Name: 在生物系统中的离子浓度测量荧光纳米粒子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学习利用荧光纳米粒子制备钠离子纳米传感器，用于体外和体内生物系统的离子浓度成像。该方法支持动态范围调节，可实现心肌细胞和活体小鼠的定量分析。

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JMD 和 MKB 的研究由东北大学的 IGERT 纳米医学科学与技术项目资助（资金来自 NCI 和 NSF 资助号 DGE-0504331）。本工作还获得了美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所资助 R01 GM084366 的支持。我们还要感谢波士顿 BIDMC 的 Saumya Das 和 Anthony Rosenzweig 提供心肌细胞，以及 Kevin Cash 在动物实验方案开发中的贡献。

1. 光学传感器的制备
在制备光学传感器之前，需要将各组分分装，以便于准确量取和储存。
<ol>
	<li>将一支50 mg的钠离子载体X（NaIX）和50 mg的四[3,5-双(三氟甲基)苯基]硼酸钠（NaTFPB）分别用四氢呋喃（THF）溶解，并分装至1.5 ml聚苯乙烯离心管中。在化学通风橱中，将50 mg NaIX溶于1 ml THF中，于原装瓶内充分混匀，确保固体完全溶解。将此溶液取100 μl分装至10个独立的离心管中。对NaTFPB重复相同操作。将离心管置于化学通风橱中过夜，使THF完全挥发，标记各管并储存于4°C冰箱中。由此制得每份5 mg的干燥NaIX和NaTFPB分装样品。</li>
	<li>将显色离子载体III（CHIII）溶于1 ml THF中，并转移至一个3 ml玻璃小瓶中。向CHIII原装瓶中再加入1 ml THF，以溶解残留的CHIII，并将此溶液合并至3 ml玻璃小瓶中，总体积为2 ml。将CHIII的THF溶液各取1 ml，分别转移至两个带有聚四氟乙烯涂层瓶盖的1.5 ml玻璃小瓶中。将CHIII溶液储存于4°C冰箱中，最终浓度为5 mg/ml。</li>
</ol>
	这些等分试样和溶液将用于制备光学传感器材料。
	<ol start="3">
	<li>用移液器将 66 μl 的双(2-乙基己基)癸二酸酯（DOS）加入一个带有聚四氟乙烯涂层螺旋盖的 1.5 ml 玻璃小瓶中——此即为光学传感器小瓶。DOS 为粘稠溶液，因此需小心操作，确保准确转移所需体积的溶液至小瓶中。该体积相当于约 60 mg 的 DOS。</li>
	<li>称取 30 mg 高分子量聚氯乙烯（PVC），并转移至光学传感器小瓶中。</li>
	<li>现在将分装好的功能组分加入光学传感器小瓶中，以制备所需的光学传感器。CHIII、NaIX 和 NaTFPB 的相对浓度将决定传感器对钠离子的响应特性。可通过调整这些浓度，使传感器理想地响应细胞内钠浓度（Kd 为 10 mM）或细胞外钠浓度（Kd 为 150 mM）。此外，供应商提供的化学试剂可能存在批次间的差异，因此有必要对每批新到的化学组分进行传感器校准，以确认其响应是否正确。本文所述方法用于制备通常适用于细胞内钠离子测量的传感器浓度。</li>
	<li>在化学通风橱中，将 100 μl 浓度为 5 mg/ml 的 CHIII 的四氢呋喃（THF）溶液转移至光学传感器小瓶中。</li>
	<li>将 5 mg 的 NaIX 溶解于 300 μl 的 THF 中，并将全部 300 μl 溶液转移至光学传感器小瓶中，相当于加入 5 mg 的 NaIX。</li>
	<li>将一份 5 mg 的 NaTFPB 溶解于 500 μl 的 THF 中，取 20 μl 该溶液转移至光学传感器小瓶中，相当于加入 0.1 mg 的 NaTFPB。</li>
	<li>向光学传感器小瓶中加入 80 μl 的 THF。</li>
	<li>光学传感器小瓶中的溶液包含：30 mg PVC、60 mg DOS、5 mg NaIX、0.2 mg NaTFPB、0.5 mg CHIII，溶于 500 μl 的 THF 中。轻轻涡旋混匀小瓶，直至所有 PVC 完全溶解。光学传感器溶液应呈红色。无论各组分比例如何，加入小瓶中的 THF 总量应为 500 μL。</li>
	<li>让 NaIX 和 NaTFPB 分装液中残留的 THF 在室温下过夜挥发，并重新标记试管中所含化学物质的准确质量。</li>
</ol>
2. 构建纳米传感器
<ol>
	<li>移液器 100 μl 10 mg/ml 的 1,2-二硬脂酰基-sn将氯仿中的甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-550]（PEG-脂质）加入4 dram玻璃小瓶中。在化学通风橱中使氯仿挥发。可通过氮气或压缩空气吹干加速干燥过程。 </li>
	<li>向含有PEG-脂质的小瓶中加入4 ml所需水溶液。将小瓶置于超声探头下方的实验室升降台上，抬高小瓶直至探头深入溶液约7 mm，以低功率超声处理30秒。本实验采用Branson数字超声仪，设置振幅为15%，使用直径为½英寸的阶梯 horn 探头。水溶液可为任意溶液，例如，为测定传感器响应，我们使用含Trizma碱的10 mM HEPES缓冲液（pH 7.2）。 </li>
	<li>在溶液超声处理的同时，混合 50 μl 光敏材料的 50 μl 在0.6 ml微量离心管中加入二氯甲烷。用移液器混合以确保均匀。</li>
	<li>将超声破碎仪调节至超声处理3分钟。启动超声处理，同时在超声过程中将光纤探针混合溶液加入小瓶中，操作时将移液枪头浸入溶液并缓慢释放溶液 100 μl 快速、均匀地注入溶液。根据所使用的水溶液，溶液应变为蓝色。 </li>
