Name: 溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记和文化独立的鉴定溶解有机随后的荧光激活细胞分选碳有辱人格的浮游细菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: 了解利用溴脱氧尿嘧啶核苷标记和荧光激活细胞分选技术分离降解溶解有机碳的浮游细菌的方法。该技术结合免疫荧光标记与流式细胞分选，实现免培养条件下特定功能细菌的分类鉴定。

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本项目由美国国家科学基金会资助，资助编号为 OCE1029607（授予 X.M.）和 MCB0702125（授予 M.A.M.），以及戈登与贝蒂·摩尔基金会（授予 M.A.M.）提供支持。

1. 水样处理
<ol>
 <li>使用孔径为 1 μm 的膜滤器过滤 10 L 环境水样，以去除大颗粒和噬菌生物。将滤过水样收集至储液瓶中。</li>
 <li>将 36 ml 滤液分别转移至 3 个无菌离心管（50 ml）中，每管预先加入 4 ml 新鲜配制的 10% 多聚甲醛溶液（PFA）。室温孵育 2 小时以固定细胞。通过真空抽滤将细胞收集到孔径为 0.22 μm 的白色膜滤器上。再用 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）通过真空抽滤洗涤滤膜。将滤膜标记为阴性对照，并于 -20°C 保存。</li>
</ol>
步骤 1.3-1.4 为建立 DOC 限制条件的可选步骤。
<ol start="3">
 <li>添加无机氮和磷的混合物（5 μM NH4Cl 5 μM NaNO3，以及 1μM NaH2PO4 最终浓度）加入细口瓶中。</li> 
 <li>避光孵育于 原位 48小时，期间偶尔振荡。</li>
</ol>
2. 微型生态系统建立与培养
<ol>
<li>取步骤1.4中大瓶容器内的水样，向六个1升玻璃烧瓶中各加入800 ml，以建立微宇宙系统。向每个微宇宙系统中加入BrdU（终浓度10 μM），充分混匀。</li>
<li>向其中三个微宇宙系统中各加入1 ml模型溶解性有机碳（DOC）化合物溶液，作为DOC添加组；向其余三个微宇宙系统中各加入1 ml无菌PBS溶液，作为无添加对照组。</li>
<li>将所有微宇宙系统置于摇床培养箱中，在原位温度（in situ temperature）条件下避光培养，摇床转速设为100 rpm。</li>
<li>在0、8、16和24小时时间点，分别从每个微宇宙系统中采集36 ml水样，转移至50 ml无菌离心管中。立即向收集的样品管中加入4 ml新鲜的PFA（10%），室温孵育2小时以固定细胞。</li>
<li>将固定后的样品通过0.22-μm孔径的聚碳酸酯膜过滤，用10 ml PBS洗涤滤膜。随后立即进行下一步操作，或在-20°C下保存滤膜。</li>
</ol>
3. 原位 BrdU 掺入的免疫检测
<ol>
<li>在室温下解冻滤膜（DOC 修正样品、无添加对照和阴性对照）。</li>
<li>加入 1 ml 溶菌酶溶液 [10 mg/ml 鸡蛋清溶菌酶溶于 100 mM Tris、50 nM EDTA（pH = 8）]4，以覆盖滤膜上的细菌细胞。室温孵育 30 分钟。通过抽滤方式用 10 ml PBS 洗涤滤膜。</li>
<li>加入 1 ml 蛋白酶 K 溶液 [2 mg/ml 蛋白酶 K 溶于 100 mM Tris、50 nM EDTA（pH = 8）]4，以覆盖滤膜上的细菌细胞。室温孵育 30 分钟。通过抽滤方式用 10 ml PBS 洗涤滤膜。</li>
<li>加入 1 ml 外切核酸酶溶液 [外切核酸酶 III（50 U/ml）溶于 5 mM MgCl2 和 50 mM Tris-HCl]5，以覆盖滤膜上的细菌细胞。37 °C 孵育 30 分钟。通过抽滤方式用 10 ml PBS 洗涤滤膜。</li>
<li>按照制造商说明组装 Frame-Seal 孵育室（Bio-Rad）。</li>
<li>在经酒精清洁的干燥表面上，使用无菌刀片将滤膜切成八等份。</li>
<li>用镊子将滤膜的八分之一部分放入一个已组装的 Frame-Seal 孵育室中（每个滤膜样品需要八个孵育室）。滤膜切片含有细胞的一面应朝上。滤膜背面的水分将使滤膜粘附于载玻片上。若滤膜变干，在将滤膜切片置于载玻片前，先在孵育室中央加入一小滴（2 μl）去离子水（diH2O）。</li>
</ol>
步骤3.8-3.20使用罗氏（ROCHE）原位细胞增殖检测试剂盒（FLUOS）中的试剂，操作步骤根据制造商说明书进行了修改。除PBS外，所有试剂均由试剂盒提供。
<ol start="8">
<li>加入孵育缓冲液（含0.5%牛血清白蛋白、0.1% Tween20的PBS），用量应足以均匀覆盖孵育室内的整个滤膜区域，且在密封后不会溢出。</li> 
<li>将聚酯框架盖置于孵育室框架上，按压以紧密密封孵育室，避免滤膜上方产生气泡。将密封的孵育室于室温避光孵育10分钟。</li>
<li>移除聚酯密封膜并打开孵育腔。（注意：打开孵育腔时有时会将框架密封膜从载玻片上带起。若发生此情况，请为后续步骤准备新的孵育腔。）</li>
<li>从培养 chamber 的一个角落吸出孵育缓冲液，避免接触滤膜。</li>
<li>轻轻吹打滤膜以清洗 100 μl 用 PBS 将腔室冲洗 3 次。</li>
<li>使用前，按照生产商推荐的步骤立即配制抗BrdU-FLUOS工作液。 </li>
<li>移液 120 μl 将抗BrdU-FLUOS工作液加至滤膜上，注意均匀覆盖整个表面。 </li>
<li>用新的聚酯薄膜重新密封培养室，避免滤膜表面产生气泡。将培养室置于暗处孵育 37 °C 3小时。此步骤将标记掺入BrdU的DNA 原位 使用异硫氰酸荧光素（FITC）。</li>
<li>移除聚酯覆盖物，打开孵育室。用移液器吸出抗-BrdU-FLUOS工作液。用PBS洗涤滤膜3次。</li>
<li>将滤膜从孵育室转移至无菌表面，使用无菌刀片将滤膜切成小块。</li>
<li>将滤膜碎片转移至含有1 ml PBS的2 ml微量离心管中。盖紧管盖，并用封口膜密封。在指定条件下孵育 37 °C 200 转/分钟，10 分钟。</li> 
<li>将离心管固定在涡旋振荡器上，以最大速度涡旋振荡5分钟。用移液器将上清液转移至无菌的15 ml离心管中。重复孵育和涡旋步骤5次。将同一份样品的上清液合并至同一个15 ml离心管中。通常，悬浮液中可回收约80%的细胞。</li>
<li>将上清液与重悬的细胞一起保存于 4 °C在2天内完成分选。</li>
</ol>

