处理的肿瘤外植体获得了阳性数据，结果与接受手术后使用替莫唑胺治疗的相同患者的临床转归一致。最后，该方法适用于其他实体瘤，因此可能有助于加快发现用于实体瘤治疗的新型化疗药物。