溴脱氧尿苷（BrdU）标记及随后的荧光激活细胞分选用于无需培养的溶解性有机碳降解浮游细菌鉴定

微生物介导了多种溶解性有机碳底物或溶解性有机碳（DOC）化合物的降解过程，例如在拉辛地区及水生环境中的降解。为了全面理解微生物在DOC转化过程中的作用，必须同时鉴定其分类学特征和功能。本视频演示了一种对能够转化特定DOC组分及水生环境中自由生活的细菌或细菌浮游生物进行分类学鉴定的实验方法。

从测试环境中采集的水样经过处理后，与目标化合物和溴脱氧尿苷（BRDU）共同孵育，BRDU 可掺入新合成的 DNA 和活跃生长的细胞中。随后，用与 ZI 偶联的抗 BRDU 抗体对掺入 BRDU 的细菌浮游生物进行标记。通过荧光激活细胞分选技术，分离出 BRDU 标记水平较高的细菌浮游生物。

随后从分选后的细胞中提取DNA，并基于PCR扩增的16S核糖体RNA基因分析结果进行分类学鉴定。大家好，我是肯特州立大学生物科学系陈茂博士实验室的Steven Robbins。今天，我和Lu将向您展示一种无需培养的、用于鉴定水生环境中降解DOC的细菌浮游生物的方法。

与现有的营养添加法结合细菌群落DNA分析等方法相比，该技术的主要优势在于，其将分析重点放在高活性的细菌上，排除了休眠或生长缓慢的细胞。本文展示了利用某一特定溶解性有机碳（DOC）化合物的芭蕉（plantain）相关细菌的鉴定。但该方法也可用于研究利用其他单一DOC化合物或一类溶解性有机化合物（如藻类分泌物）的浮游细菌（plankton）。

那么，让我们先采集一些水样并开始实验。在测定水样中降解DOC的细菌浮游生物之前，必须对水样进行适当的处理。此处所示的样品采自美国佐治亚州海岸，用于去除水样中的大颗粒物质和ER-VREs。

使用蠕动泵将水从收集用大容量烧瓶转移至装有孔径为一微米滤膜的过滤装置中。随后，将滤液分装为36毫升等份，分别加入三个无菌的50毫升聚丙烯管中，每个管中预先加入4毫升新配制的10%多聚甲醛溶液。在室温下孵育两小时以固定细胞，孵育结束后即完成细胞保存。

将水倒入带有孔径为0.22微米的白色膜滤器的玻璃真空过滤装置的过滤塔中，并施加真空使溶液通过。通过真空滤器加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗滤膜。将滤膜标记为阴性对照，并于-20摄氏度保存。

为建立一个实验生态系统或微宇宙，首先用预过滤的水样将六个一升的预冲洗玻璃烧瓶各装入800毫升。向每个微宇宙中加入BRDU，使其终浓度为10微摩尔。用手快速旋转烧瓶以混匀。

每个样品将进行三次重复测定。因此，向其中三个微宇宙体系中加入模型DOC化合物。此处，将雷尼酸以100纳摩尔的终浓度加入微宇宙体系中。

然后向其余三个微宇宙系统中加入无菌 PBS。这些将作为无 DOC 的对照组。将所有微宇宙系统置于黑暗条件下、原位温度（25 摄氏度）的摇床培养箱中，转速为 100 RPM。分别在 0、8、16 和 24 小时的时间点进行取样。

从每个微宇宙系统中收集36毫升样品，置于含有4毫升新鲜10%多聚甲醛的50毫升无菌聚丙烯管中，在室温下孵育2小时以固定细胞。接着，将固定后的细胞通过孔径为0.22微米的白色膜滤器进行过滤。使用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）通过真空过滤装置冲洗滤膜，以去除残留的多聚甲醛（PFA）。

立即进行滤膜原位免疫检测，或在负20摄氏度下保存滤膜，用于后续检测细菌浮游生物对BrdU的掺入。首先将样品滤膜置于室温下以破坏细菌细胞壁。将滤膜放置于过滤装置上，然后用移液器将一毫升溶菌酶溶液滴加到滤膜上，完全覆盖细胞，并在室温下孵育30分钟。

孵育结束后，施加真空以去除溶液。待溶液通过滤膜后，加入 10 毫升 PBS 洗涤细胞，并施加真空。随后，为进一步破坏细胞壁，向滤膜上加入 1 毫升蛋白酶 K 溶液，以覆盖细胞。