4. FACS 分析
本文介绍了一种 BD FACSAria 流式细胞仪及其配套软件的操作流程。
<ol>
<li>根据制造商推荐的步骤优化流式细胞仪的设置。包括：调节放大控制以设定所需的断点参数和最佳信号点；针对实验所用鞘液压力优化激光延迟和面积缩放因子；优化FSC和SSC电压、FSC阈值、FSC荧光缩放、荧光PMT电压等参数。</li>
<li>在流式细胞仪（FCM）上运行阴性对照样本，依据FITC荧光强度和侧向散射（SSC）进行分析。逐步提高FITC阈值，直至在FITC-SSC采集图中阴性对照样本中无细胞可见。</li>
<li>运行未添加试剂的对照样本，基于FITC和SSC采集10,000个细胞的分布模式。设定一个门控区域以包含所有细胞，并将其定义为“低荧光强度细胞”（LIs）。</li>
<li>运行添加DOC的样本，基于FITC和SSC观察10,000个细胞的分布模式。部分细胞将出现在预设的LI门控区域内。另设一个门控区域，以包含荧光强度高于LIs的细胞（HIs）。采集统计数据以查看门控细胞的相对丰度。</li>
<li>以“纯化单滴”模式将HI细胞分选至含有500 μl PBS的收集管中。当HI细胞数量达到500,000个时，终止分选。</li>
</ol>
5. 16S rRNA 基因的滤膜 PCR 扩增
滤膜PCR步骤经Kirchman等6的方法修改而来
<ol>
<li>将分选后的细胞过滤到一张白色的、孔径为0.22 μm、直径为25 mm的聚碳酸酯膜滤膜上。使用无菌刀片切去滤膜上不含细菌细胞的边缘部分，然后将滤膜切成8个大小相等的小片。</li>
<li>取一片滤膜放入PCR反应管中，使细胞面朝向管内。向PCR反应管中加入45 μl PCR级水，确保滤膜完全浸没在水中。</li>
<li>向PCR反应管中加入2粒ROCHE illustra PuReTaq Read-To-Go PCR微球，短暂涡旋混匀。再向每个PCR反应管中各加入2 μl的16S rRNA基因正向和反向引物（每种引物的终浓度为0.4 μM），例如27F和1492R7。</li>
<li>（可选）向PCR反应体系中加入1 μl牛血清白蛋白溶液（BSA，终浓度为30 μg/100 μl），以帮助吸附扩增抑制物。若不添加BSA，则加入1 μl水作为替代。</li>
<li>在热循环仪上进行PCR扩增。推荐采用降落PCR程序：前11个循环中退火温度从62°C逐循环降低1°C至52°C，随后进行15个退火温度为52°C的循环。所有循环均包括变性（95°C）、退火（62至52°C）和延伸（72°C）步骤，每个步骤持续50秒。PCR程序还包括初始3分钟的变性步骤和最终10分钟的延伸步骤。</li>
<li>通过溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增结果。从凝胶中切下PCR扩增产物，并使用QIAGEN QIAquick凝胶回收试剂盒进行纯化。</li>
<li>对每个样品额外进行两次PCR扩增，每次使用新的滤膜片段。PCR扩增后经凝胶纯化，将同一样品的扩增产物合并。纯化后的16S rDNA扩增产物即可用于多种分子分析，以实现分类学鉴定，例如构建克隆文库并进行测序。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
以腐胺降解细菌的研究为例，描述代表性结果。采集美国佐治亚州沿海地点的水样，并按照上述步骤进行处理。流式细胞分选分析显示，添加腐胺后诱导产生了一类具有高荧光素（FITC）荧光强度的细菌群体，表明其具有较高的溴脱氧尿苷（BrdU）掺入率（图1）。这类细胞被定义为高BrdU掺入细胞（HIs），预计其中主要含有腐胺降解细菌。在未添加腐胺的对照组中未观察到HIs，仅存在BrdU掺入水平较低的细胞（LIs）。LIs预计主要包含无法利用所添加腐胺的浮游细菌。将HIs分选至不同的离心管中，随后收集到膜滤器上。利用滤膜PCR方法，对高HIs细胞进行16S rRNA基因扩增子的获取。
<img src="/files/ftp_upload/2855/2855fig1.jpg" alt="荧光强度流式细胞术散点图；FITC 对 SSC；BrdU 分析；微生物生长。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 培养 24 小时后采集的无添加对照组及添加模型化合物（以亚精胺为例）样品的流式细胞术分析结果。细胞分布分析基于：(1) FITC 标记的荧光强度（x 轴），其与 BrdU 掺入水平呈正相关；(2) 侧向散射（SSC，y 轴），其与细胞大小呈正相关。门控标记依据 BrdU 掺入水平划分（HI，高 BrdU 掺入；LI，低 BrdU 掺入）。HI 和 LI 细胞的相对百分比分别显示于对应的门内。

