在发展中国家小鼠视网膜体内电穿孔

一个执行要么增益或丧失功能的研究目的，方法纳入到小鼠的视网膜细胞的质粒DNA

该程序的总体目标是对新生小鼠进行体内电穿孔实验，以便将遗传物质稳定地引入视网膜细胞。这是通过第一次麻醉来完成的，新生小鼠在冰上弹出大约 5 到 10 分钟。手术的第二步是识别融合眼睑的交界处，并沿着这个交界处切开眼睛。

然后在眼睛上做一个切口，以方便插入显微注射注射器。然后通过切口插入微量注射注射器，并将 DNA 溶液注射到视网膜下间隙。最后，将镊子电极放在 pop 的头上并传递一系列电脉冲。

与逆转录病毒转导等现有方法相比，该技术的主要优点是体内电穿孔不需要产生和处理生物制剂作为基因递送的工具。因此，该技术需要更少的劳动力、更少的试剂，并且可以在任何批准用于动物程序的工作站中进行。一般来说，刚接触该技术的人会很挣扎，因为需要时间和重复来形成将显微注射注射器放置在视网膜下间隙的感觉。

演示该程序的是我实验室的博士后研究员 Jimmy DeMilo。由于电穿孔所需的 DNA 浓度相对较高，因此首先扩增使用 maxi prep 提取的无能细胞所需的质粒 DNA，然后纯化并浓缩至约 5 μg/μL。添加固绿 FCF 染料作为进样示踪剂。

质粒 DNA 制备完成后，将新生小鼠幼崽麻醉在冰上约 5 分钟，监测它们直到通过脚垫压迫确认失去知觉。用 70% isop 轮廓酒精交换要注射的眼睛区域，并使用解剖显微镜识别眼睑聚集的 FUS 交界上皮。使用锋利的 30 号针头，沿着融合的交界上皮小心地打开眼睛，不要施加过大的向下压力或超出眼睑范围的切割。

一旦眼睑打开并露出眼睛，用针尖在交界处附近的巩膜上做一个小切口，角膜要小心不要穿透得太深而刺穿晶状体。将钝头注射针插入切口。直到感觉到对面巩膜壁的阻力，慢慢将 0.3 微升粘性 DNA 溶液注入视网膜下间隙。

小心不要太紧地压在巩膜壁上，旋转动物以检查 DNA 溶液在视网膜内是否均匀分布。首先，将镊子电极浸泡在 PBS 中以最大限度地提高导电性。然后将注射的小狗的头部放在电极之间，注射的眼靠近正极电极，未注射的眼靠近负极电极。

使用脉冲发生器施加 5 个方脉冲，每个脉冲的电压为 80 伏特，持续时间为 50 毫秒，脉冲间隔为 950 毫秒。最后，在加热灯下加热幼犬，直到它们从冰麻醉中恢复过来。恢复后，在出生后第 3 天将电穿孔的幼崽送回母亲身边。

大多数 EGFP 电穿孔细胞位于视网膜神经可塑性层，不表现出视网膜任何分化神经胶质细胞的明显形态特征。到出生后第 14 天，可以在视网膜的外核层和内核层以及各种标记细胞中找到电穿孔细胞。现在显示分化神经元的特征形态学特征。

在尝试此过程时，平稳均匀地执行所有步骤非常重要。显微注射过程中很容易损伤视网膜，需要练习才能培养避免组织损伤所需的手部灵巧性。遵循此过程。

可以进行其他方法，例如免疫组织化学或原位杂交，以确定目标基因的表达在视网膜电中是上调还是下调。