室温孵育30分钟。用PBS洗涤以产生单层DNA。加入1毫升外切酶溶液，覆盖滤膜上的细胞。

在37摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，通过真空滤器抽滤10毫升PBS洗涤滤膜。接着，修剪滤膜边缘，去除无细胞的部分。

然后在用酒精清洁过的干燥表面上，使用无菌刀片将滤膜切成八个大小相等的部分。每个样品需要八个框架密封培养室，将滤膜的八分之一置于组装好的框架密封培养室内，样品面朝上。待培养室组装完毕后，使用罗氏Intu细胞增殖检测试剂盒的荧光染料对A-B-R-D-U标记的细胞进行原位检测。

待静置步骤完成后，用无菌刀片将滤膜从孵育室中取出，并置于无菌表面上，将滤膜切成小片。将滤膜碎片转移至含有1毫升PBS的2毫升微量离心管中， tightly close the tube 并用多聚甲醛密封。随后将离心管置于37摄氏度、200 RPM的摇床培养箱中孵育10分钟。

孵育结束后，固定好离心管并在最大转速下涡旋震荡。用移液器将上清液转移至无菌的15毫升聚丙烯离心管中，持续5分钟。然后用PBS重悬滤膜，并重复涡旋和孵育步骤两次，每次均将所得上清液加入同一个15毫升离心管中，每个样本分别处理。

将重悬的细胞置于 4°C 保存。样品应在两天内通过流式细胞仪进行分析。最后，分选细胞以获得高 BRDU 掺入水平的细胞群体。

此处使用 BD fax 区域流式细胞仪及相应软件。细胞分选完成后，可对溴脱氧尿苷（BrdU）富集的细胞群体进行检测，以确定其分类学身份。为了扩增分选细菌的 16S 核糖体 RNA 基因，需进行滤膜 PCR：将分选后的细胞用移液器加至白色 0.22 µm 孔径的聚碳酸酯膜上，开启真空泵，并使用无菌刀片切去滤膜上无细胞的边缘部分。

将滤膜按每种条件均分为四个大小相等的部分，取其中一份滤膜放入三个PCR反应管中，细胞面朝向管内。加入45 µL PCR级水，使滤膜完全浸没于水中。

接下来，加入两粒 Roche illustra pure T ready to go PCR 胶珠，短暂涡旋以促进胶珠溶解。然后分别加入 2 µL 的正向和反向 16S 核糖体 RNA 基因引物。

加入1微升BSA以帮助吸收扩增抑制物，或加入1微升水。在热循环仪上进行PCR扩增。建议采用降落PCR程序，其中退火温度从62°C开始，每个循环降低1°C，逐步降至52°C，随后在52°C下进行15个循环。

通过溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增结果，从凝胶中切下PCR扩增产物，并使用KaiGen cayo快速凝胶回收试剂盒进行纯化。PCR产物经凝胶纯化后，将同一样本的扩增产物合并。纯化的16S核糖体DNA扩增产物现已可用于多种分子分析。

样品采自佐治亚州的一处沿海地点，并按照本视频所述步骤进行处理，以研究降解Racine的细菌。Racine是一种聚酰胺类化合物，可广泛存在于海洋环境中。如本研究所示，它可作为海洋细菌的营养和能量来源。

样品的因子分析显示，在24小时培养后，在添加了Racine的微宇宙系统中，出现了一类FXI荧光强度较高且与BRDU掺入程度呈正相关的细菌。这些细胞被定义为高BRDU掺入细胞（HI），预计主要包含降解Racine的细菌。无hi。

在未添加任何物质的对照组中发现了细胞，其中仅含有溴脱氧尿苷（BrdU）掺入水平较低的细胞，称为lii细胞，预计主要包含无法利用的细菌浮游生物。添加的Racine HI细胞被分选至不同的试管中，随后收集到膜滤器上。通过滤膜PCR获得部分16S核糖体RNA基因扩增子，并经琼脂糖凝胶电泳确认。

经过分选过滤后，还可对功能基因进行PCR扩增，以分析分选细胞之间的功能多样性。我们刚刚向您展示了如何结合荧光激活细胞分选技术与BrdU掺入法，对水生环境中具有特定功能的细菌细胞进行物理分离与鉴定。请记住，进行该实验操作时，必须佩戴BIDU防护装备、实验服和手套。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。