用于生物系统中离子浓度检测的荧光纳米颗粒

以下实验的总体目标是制备用于体外和体内应用的钠离子纳米传感器。首先制备含有纳米传感器组分的光学混合物（opto mixture）。第二步，将表面活性剂在水溶液中进行超声处理，使其均匀分散，从而在加入光学混合物后能够形成纳米传感器。

接下来，在超声处理下将光敏混合物加入水相表面活性剂混合物中，以在溶液中形成纳米传感器。本视频展示了传感器响应具有可调性。这些传感器可通过显微注射进入心肌细胞，也可皮下注射到小鼠体内。

与现有的荧光指示染料等方法相比，该技术的主要优势在于，我们可以将传感器调节至与生理环境相匹配的动态范围，检测更广泛的分析物，并进行比率测量以实现定量分析。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为一旦传感器制备完成，将其引入生物环境时可能会感到难以操作。根据书面方案，在制备光学传感器之前，需要预先准备好干燥的钠离子四[3,5-双(三氟甲基)苯基]硼酸盐（TFPB）和铬偶氮四羧酸三钠盐（Chromo 43）的储备品。

在通风橱中，将所有材料加入一个 1.5 毫升的玻璃小瓶中。使用聚四氟乙烯涂层螺旋盖，轻轻涡旋振荡小瓶，直至所有聚氯乙烯完全溶解。溶液应呈现红色。

开始制备纳米传感器，将100微升浓度为10毫克/毫升的PEG脂质加入一个4克重的玻璃小瓶中。接着，加入4毫升所需水溶液，例如10毫摩尔的HEPES溶液。

使用实验室升降架将振荡尖端同步插入小瓶中7毫米，并施加低功率超声处理30秒。在0.6毫升离心管中，用移液器加入50微升光敏材料和50微升二氯甲烷，确保混合均匀。接着，开始进行3分钟的超声处理。

超声开始时，将移液管吸头浸入溶液，加入100 µL光响应混合物，并一次性快速均匀地注入全部体积。如果pH值升至7以上，溶液会变为蓝色；若无钠存在，则无法从溶液中去除残留的四氢呋喃和二氯甲烷。将超声探头调整至距液面下2 mm的深度。

在剩余的三分钟内，溶液将逐渐变得不透明。超声处理完成后，用一支五毫升注射器吸取纳米传感器溶液。安装滤器，并将纳米传感器溶液分装至带螺口盖的玻璃小瓶中。

首先配制10种钠离子浓度逐步升高的溶液，用于测定纳米传感器的灵敏度。将0摩尔和1摩尔的钠离子储备液加入50毫升锥形管中进行混合。随后，在光学底96孔板中，向每列的三个孔中各加入100微升不同浓度的钠离子溶液。

然后向每个孔中加入 100 µL 新鲜配制的纳米传感器，将酶标板放入微孔板荧光仪中，并设置适合所用发色团的最佳激发波长、发射波长和截止波长。检测波长的选择取决于具体应用，这些波长可用于细胞内快速动态测量或降低噪声。

为获得α值，将570纳米处的强度值与670纳米或680纳米处的强度值之比进行相除。以α值对钠离子浓度的对数作图，将零钠浓度的对数值设为-1。

现在将S形曲线拟合到响应值上，并根据该曲线计算α值为0.5时的钠离子浓度。该浓度代表传感器响应最佳时的钠离子浓度。利用此信息，调整光学传感器中钠离子载体四[对（双十二烷基氨基）苯基]卟啉（sodium ionophore IV）、钠离子载体TFPB（sodium TFPB）和染料离子载体四[对氯苯基]卟啉（chromo ionophore IV）的比例，以制备具有最佳钠离子响应浓度的纳米传感器。

例如，五组不同光学配方的纳米传感器的典型响应曲线，其差异仅在于钠含量为四种10。用于细胞内成像时，将细胞培养基替换为透明介质（如Tyro溶液），并将细胞转移至成像腔室。随后，用含有5毫克/毫升葡萄糖的水溶液配制的纳米传感器溶液回填拉制的玻璃微电极。

然后将移液管安装到显微操作器上，并连接至压力控制的注射系统。将移液管下移至细胞表面并进入细胞质。有时需要轻敲操作器支架以刺穿细胞膜。

注射数百皮升的纳米传感器溶液，然后迅速撤出移液器。使用麻醉舱以异氟烷麻醉一只CD-1裸鼠。麻醉后，将小鼠放入已消毒的成像舱中。

接下来，用无菌的31号胰岛素注射器吸取10微升含有适当KD值的纳米传感器溶液（溶于10毫摩尔PBS中）。使用镊子确保排除所有气泡。在小鼠背部预定注射部位，用手指捏住一小褶皮肤，同时固定皮肤。

将注射器针头斜面向上，与皮肤平行地刺入皮肤。然后回拉注射器活塞，以确认针头未进入血管。为减小回流压力，可轻轻左右移动针头，在皮肤内形成一个囊腔。

然后注入传感器，并轻轻拔出注射器。轻轻按压注射部位，并擦去可能从注射部位渗出的溶液。通常沿背部进行六个等间距的注射。

若对不同的小鼠进行操作，应更换针头以尽量减少疾病传播和交叉污染。注射后，使用与纳米传感器激发-发射光谱相匹配的滤光片组采集明场和荧光图像，以尽量降低皮肤自发荧光。

这些新生小鼠心肌细胞在盖玻片上培养，并注射了钠离子纳米传感器。该荧光图像的激发波长为639纳米。这是同一细胞的明场图像，而此图为两者的叠加图像。

出现了一些传感器聚集现象，但细胞形态正常。传感器已扩散至整个胞质溶胶，且未见细胞核内加载。此明场与荧光图像的叠加图显示，将九种不同的钠纳米传感器皮下注射至裸鼠的皮下组织空间。

只要操作得当，Masten 制备纳米传感器的过程可在数分钟内完成，并可应用于任何研究以测量可逆的实时分析物通量。观看本视频后，您应能充分理解如何将纳米传感器载入细胞内或皮下空间，以在生物环境中进行定量测量。