Name: 从现场收集到的蚊子传染病毒Vero细胞培养法检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学习使用Vero细胞培养法检测野外采集蚊子中的病毒感染。该方法通过物种分类、组织研磨和细胞接种，成功检测出9种不同病毒，有助于深入了解蚊子传播病毒的多样性及其公共卫生意义。

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我们衷心感谢 John Anderson 博士、Andrew Main 博士和 Shirley Tirrell 博士对本研究的重要贡献。本工作部分得到了美国疾病控制与预防中心（U50/CCU116806-01-1）和美国农业部（58-6615-1-218、CONH00768 和 CONH00773）资助项目的支持。

1. 蚊虫分选与鉴定
<ol>
	<li>以下操作均在经培训可处理活体蚊虫的人员于专用的生物安全二级（BSL-2）实验室内的开放实验台上进行。整个操作过程中需维持“冷链”条件。</li>
	<li>将蚊虫采集袋置于 -20°C 冰箱中冷冻 5 分钟，以麻醉活体成蚊。随后将采集袋转移至装有干冰的保温容器中，盖上盖子，使蚊虫暴露于二氧化碳环境中 1–3 分钟，以确保完全麻痹。</li>
	<li>轻敲采集袋，使麻醉后的蚊虫落入置于干冰上的预冷托盘中。使用精细镊子分离雌性蚊虫，并将其放入塑料分装杯中。盖上杯盖后，将分装杯置于湿冰上。</li>
	<li>借助安装在电子制冷台上的立体解剖显微镜（10–60X 变倍），根据蚊虫外部形态特征，利用描述性分类学检索表将蚊虫鉴定至种。</li>
	<li>将已鉴定的蚊虫按种类分别混合成每池不超过 50 只的样本，放入含有铜弹珠的 2 mL 带盖螺口管中。每管均贴上唯一标识编号。</li>
	<li>完成所有蚊虫的鉴定后，将螺口管放入已标记的袋子中，并置于装有干冰的泡沫塑料冷藏箱内保存。</li>
	<li>将蚊虫池样本储存于 -80°C 超低温冰箱中，直至进行病毒检测。</li>
</ol>
2. 从蚊子中分离病毒的生物安全考虑
<ol>
	<li>以下操作须由经过生物安全三级（BSL-3）实验室操作培训的人员在生物安全三级实验室中进行1。实验室设施、设备、操作程序和实践均需接受机构、州和联邦相关部门的监管与检查。在实施以下实验方案前，应取得相应的培训和批准。</li>
	<li>根据具体操作穿戴适当的个人防护装备（PPE），例如一次性防护服、手套、面罩和呼吸器。</li>
	<li>操作开始前和结束后，使用70%乙醇对工作台面进行消毒。</li>
	<li>细胞培养物及可能具有传染性的材料均在II级生物安全柜（BSC）内操作。</li>
	<li>蚊虫样本池在置于生物安全柜内的混合研磨仪中进行匀浆处理。</li>
	<li>蚊虫匀浆液在防气溶胶密闭的微量离心机中进行离心。若该步骤无法在生物安全柜内完成，操作人员在启动离心机及取出样本时应佩戴呼吸器。</li>
	<li>在生物安全柜（BSC）内接触过样本的移液器和吸头应在10%次氯酸钠溶液中浸泡，随后进行高压灭菌。所有实验室废弃物在丢弃前均须经高压灭菌去污处理。</li>
</ol>
3. Vero 细胞的制备
<ol>
	<li>从一个大号组织培养瓶（175 cm²）中倾倒出培养基2将汇合的Vero细胞（克隆E6）弃入含漂白剂的废液杯中。</li>
	<li>用5 mL PBS洗涤Vero细胞，将PBS加入培养瓶中，轻轻旋转培养瓶，使液体覆盖细胞层及瓶壁，确保完全覆盖整个单层细胞。</li>
	<li>将 PBS 倒入废液杯中。</li>
	<li>加入2.5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，轻轻晃动培养器皿，使液体均匀覆盖整个单层细胞，确保完全覆盖。</li>
	<li>将烧瓶置于37℃培养箱中孵育5分钟&deg;C，5% CO2.</li>
	<li>轻轻振荡并旋转锥形瓶，使细胞从底部表面脱落。细胞应能轻易滑落；若细胞不易滑落，可额外孵育1-5分钟。</li>
	<li>加入5 mL最小必需培养基（MEM）和5%胎牛血清（FBS），使用血清移液管上下吹打10–20次，以分散细胞团块。</li>
	<li>加入额外的15 mL MEM和5% FBS，终体积为22.5 mL，充分混匀。</li>
	<li>将40个小型组织培养瓶（25 cm²）置于生物安全柜中2）直立放置于两个架子上（每个架子20个培养瓶）。</li>
	<li>将装有培养瓶的架子放入生物安全柜中，取下培养瓶盖，并将瓶盖直接放置在对应培养瓶前方。</li>
	<li>使用血清移液管向每个培养瓶中加入4 mL含5%胎牛血清的MEM培养基。</li>
	<li>将0.5 mL悬浮细胞分装至每个培养瓶中（&tilde;1:6 传代比例）更换培养瓶瓶盖。</li>
	<li>向原代大号组织培养瓶中加入50 mL MEM和5% FBS，瓶中含剩余的细胞悬液（&tilde;2.5 mL），然后将培养瓶放回培养箱。同一培养瓶最多可重复使用至5代，之后应更换新的培养瓶。</li>