<ol><li>Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DNA-synthesizing+bacterial+cells+in+coastal+North+Sea+plankton%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).</li>
<li>Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+and+isolation+of+DNA+from+metabolically+active+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).</li>
<li>Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterioplankton+assemblages+transforming+dissolved+organic+compounds+in+coastal+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater.</a> Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).</li>
<li>Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+PCR+for+visualization+of+microscale+distribution+of+specific+genes+and+gene+products+in+prokaryotic+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).</li>
<li>Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodeoxyuridine+%28BrdU%29+immunocytochemistry+by+exonuclease+III+%28Exo+III%29+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion.</a> Histochemistry. 98, 199-199 (1992).</li>
<li>Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacterial+communities+in+aquatic+systems+as+revealed+by+filter+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat.+Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR.</a> Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).</li>
<li>Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+stains%3A+ribosomal+RNA-based+probes+for+the+identification+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells.</a> Science. 243, 1360-1360 (1989).</li>
<li>Artursson, V., Jansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bromodeoxyuridine+immunocapture+to+identify+active+bacteria+associated+with+arbuscular+mycorrhizal+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).</li>
<li>Mou, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+carbon+processing+by+generalist+species+in+the+coastal+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean.</a> Nature. 451, 708-708 (2008).</li>
<li>Mou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+cell+sorting+and+subsequent+molecular+analyses+for+culture-independent+identification+of+bacterioplankton+involved+in+dimethylsulfoniopropionate+transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).</li>
<li>Dean, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们的方法结合了BrdU掺入、流式细胞术（FACS）和16S rDNA分析，可实现对水生环境中代谢特定溶解性有机碳（DOC）组分的浮游细菌在物种水平上的鉴定。BrdU掺入实验依据细菌的代谢活性对其进行标记，从而仅对活跃生长的细菌进行分析，排除了处于休眠状态的细胞。在本方法中，BrdU掺入用于标记正在活跃摄取和代谢外源性DOC组分的细菌细胞。 原位 通过FACS对免疫检测到的细菌进行可视化、分组和分选，这些细菌具有不同水平的BrdU掺入。已有报道采用磁珠免疫捕获BrdU标记的DNA，随后进行分子分析，以检测BrdU掺入的细胞。 2,8,9后一种方法的局限性在于无法区分不同活性水平的细胞。在这种情况下，分析将包括那些仅通过利用水样中内源性溶解性有机碳而保持微弱活性的细胞（图1，LIs）。 
耦合方法已被用于鉴定能够降解近海海水中溶解性有机碳化合物（如二甲基巯基丙酸、香草酸、甘氨酸甜菜碱）的细菌的分类结构 3其应用可广泛推广至研究利用其他单一或混合溶解性底物的水生环境中细菌的分类学。除了16S rRNA基因外，功能基因标记也可...

