新型抗癌药物使用手术标本肿瘤植的发展方法
2011年7月29日
在这里，我们的脑肿瘤的手术切除标本，被称为“肿瘤块法”建立了药物疗效检测的一种方法。使用这种方法，我们可以评估药物的疗效没有打破实体肿瘤的微环境。为了验证这种方法的可靠性，我们描述了具有代表性的数据，与我们当前的第一线化疗药物替莫唑胺治疗脑胶质瘤标本。
本程序的总体目标是建立一种新的药物疗效测试方法，用于脑肿瘤的外科切除标本，称为肿瘤X explan方法。这是通过首先获取恶性胶质瘤的新鲜外科切除标本来完成的，用于临床前实验。接下来，将样本运送到组织采购核心设施，将它们分开用于临床诊断和研究目的。
然后在研究实验室中，将肿瘤移植体切割成多个较小的组织，并转移到优化的培养基中。最后，进行肿瘤内注射药物候选物，并将移植体孵育16小时。最终，可以通过血红素和Ein染色，以及具有细胞类型特异性标记的免疫组化获得结果，揭示治疗的效果。
我们还可以使用流式细胞术和神经球形成测定评估药物疗效in vitro。目前大多数药物疗效测定方法在当前临床前实验模型中的药物疗效和患者中的疗效之间存在差距。特别是当我们在恶性胶质瘤等实体癌上测试药物候选物时，我们不能低估细胞间以及细胞内信号交换。
为了避免破坏实体肿瘤的微环境，我们使用肿瘤移植建立了抗培养方法。在从患者那里取出肿瘤样本后，样本从病理学系转移到研究实验室。我们将肿瘤块分成两部分。其中一部分肿瘤样本用于冰冻切片和石蜡包埋，用于临床诊断，其余肿瘤组织被送到研究实验室供研究人员使用。
使用该方法，我们可以保护肿瘤与相邻的肿瘤内皮和免疫细胞以及围绕肿瘤或迁移到肿瘤腔中的正常脑细胞的微环境。在处理脑胶质母细胞瘤组织之前，准备液体、培养基和琼脂溶液。以一比一的比例混合它们。
然后向六孔板的每个孔加入一毫升。接收新鲜的多形性脑胶质母细胞瘤组织后，使用镊子将其转移到培养皿中，并用冰冷的一次PBS用外科刀和镊子仔细洗涤三次。从切开的样本中切取直径约10毫米的连续切片，以创建肿瘤块，将每个块转移到含有琼脂培养基的六孔板的一个孔中，使其有足够的暴露在空气中以保持其活力。
接下来，使用一毫升胰岛素注射器和28规格半英寸针头，用5%DMSO或2.5纳摩尔替莫唑胺或新型抗癌药物候选物三次注射肿瘤块，并在37摄氏度的湿润空气中孵育16小时，含5%二氧化碳。孵育后，用五毫升的一次PBS洗涤块三次。然后在50毫升管中，用10毫升10%体积比、四毫的10%体积比溶液固定块24小时。
将组织石蜡包埋，切割四微米切片以去除、脱水和重水化切片。将切片放入架子中，在以下溶液中孵育。三次使用Silene，每次5分钟。
每次5分钟使用100%乙醇三次。使用95%乙醇一次，5分钟，70%乙醇一次，5分钟。最后，用流动的自来水冲洗并运行3分钟。
请参阅随附的书面协议以获取有关抗原回收和内部过氧化物抑制的详细信息。要阻断切片，用10%正常山羊血清覆盖组织，将切片转移到湿润盒中，在室温下孵育一小时。用一次PBS洗涤切片三次，每次五分钟。
接下来，添加主要抗体，如人类特异性caspase三或KI 67，用一次PBS稀释，然后在四摄氏度下孵育过夜。第二天，用一次PBS洗涤切片三次，每次10分钟。接下来，用两到三滴HRP标记的二级抗体覆盖组织。
将切片放入湿润盒中，在室温下孵育一小时。用一次PBS洗涤三次，每次五分钟。按照制造商的说明使用染色原DAB试剂盒开发样品，以进行对比染色。
将切片浸入血红素中10至15秒。然后用流动的自来水冲洗3分钟。通过浸入切片在以下溶液中进行脱水，并在安装试剂和盖玻片上进行安装。
然后使用荧光显微镜对切片进行成像。此图中的T一权重MRI图像，使用钆增强显示了患者术前右额叶的增强型脑胶质母细胞瘤多形性或GBM肿瘤。术后图像证实术后病变的部分切除。
血红素和伊红染色显示存在坏死、伪回绕细胞和微血管增生。因此，这些肿瘤被组织病理学诊断为GBM，以调查这些肿瘤移植样本是否可以可靠地使用。为了进行药物疗效测试，我们测试了替莫唑胺或TMZ的效果，TMZ处理的GBM组织的免疫组化显示，与对照样本相比，KI 67阳性肿瘤细胞显著减少。
反过来，使用凋亡标记caspase三的免疫组化并没有在TMZ处理的胶质瘤样本和对照样本之间发现任何显著差异。替莫唑�
Overview
This study establishes a novel method for drug efficacy testing using surgical specimens of brain tumors, referred to as the tumor explant method. This approach allows for the evaluation of drug efficacy while preserving the tumor microenvironment.
Key Study Components
Area of Science
- Neuroscience
- Oncology
- Pharmacology
Background
- Current drug efficacy assays often fail to bridge the gap between preclinical models and patient outcomes.
- Solid tumors, such as malignant gliomas, require careful consideration of intercellular signaling.
- Maintaining the tumor microenvironment is crucial for accurate drug testing.
- The tumor explant method preserves adjacent tumor cells and normal brain cells.
Purpose of Study
- To develop a reliable method for testing drug efficacy on brain tumors.
- To validate the tumor explant method using glioma specimens treated with temozolomide.
- To assess the impact of drug treatments while maintaining the tumor's microenvironment.
Methods Used
- Freshly removed surgical specimens of malignant gliomas were secured during surgery.
- Tumor explants were dissected and incubated with drug candidates.
- Drug efficacy was evaluated using immunohistochemistry and flow cytometry.
- Histopathological analysis was performed to assess treatment effects.
Main Results
- Immunohistochemistry showed a reduction in Ki-67 positive tumor cells after treatment with temozolomide.
- No significant difference was observed in apoptosis markers between treated and control samples.
- The tumor explant method demonstrated potential for reliable drug efficacy testing.
- Results can be compared with other preclinical models for further validation.
Conclusions
- The tumor explant method is a promising approach for drug efficacy testing in gliomas.
- This method preserves the tumor microenvironment, enhancing the relevance of findings.
- Further studies are needed to optimize and validate this approach for clinical applications.