	<li>将小型组织培养瓶成叠地放置在托盘上。轻轻晃动托盘，确保培养基均匀覆盖瓶底。</li>
	<li>将小培养瓶置于37℃培养箱中&deg; C，5% CO2 过夜培养至80-90%汇合度。</li>
</ol>
4. 蚊虫样本池的制备
<ol>
	<li>检测过程中保持蚊虫样本处于低温环境。处理蚊虫样本时，使用预冷的冷冻架和混合研磨仪夹具、冰上保存的试剂以及冷藏离心机。</li>
	<li>将装有蚊虫的离心管放入预冷的冷冻架中，每管加入 1–1.5 mL PBS-G 缓冲液。</li>
	<li>从冰箱中取出混合研磨仪夹具，将 24 支离心管放入每个夹具中，然后固定到混合研磨仪上。</li>
	<li>以每秒 25 个循环的速度均质化样品 4 分钟。混合研磨仪以高速震荡离心管，每管内的金属弹珠可破坏蚊虫组织。</li>
	<li>在 7,000 rpm 条件下离心 6 分钟。</li>
	<li>将离心管放回冷冻架中，直至接种至 Vero 细胞。</li>
</ol>
5. 用蚊虫混合匀浆接种Vero细胞
<ol>
	<li>使用倒置显微镜检查每组至少一个组织培养瓶，以确认细胞融合度和细胞状态良好；预期覆盖率约为80-90%。</li>
	<li>将20个小组织培养瓶排放在架子上，并根据每个蚊虫样本池对应的编号进行标记。</li>
	<li>松开瓶盖，将组织培养瓶中的大部分培养基倒入废液杯中，仅保留足够完全覆盖细胞单层的培养基。</li>
	<li>从每份处理过的蚊虫样本池中取100μL上清液，分别加入对应的组织培养瓶中。</li>
	<li>重新盖紧培养瓶盖。</li>
	<li>将培养瓶平放在摇床上，于室温下以35-40 rpm振荡5分钟。</li>
	<li>将20个组织培养瓶放回直立位置并置于架子上，然后放入生物安全柜中。</li>
	<li>每次打开3个组织培养瓶盖，使用血清移液管向每个瓶中加入4 mL生长培养基；随后重新盖上瓶盖。</li>
	<li>确保移液管尖端不接触培养瓶口或瓶口边缘。若发生接触，须及时更换新的移液管尖端。</li>
	<li>将组织培养瓶置于37°C、5% CO2条件下培养。</li>
</ol>
6. 筛选 Vero 细胞以检测病毒增殖
<ol>
	<li>接种后3至7天，对已接种的组织培养瓶进行观察，检查是否存在病毒感染的迹象，即细胞病变效应（CPE）。</li>
	<li>通过倾斜培养瓶并观察积聚在瓶底的培养基，肉眼检查细胞培养物是否出现CPE和/或污染。当细胞在CPE过程中退化或因酵母、真菌或细菌污染而生长时，培养基会呈现浑浊状态。</li>
	<li>在倒置显微镜下重新检查显示培养基浑浊的细胞培养物。病毒会导致细胞变形，并从培养瓶表面脱落。对于可见污染物（如酵母、其他细菌、真菌或大量蚊虫碎片）的细胞培养物，需将原始蚊虫样本通过0.22μm注射器滤器过滤后重新检测。</li>
	<li>使用血清移液管，无菌操作将1–2 mL来自病毒阳性细胞培养物的培养基分装至已标记的冻存管中。</li>
	<li>病毒培养物在鉴定前需保存于-80°C环境中，鉴定采用相应的诊断检测方法进行。</li>
</ol>
7. 试剂的准备
<ol>
	<li>MEM，5% FBS。将37.6 g粉末状MEM溶解于终体积为4 L的dd H2O中。将溶液分装至培养基瓶中，每瓶500 mL，并进行高压灭菌。待溶液冷却后，无菌条件下向每瓶中加入26 mL热灭活胎牛血清、5.2 mL L-谷氨酰胺、5.2 mL抗生素/抗真菌剂以及10.4 mL 7.5%碳酸氢钠。4°C保存。</li>
	<li>PBS-G。将16 g NaCl、0.4 g KCl、2.3 g Na2HPO4、0.4 g KH2PO4和4 mL 0.5%酚红溶解于1000 mL dd H2O中。必要时用2 N NaOH调节pH至7.1–7.4。在另一个烧杯中，将600 mL H2O加热至沸腾。从加热板上取下，加入10 g明胶并溶解。将溶解后的明胶溶液加入PBS溶液中，并用dd H2O定容至2 L。将溶液分装至瓶中，每瓶100 mL，并进行高压灭菌。待溶液冷却后，无菌条件下加入42.8 mL热灭活兔血清和1.4 mL抗生素/抗真菌剂。4°C保存。</li>
	<li>PBS细胞洗涤液。将50 mL 10倍浓度的Dulbecco's PBS加入400 mL dd H2O中。用2 N NaOH调节pH至7.1。用dd H2O定容至终体积500 mL。使用0.2 µm真空滤器过滤溶液。将溶液分装至8 mL螺口管中，每管5 mL。4°C保存。</li>
</ol>
8. 代表性结果
在1997年至2010年期间，通过对美国康涅狄格州持续开展的全州范围蚊媒监测，共分离出属于4个分类学科的9种不同病毒（表1）。其中5种病毒已知可引起人类疾病，最重要的病原体为西尼罗病毒和东部马脑炎病毒。新发现包括：1999年首次从北美采集的蚊子中分离出西尼罗病毒2，2000年首次在美国东北部分离出波托西病毒3，以及2005年首次在新英格兰地区分离出拉克罗斯病毒4。

