细胞中四半胱氨酸传感器蛋白的ReAsH/FlAsH标记与图像分析

本实验的总体目标是利用荧光染料flash或ash对表达四半胱氨酸标签和荧光标记蛋白的细胞进行标记，并对结果进行定量分析。首先将携带荧光蛋白及含有四半胱氨酸标签的目标蛋白的质粒转染至目标细胞系中。接着，用R或flash对表达的蛋白进行标记，再通过BAL缓冲液洗涤去除非特异性结合的染料，以制备用于显微成像的样品。

然后使用共聚焦显微镜采集细胞在 ash 或 flash 以及荧光蛋白通道下的荧光图像。最后，利用 ImageJ 分析图像，以定量 ash 或 flash 与目标蛋白的结合情况。最终，可通过 ash 荧光与荧光蛋白荧光之间的相关性，获得显示 ash 或 flash 在细胞内与目标蛋白结合程度的结果。

与现有方法（例如仅将目标蛋白与GFP结合）相比，该技术的主要优势在于能够同时追踪蛋白的另一特性，例如在定位之外还能监测其构象变化。该方法有助于回答蛋白质亚结构与功能领域的关键问题，例如定位事件、构象变化以及影响TAC结合或闪光能力的LI结合事件。我们最初提出该方法的设想，是源于希望评估亨廷顿蛋白的小型亚显微多聚体在细胞内如何形成。

本方法的可视化演示至关重要，因为数据分析步骤在技术上较为复杂，难以掌握。以下将演示实验操作流程：第一至第三步由本实验室研究助理 Yasmin Ranson 演示数据分析过程；第四步由本实验室研究生 Sevki GaN 操作，使用标准的细胞培养方法培养您感兴趣的细胞系，并准备好可用于转染的活细胞成像载玻片。

培养贴壁细胞，并转染含有目标TC标签基因的质粒。根据所选择的转染方法，设置阳性对照和阴性对照至关重要，以便评估与TC标签特异性结合的程度，同时在采集共聚焦显微图像时评估不同通道间荧光信号的串扰（漂白流）。因此，在进行双色实验时，应确保准备单色样品，即分别表达荧光蛋白本身，以及尽可能设置T ctech蛋白结合新鲜组织或对照样本。

但不含荧光蛋白。转染后一至两天，用300微升预热的Hank's平衡盐溶液（HBSS）轻轻冲洗细胞，用含有10微摩尔的1,2-乙二硫醇（EDT）和1微摩尔去甲基化试剂（flash或ash）的新鲜预温HBSS溶液。从细胞中移除HBSS后，轻柔地加入300微升含去甲基化试剂的HBSS培养基，在组织培养孵箱中于37摄氏度精确孵育30分钟。

根据我们的经验，较长的孵育时间会显著增加背景荧光。轻轻吸去细胞中的标记溶液，替换为 300 微升预热的 HBSS，其中含有 250 微摩尔的二硫苏糖醇、巯基丙醇或 BAL，在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。通过轻柔吸除洗液，再加入 300 微升预热的 HBSS 替代。

经过此次洗涤后，可使用多聚甲醛固定细胞，但我们发现这会增加非特异性背景荧光。因此，我们通常在室温下对活细胞进行成像。此外，标记前对细胞进行固定会阻碍双功能染料的结合。

开始在共聚焦显微镜上对细胞进行成像时，需为各个荧光染料设置成像参数，并确保各通道之间几乎没有串色。接下来，调节光电倍增管的设置，使样品中最强的荧光信号不会使探测器饱和。确定最佳成像参数后，在不同样品之间不得更改任何设置。

使用 200 赫兹的扫描速率，采集四次线平均，并将针孔直径设置为一个单位面积。如果信噪比存在问题，可以扩大针孔直径，但这可能会导致成像分辨率的一定程度下降。

尽可能以 12 位或更高格式采集共聚焦图像，以最大限度提高定量数据分析的质量。对所有样本均需采集荧光蛋白通道以及 BI arsenal 染料通道的图像。

为分析数据，请使用 Image J 软件及其以下插件。若使用的 Image J 版本早于 1.32 C，请点击以下选项。为启用同时打开多幅图像的功能，请编辑选项中的输入/输出，勾选使用 j 文件选择器以打开/共享的复选框。