<table><tbody><tr><td>BrdU</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002-5G</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-5G</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-25MG</td><td></td></tr><tr><td>原位细胞增殖试剂盒，FLUOS</td><td>试剂盒</td><td>罗氏集团</td><td>11810740001</td><td>每次反应消耗的 Anti-BrdU-FLUOS 和孵育缓冲液应多于制造商建议的用量。</td></tr><tr><td>Frame-Seal 培养室</td><td>材料</td><td>Bio-Rad</td><td>SLF-1201</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯膜滤器（142 毫米直径，1.0 &amp;mu;m-孔径</td><td>材料</td><td>EMD Millipore</td><td>FALP14250</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯膜滤器（25 mm 直径，0.2 &amp;mu;m-孔径</td><td>材料</td><td>EMD Millipore</td><td>FGLP02500</td><td></td></tr><tr><td>illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads</td><td>试剂盒</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9559-01</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 胶回收试剂盒</td><td>试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>FailSafe PCR 系统</td><td>试剂盒</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>FS99060</td><td></td></tr></tbody></table>

溴脱氧尿苷（brdu）标记及后续荧光激活细胞分选用于无需培养的溶解性有机碳降解浮游细菌鉴定

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

微生物是介导水生环境中多种溶解性有机碳（DOC）底物降解的主要媒介。然而，在自然环境中鉴定能够转化特定DOC组分的细菌类群仍面临技术挑战。
本文介绍一种结合溴脱氧尿苷（BrdU）掺入、荧光激活细胞分选（FACS）和基于16S rRNA基因的分子分析方法，可实现对水生环境中能够降解特定溶解性有机碳（DOC）化合物的浮游细菌进行无需培养的鉴定。设置三组浮游细菌微宇宙实验体系，分别添加BrdU和一种模型DOC化合物（DOC添加组），或仅添加BrdU（无添加对照组）。BrdU可在新合成的细菌DNA中取代胸腺嘧啶的位置，且BrdU标记的DNA易于通过免疫检测识别1,2。经过24小时培养后，能够利用所添加DOC化合物的浮游细菌预期会被选择性激活，因此在DOC添加组中，这些细胞的BrdU掺入水平显著高于无响应细胞，也高于无添加对照组中的细胞（低BrdU掺入细胞，LI细胞）。经荧光免疫检测后，通过荧光激活细胞分选（FACS）将高BrdU掺入细胞（HI细胞）与LI细胞区分开并实现物理分离3。对分选出的DOC响应性细胞（HI细胞）提取DNA，并通过后续基于16S rRNA基因的分析（包括PCR、克隆文库构建和测序）进行分类学鉴定。

将环境中的浮游细菌与一种模型溶解性有机碳（DOC）化合物以及DNA标记试剂溴脱氧尿苷（BrdU）共同孵育。随后，利用荧光激活细胞分选技术（FACS），根据细菌对BrdU的掺入量升高情况，将降解DOC的细胞从整个微生物群落中分离出来。随后通过分子分析对这些细胞进行鉴定。