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>病毒</td>
 <td>科</td>
 <td>分离株数量</td>
 <td>地点数量</td>
 <td>检出年份数量</td>
 <td>人类疾病</td>
 <td>参考文献</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>西尼罗病毒</td>
 <td>黄病毒科</td>
 <td>1,002</td>
 <td>94</td>
 <td>12</td>
 <td>中度至重度，发热，脑炎</td>
 <td>2,5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>东部马脑炎病毒</td>
 <td>披膜病毒科</td>
 <td>292</td>
 <td>41</td>
 <td>10</td>
 <td>重度，脑炎</td>
 <td>6,7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>高地J病毒</td>
 <td>披膜病毒科</td>
 <td>178</td>
 <td>39</td>
 <td>11</td>
 <td>未知</td>
 <td>6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>詹姆斯敦峡谷病毒</td>
 <td>布尼亚病毒科</td>
 <td>305</td>
 <td>74</td>
 <td>14</td>
 <td>轻度至中度，发热，脑膜炎</td>
 <td>8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>波托西病毒</td>
 <td>布尼亚病毒科</td>
 <td>259</td>
 <td>76</td>
 <td>4</td>
 <td>未知</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>凯奇谷病毒</td>
 <td>布尼亚病毒科</td>
 <td>114</td>
 <td>51</td>
 <td>8</td>
 <td>轻度至重度，发热，两例记录病例中出现神经系统疾病</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>特里维塔图斯病毒</td>
 <td>布尼亚病毒科</td>
 <td>83</td>
 <td>21</td>
 <td>11</td>
 <td>未知</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>拉克罗斯病毒</td>
 <td>布尼亚病毒科</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 <td>中度至重度，脑炎</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>弗兰德斯病毒</td>
 <td>弹状病毒科</td>
 <td>4</td>
 <td>4</td>
 <td>2</td>
 <td>未知</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表1. 通过Vero细胞培养实验在野外采集的蚊子中检测到的病毒。蚊子于1997年至2010年期间在康涅狄格州全州监测过程中采集。