单击“确定”。打开感兴趣的图像。Image J 会自动为每幅图像单独定义屏幕上显示的最大和最小像素强度，因为不同的图像具有不同的像素强度。

这意味着所显示的图像在视觉上无法直接比较。为确保打开的图像均处于相同的尺度，需手动设定显示的像素强度上下限。要设置这些数值，请选择图像，然后调整亮度/对比度。

单击设置，定义显示的最小值和最大值，然后选择传播到所有打开的图像，再单击确定。或者，将特定通道的所有图像合并到单个文件或图像栈中。

Image J 将自动调整所有图像至相同的比例尺。为此，请选择图像堆栈中的图像以创建堆栈，输入每个文件共用的名称，并选择使用标题作为标签。点击确定。

将所有打开的图像转换为8位以进行分析。通过选择图像类型为8位，这会将显示范围重新缩放为0到255的区间。切勿覆盖保存原始的12位或更高格式的图像，以免丢失信息内容。

使用“另存为”选项，将副本保存到一个名为 eight bit converted 的新文件夹中。一种检查整个图像中双砷染料结合程度的方法是进行像素强度相关性分析图。该图显示一个通道中每个像素值相对于第二个通道中对应像素值的关系。

因此，如果结合程度较高，GFP荧光较强的像素位置在灰分荧光中也会较强。为了分析像素的共相关性，需确保8位的REA和GFP图像已在ImageJ中打开。接着，通过选择“插件”→“图像相关器”来打开图像相关器插件。将图像文件分别指定为图像一和图像二。

然后单击确定。生成的图像堆栈可能不会显示任何详细信息。这是正常现象。

将该图层保存到一个名为“散点图”的新文件夹中，并使用与其对应的样本相同的文件名。例如，Ash GFP 相关性图。要查看数据，请选择以下两种选项之一。

首先，通过选择“处理数学对数自动”将数据转换为对数格式。然后，通过单击“图像调整亮度/对比度”并选择“自动”，对数据进行视觉上的重新缩放。其次，通过视觉重新缩放数据，仅显示低值，并使用特殊的查找表（LUT）显示数据，以创建自定义的查找表。

单击图像颜色编辑查找表（LUT）以创建一个非常简单的 LUT。首先单击左上角的像素并选择黑色，然后选择右侧相邻的像素并选择红色。

接下来，单击第三个像素，然后在按住鼠标按钮的同时，将选区拖动到右下角的像素。选择红色，单击“确定”，然后选择白色并单击“确定”。按照之前所述，选择亮度/对比度范围从 0 到 255，以将图像锁定为屏幕上显示的内容。

将其转换为 RGB 格式，以便将图像复制并粘贴到其他程序中。首先，按照前述方法打开 8 位或 16 位图像。为 GFP 图像分配 LUT 颜色方案。

单击图像以分配绿色查找表（LUT）。选择绿色查找表。最后选择要复制的图像，并通过选择“编辑”→“复制到系统”将其复制到剪贴板。该图显示了激酶S6K与GFP及TC标签融合蛋白经30分钟染色后的典型结果。

在 HEC 293 细胞中使用 ASH 时，结果显示 ASH 能够以高亲和力有效地结合携带 TC 标签的目标蛋白。相比之下，本图显示了 SARK 与 GFP 融合的相应对照样品，该样品缺乏 TC 标签，这对于验证 TC 标签的特异性以及背景染色水平至关重要。该结果表明，RH 对缺乏 TC 标签的目标蛋白无反应性，说明 TC 标签在 SSH 结合中具有特异性。

在进行该实验操作时，重要的是要注意避免细胞长至汇合且状态平静，因为这会影响细胞中V的结合。观看本视频后，您应能够较好地掌握如何对数据进行简单的定量分析，并可进一步优化这些方法，以开发出适合自己研究需求的独特数据可视化IUTS。