溴脱氧尿苷（BrdU）标记及后续荧光激活细胞分选用于无需培养的溶解性有机碳降解浮游细菌鉴定

微生物是介导水生环境中多种溶解性有机碳（DOC）底物降解的主要媒介。然而，鉴定……

微生物介导多种溶解性有机碳底物或溶解性有机碳（DOC）化合物的降解过程，例如在拉辛地区及水生环境中。为了全面理解微生物在DOC转化中的作用，必须同时鉴定其分类学特征和功能。本视频演示了一种对参与特定DOC组分及水生环境转化的自由生活细菌或细菌浮游生物进行分类学鉴定的实验方法。从测试环境中采集的水样经过处理后，与目标化合物及溴脱氧尿苷（BRDU）共同孵育，BRDU 可掺入新合成的 DNA 并标记活跃生长的细胞。随后，利用与 ZI 偶联的抗 BRDU 抗体对掺入 BRDU 的细菌浮游生物进行标记。通过荧光激活细胞分选技术，分离出 BRDU 标记水平较高的细菌浮游生物。随后从分选后的细胞中提取DNA，并根据基于PCR的16S核糖体RNA基因分析结果进行分类学鉴定。大家好，我是肯特州立大学生物科学系陈茂博士实验室的Steven Robbins。今天，lu和我将向大家展示一种无需培养的、用于鉴定水生环境中降解DOC的细菌浮游生物的方法。与现有的营养添加法结合细菌群落DNA分析的技术相比，该技术的主要优势在于其聚焦于高活性细菌的分析，排除了休眠和生长缓慢的细胞。本文展示了利用某一特定DOC化合物的芭蕉属细菌的鉴定。但该方法也可用于研究利用其他单一DOC化合物或DLCs类物质（如藻类分泌物）的浮游细菌。那么，让我们先采集一些水样并开始实验。在检测水样中降解DOC的细菌浮游生物之前，必须对水样进行适当的处理。此处所示的样品采自美国佐治亚州海岸，用于去除水样中的大颗粒物质和ER VREs。使用蠕动泵将水从收集用大容量瓶转移至装有孔径为一微米滤膜的过滤装置中。随后，将滤液分装为36毫升等份，分别加入三个无菌的50毫升聚丙烯管中，每个管中预先加入4毫升新配制的10%多聚甲醛溶液。在室温下孵育两小时以固定细胞，孵育结束后即完成细胞保存。将水倒入带有孔径为0.22微米的白色膜滤器的玻璃真空过滤装置的过滤塔中，并施加真空使溶液通过。通过真空滤器加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗滤膜。将滤膜标记为阴性对照，并于-20摄氏度保存。为建立实验生态系统或微宇宙，首先将800毫升预先过滤的水样加入六个已预先冲洗过的一升玻璃烧瓶中。向每个微宇宙体系中加入BRDU，使其终浓度为10微摩尔。用手快速旋转烧瓶以混匀。每个样品将进行三次重复测定。向其中三个微宇宙体系中加入模型溶解性有机碳（DOC）化合物。此处，将雷尼酸以终浓度100纳摩尔加入微宇宙体系中。然后向其余三个微宇宙体系中加入无菌的PBS，作为无溶解性有机碳（DOC）的对照组。将所有微宇宙体系置于黑暗条件下，于原位温度（25°C）的摇床培养箱中以100 RPM振荡培养，并在0、8、16和24小时的时间点进行取样分析。从每个微宇宙中收集36毫升样品，放入含有4毫升新鲜10%多聚甲醛的50毫升无菌聚丙烯管中，于室温下孵育2小时以固定细胞。接着将固定后的细胞通过0.22微米孔径的白色膜滤器进行过滤。使用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）通过真空过滤装置冲洗，以去除残留的多聚甲醛（PFA）。立即进行 INS 原位免疫检测，或在负20摄氏度下保存滤膜，用于检测溴脱氧尿苷（BRDU）在细菌浮游生物中的掺入情况。首先将样品滤膜置于室温下，以破坏细菌细胞壁。将滤膜放置于过滤装置上，然后用移液器将一毫升溶菌酶溶液滴加到滤膜上，覆盖细胞，并在室温下孵育30分钟。孵育结束后，施加真空以去除溶液。待溶液通过滤膜后，加入10毫升PBS洗涤细胞，并施加真空。随后，为进一步破坏细胞壁，向滤膜上加入1毫升蛋白酶K溶液，以覆盖细胞。室温孵育30分钟。用PBS洗涤以产生单层DNA。加入1毫升外切核酸酶溶液，覆盖滤膜上的细胞。