<ol><li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChosewood%2C+LC+%22Biosafety+in+Microbiological+and+Biomedical+Laboratories%22">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories</a>. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).</li>
<li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes%2C+crows%2C+and+a+Cooper%27s+hawk+in+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+collected+in+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+%28Bunyaviridae%29+isolated+from+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+West+Nile+virus+in+Connecticut%2C+USA%3A+a+five+year+analysis+of+mosquito+data+1999-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+%28Bunyaviridae%3A+Orthobunyavirus%29+from+field-collected+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+in+Connecticut%2C+USA%3A+a+ten-year+analysis%2C+1997-2006%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li>
<li>Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaty%2C+BJ+%22Diagnostic+Procedures+for+Viral%2C+Rickettsial%2C+and+Chlamydial+Infections%22">Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections</a>. , American Public Health Association. 189-212 (1995).</li>
<li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarabatsos%2C+N+%22International+Catalogue+of+Arboviruses+Including+Certain+Other+Viruses+of+Vertebrates%22">International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates</a>. , American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).</li>
<li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens%2C+field-collected+mosquitoes%2C+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li>
<li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

Vero 细胞培养检测法是一种有效的方法，可用于筛查野外采集的蚊子中多种病毒的存在。这与分子检测方法形成对比，后者仅针对一种或少数几种目标病毒。此外，我们发现 Vero 细胞培养检测法的敏感性至少与逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）相当，甚至更高7，并且能够获得病毒分离株，这些分离株被保存在我们的参考文库中，供未来研究使用。然而，在许多情况下，细胞培养系统可能并不适用。该方法需要在生物安全三级（BSL-3）实验室中进行病毒培养，涉及额外的成本和专业培训；不过，细胞培养所需的耗材相对便宜，可在一定程度上抵消这些成本。还值得注意的是，大多数但并非全部蚊媒病毒均能在 Vero 细胞培养中产生细胞病变效应（CPE）9,10。登革病毒就是一个显著的例外，应通过其他诊断试验进行筛查。理想情况下，应联合使用分子检测和细胞培养方法来检测病毒感染。目前，我们正在使用常规和定量 RT-PCR 检测方法4,11,12，有时结合测序技术，以鉴定在细胞培养中分离到的病毒，并重新确认蚊子混合样本中的病毒感染情况。

<table><tbody><tr><td>胎牛血清</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>16140</td><td></td></tr><tr><td>抗抗生素/抗真菌剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠 NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，7.5% 溶液</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM 100倍</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>粉末状最低必需培养基（MEM）</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11700</td><td></td></tr><tr><td>10倍浓度 Dulbecco&amp;rsquo;s PBS</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>14080</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>15400</td><td></td></tr><tr><td>兔血清</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Vero细胞（克隆E6）</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>小型组织培养瓶，带透气盖，25 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Falcon BD</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>大尺寸组织培养瓶，带透气盖，175 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Falcon BD</td><td>353108</td><td></td></tr><tr><td>铜镀层BB弹&amp;rsquo;秒，4.5 毫米</td><td>Crosman</td><td>0767</td><td></td></tr><tr><td>混合研磨仪</td><td>Retsch</td><td>MM300</td><td></td></tr><tr><td>Isopack 冷冻架</td><td>Eppendorf</td><td>022510240</td><td></td></tr></tbody></table>

通过vero细胞培养法检测野外采集蚊虫中的感染性病毒

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

蚊子可传播多种不同的病毒，包括西尼罗病毒、登革病毒和基孔肯雅病毒等重要的人类病原体。这些病毒在地方性流行区域的活动强度有所增加，并已扩散至新的地区，因此需要有效的监测和控制计划来应对这些威胁。监测病毒活动的一种策略是，从地方性流行地区采集大量蚊子，并检测其是否感染病毒。本文描述了如何通过Vero细胞培养法处理、加工和筛查野外采集的蚊子以检测传染性病毒。蚊子按捕蚊器的位置和种类进行分类，并分组为每池不超过50只个体的样本池。将混合样本在缓冲盐溶液中使用混合研磨仪进行匀浆处理，取其水相接种于融合的Vero细胞系（Clone E6）中。接种后第3至7天持续观察细胞培养物是否出现细胞病变效应，任何在细胞培养中增殖的病毒均通过相应的诊断检测进行鉴定。通过采用该方法，我们已从美国康涅狄格州采集的蚊子中分离出9种不同的病毒，其中5种已知可引起人类疾病。这三种病毒（西尼罗病毒、波多西病毒和拉克罗斯病毒）自1999年以来代表了北美洲或新英格兰地区的新记录。能够检测到多种多样的病毒，对于监测蚊媒种群中已存在的以及新出现的病毒至关重要。

我们介绍了一种通过Vero细胞培养法对野外采集的蚊虫进行多种病毒处理和筛查的方法。利用该技术，我们已从美国康涅狄格州采集的蚊虫中检测出分属4个分类学科别的9种不同病毒。