在37摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，通过真空滤器抽滤10毫升PBS洗涤滤膜。接着，修剪滤膜边缘，去除无细胞的部分。然后在用酒精清洁过的干燥表面上，使用无菌刀片将滤膜切成八个大小相等的部分。每个样品需要八个框架密封培养室，将滤膜的八分之一置于组装好的框架密封培养室中，样品面朝上。培养室组装完毕后，使用罗氏Intu细胞增殖检测试剂盒的荧光染料原位检测A-B-R-D-U标记的细胞。待静置步骤完成后，用无菌刀片将滤膜部分从孵育室中取出，并置于无菌表面上，将滤膜切成小块。将滤膜碎片转移至含有1毫升PBS的2毫升微量离心管中， tightly close the tube and seal it with paraform。随后将离心管置于37摄氏度、200转/分钟的振荡培养箱中孵育10分钟。孵育结束后，固定好离心管并在最大转速下涡旋震荡。用移液器将上清液转移至无菌的15毫升聚丙烯离心管中，持续5分钟。然后用PBS重悬滤膜，并重复涡旋和孵育步骤两次，每次均将所得上清液加入同一支15毫升离心管中，每个样本分别处理。将重悬的细胞置于 4 摄氏度保存。样本应在两天内通过传真进行分析。最后，分选细胞以获得高 BRDU 掺入水平的细胞群体。此处使用 BD fax 流式细胞仪及配套软件。细胞分选完成后，可对富集了 BrdU 的菌群进行检测，以确定其分类学身份。为扩增细菌的 16S 核糖体 RNA 基因，需进行滤膜 PCR：将分选后的细胞用移液器转移至一张白色的 0.22 µm 孔径的聚碳酸酯膜滤器上，开启真空泵，使用无菌刀片修剪滤膜上无细胞的边缘部分。将滤膜按每个条件均分为四个大小相等的部分，取其中一份滤膜放入三个PCR反应管中的每一个，细胞面朝向管内。加入45 µL PCR级水，使滤膜完全浸没于水中。接着，加入两粒 Roche illustra pure T ready to go PCR 胶粒，短暂涡旋以促进胶粒溶解。然后分别加入 2 µL 的正向和反向 16S 核糖体 RNA 基因引物。加入1微升BSA以帮助吸收扩增抑制物，或加入1微升水。在热循环仪上进行PCR扩增。推荐使用降落式PCR程序，其中退火温度从62°C开始，每个循环降低1°C，逐步降至52°C，随后在52°C下进行15个循环。通过溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增结果，从凝胶中切下PCR扩增产物，并使用KaiGen cayo快速凝胶回收试剂盒进行纯化。PCR产物经凝胶纯化后，将同一样本的扩增产物合并。纯化的16S核糖体DNA扩增产物现已可用于多种分子分析。样品采自佐治亚州的一个沿海地点，并按照本视频所述步骤进行处理，以研究降解拉辛（Racine）的细菌。拉辛是一种多胺类化合物，普遍存在于海洋环境中。如图所示，拉辛可作为海洋细菌的营养源和能量来源。样品的主成分分析显示，在24小时培养后，在添加了Racine的微宇宙体系中，出现了一类FXI荧光强度较高且与BRDU掺入程度呈正相关的细菌。这些细胞被定义为高BRDU掺入细胞（HI），预计主要包含降解Racine的细菌。无hi。在未添加任何物质的对照组中发现了细胞，其中仅含有较低水平BrdU掺入的细胞，称为lii细胞，预计主要包含无法利用的细菌浮游生物。添加的Racine HI细胞被分选至不同的试管中，随后收集到膜滤器上。通过滤膜PCR获得部分16S核糖体RNA基因扩增子，并经凝胶电泳确认。经过分选过滤后，还可对功能基因进行PCR扩增，以分析分选细胞之间的功能多样性。我们刚刚向您展示了如何结合荧光激活细胞分选与BrdU掺入技术，对水生环境中具有特定功能的细菌细胞进行物理分离与鉴定。请记住，进行本实验时，必须佩戴实验服、手套和护目镜。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记和文化独立的鉴定溶解有机随后的荧光激活细胞分选碳有辱人格的浮游细菌

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