通过Vero细胞培养法检测野外采集蚊虫中的感染性病毒

蚊子传播多种不同的病毒，包括西尼罗病毒、登革病毒和基孔肯雅病毒等重要的人类病原体。许多……

本实验的总体目标是通过Vero细胞培养法检测野外采集的蚊虫是否携带病毒感染。首先，将野外采集的蚊虫按种类进行分类，随后使用混匀研磨仪对蚊虫进行匀浆处理。蚊虫匀浆制备完成后，将培养Vero细胞以备病毒检测之用。每个Vero细胞培养物接种一份单独的蚊虫匀浆，置于摇床上震荡5分钟，随后在37摄氏度下孵育，以使病毒增殖。最终，通过肉眼观察培养物是否存在病毒诱导的细胞病变效应。该技术相较于R-T-P-C-R等现有方法的主要优势在于，能够利用细胞培养对蚊虫携带的多种多样的病毒病原体进行筛查。该方法有助于解答医学昆虫学领域的关键问题，例如不同蚊种在支持病毒传播中所起的作用。以下操作需在生物安全二级实验室中进行。将装有活体蚊虫的收集袋置于负20摄氏度环境中15分钟，以麻醉蚊虫。待昆虫麻醉后，将袋子转移至装有干冰的保温容器中，并使蚊虫暴露于二氧化碳环境中一到三分钟，以确保完全击倒。随后，将蚊虫置于盛有干冰的预冷金属盘上。使用精细尖头镊子辨认雌性昆虫，并将其转移至塑料分装杯中。通过检查口器和触角可以区分雌性和雄性。将杯子密封后置于湿冰上。使用安装在电子冷台上的立体解剖显微镜和分类学检索表。将每份蚊虫混合样本中的蚊虫按种类分类，并将同一种类的蚊虫放入贴好标签的含有铜球的2毫升带盖螺口小瓶中。随着样本增加，单个试管中最多可混合50只蚊虫。将小瓶放入标记好的袋子中，置于装有干冰的泡沫塑料容器内。所有蚊虫鉴定完成后，可将其储存于负80摄氏度，直至进行匀浆处理。本操作需在生物安全三级实验室中进行，并在二级生物安全柜内操作。每管加入约一毫升PBSG，将含有蚊虫的管子放入预冷的混合研磨仪夹套中。将装有样本的盒式装置固定到混合研磨仪中，在每秒25个循环的条件下均质化蚊虫混合样本4分钟。蚊虫样本均质化后，将试管转移至防气溶胶密封的冷藏微量离心机中进行离心。在7,000 RPM条件下离心6分钟。离心后的试管可于-80摄氏度保存，直至进行病毒检测。将汇合的猪肾细胞T175培养瓶中的培养基倾入含漂白剂的废液杯中。向培养瓶中加入5毫升磷酸盐缓冲液（PBS），均匀洗涤细胞，然后将PBS倾入废液杯中。洗涤细胞后，加入 2.5 毫升胰蛋白酶 EDTA，将培养瓶置于 37 摄氏度、5%CO2 条件下孵育 5 分钟，以使细胞脱落。待细胞脱落后，加入 5 毫升 MEM 培养基，反复吹打数次以分散细胞团块，随后再加入 15 毫升 MEM 培养基。在生物安全柜内将40个T25培养瓶放置于两个架子上，取下瓶盖后将其直接放在每个培养瓶前方。使用无菌移液器向每个培养瓶中加入4毫升MEM培养基，然后加入0.5毫升悬浮的vari细胞，盖紧瓶盖。将培养瓶叠放在托盘上，轻轻摇晃，确保培养基均匀覆盖培养瓶底部。在37摄氏度、5% CO2条件下将培养物孵育过夜，或直至细胞融合度达到80%至90%。从培养箱中取出20个小型培养瓶，根据每份蚊虫样本池对应的编号进行标记。将各培养瓶中的大部分培养基倾倒至废液容器中，仅保留足量培养基以覆盖单层细胞。将每份蚊虫匀浆上清液的100微升转移至相应标记的烧瓶中，并 tightly 密封烧瓶。上清液转移完成后，将烧瓶置于摇床中，在35至40 RRP M条件下振荡五分钟。随后将烧瓶重新放入生物安全柜中，向每个烧瓶中加入4毫升培养基。将培养瓶重新盖紧，并在37摄氏度和5% CO2条件下孵育三至七天。当培养物准备进行筛选时，首先肉眼观察培养基。培养基浑浊表明可能存在病毒诱导的细胞病变效应或受到其他微生物污染，或两者兼有。对显示培养基浑浊的培养物，在倒置光学显微镜下进行检查。病毒通常会导致细胞变形并从培养瓶上脱落。如果检测到细菌、酵母或真菌污染，或培养物中含有大量蚊虫碎片，则应在通过0.22微米滤器过滤后重新检测原始蚊虫样本。将未受其他微生物污染的病毒阳性培养物中的1至2毫升培养基，无菌过滤后分装至已标记的冻存管中。将含有病毒的样本在负80摄氏度下保存，直至使用本检测方法进行适当诊断分析以确定病毒种类。在1997年至2010年期间，通过康涅狄格州持续的全州范围监测，从采集的蚊子中分离出属于四个分类学科的九种不同类型的病毒。其中多种病毒，包括东部马脑炎病毒（Eastern equine encephalitis virus）和西尼罗病毒（West Nile Virus），已知可引起人类疾病。观看本视频后，您应能充分了解如何通过病毒细胞培养法对蚊子进行分选、处理及病毒侵染筛查。

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科研

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免疫学与感染

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