	<li>超声处理继续约30秒，然后降低升降架，使超声探头尖端浸入液面下约2 mm。此时溶液开始充气，逐渐变得不透明。此步骤有助于去除溶液中残留的四氢呋喃和二氯甲烷。 </li>
	<li>超声处理完成后，用5 ml注射器吸取纳米传感器溶液。安装一个 0.2 μm 注射器滤器过滤后，将纳米传感器溶液分装至带螺口盖的玻璃小瓶中。若使用的是钠离子浓度低于10 mM、pH值小于约9的水溶液，则溶液应呈清澈蓝色；否则，溶液应无色或呈粉红色。</li>
</ol>
3. 确定纳米传感器响应
该方法用于测定设计用于测量细胞内钠的纳米传感器的响应。建议使用不同浓度的细胞外钠浓度纳米传感器。
<ol>
	<li>在10 mM HEPES（1 M Na）中配制10 mM HEPES（0 Na）和1 M氯化钠（NaCl）的储备液，并使用trizma碱将这些溶液的pH值调节至7.2。在50 ml锥形离心管中混合0 Na和1 M Na的储备液，配制出NaCl浓度分别为0、1、5、10、20、50、100、200、500、1000 mM的系列溶液。</li>
	<li>使用光学底96孔板测定响应。将每种浓度的钠溶液各100 μl加入一列中的3个孔中，形成3 × 10孔的阵列。</li>
	<li>向每个孔中加入100 μl新鲜配制的纳米传感器，然后将板放入微孔板荧光仪中。我们使用Molecular Devices Spectramax M3仪器。</li>
	<li>使用以下波长读取每个孔：</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>激发 (nm)</td>
			<td>发射 (nm)</td>
			<td>截止 (nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488</td>
			<td>570</td>
			<td>530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488</td>
			<td>670</td>
			<td>610</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>639</td>
			<td>680</td>
			<td>665</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
 每个波长下的纳米传感器信号强度取决于钠离子浓度。波长的选择取决于具体应用。对于细胞内缓慢动态过程的测量，我们使用488 nm/570 nm（激发/发射）和488 nm/670 nm波长组合，以便对两个波长的信号进行比值计算，从而降低噪声。
<ol start="5">
<li>传统上，将 optode 数据转换为 α 值：α = (I - Imin)/(Imax - Imin)，其中 I 为在给定钠浓度下的荧光强度，Imin 为响应测量中的最低强度，Imax 为响应测量中的最高强度。将 570 nm 处的强度与 670 nm 处的强度的比值，或 680 nm 处的强度，转换为 α 值。</li>
<li>使用绘图软件（本实验室通常使用 Excel 或 Origin），以 α 值对钠浓度的对数值作图，将零钠浓度的对数值设为 -1。对响应曲线拟合 S 形曲线，并从该曲线计算 α = 0.5 时对应的钠浓度，该浓度即为传感器响应最佳的浓度。</li>
<li>调整 optode 中 CHIII、NaIX 和 NaTFPB 的比例，以制备在目标钠浓度附近具有最佳响应的纳米传感器。</li>
</ol>
4. 细胞内成像
<ol>
	<li>进行细胞内测量时，需将纳米传感器制备于5 mg/ml葡萄糖水溶液中，并微量注射至细胞内。</li>
	<li>将细胞培养或转移至底部为玻璃盖玻片的培养皿或成像腔室中。</li>
	<li>将细胞孵育在透明培养基或Tyrode's溶液中。将成像腔室或培养皿安装至落射荧光显微镜上。我们使用蔡司LSM 7共聚焦显微镜。</li>
	<li>使用拉针仪将毛细玻璃管拉制成针尖。我们使用Sutter Flaming Brown P-97拉针仪，配合外径1 mm、内径0.78 mm的玻璃管，最终拉制针尖直径约为300–500 nm。</li>
	<li>使用注射器配合Hamilton针头，或使用微载样头和移液器，从针尖后端填充纳米传感器溶液。</li>
	<li>将毛细针安装至连接在显微操作仪上的针夹中，并接入压力控制注射系统。本实验中使用Burleigh EXFO PCS 6000显微操作仪和Medical Systems Corporation注射器。</li>
	<li>将毛细针移至细胞上方并插入细胞质中；有时需轻“敲”操作仪支架以穿透细胞膜。注入纳米传感器溶液后迅速撤出毛细针。</li>
</ol>
5. 体内 成像
所有操作均已通过东北大学动物护理与使用委员会的审查和批准。
<ol>
	<li>纳米传感器用于 体内在磷酸盐缓冲盐水中进行细胞外成像，并调整至在135 mM钠浓度下对钠产生最佳响应。</li>
	<li>对于小鼠体内荧光纳米传感器的注射设置及成像，我们使用 IVIS Lumina II 及其配套的麻醉设备。对诱导麻醉舱和成像舱进行消毒。将 CD1 裸鼠（约 20 g）放入诱导麻醉舱中，并暴露于异氟烷。 异氟烷浓度及氧气流速的设定需根据小鼠的种类和体重进行调整。 等待小鼠完全麻醉。</li>
	<li>小鼠麻醉后，将其从诱导室中取出并放入成像室，保持麻醉状态。对每只小鼠，消毒预定的注射区域。</li>
	<li>用无菌的31G胰岛素注射器吸取 10 μL 纳米传感器时，务必确保去除所有气泡。</li>
	<li>用镊子夹住小鼠背部预定注射部位的一小褶皮肤。在夹住皮肤的同时，将注射器针尖斜面朝上、针头与皮肤平行刺入皮肤。</li>
	<li>注射传感器前，回抽注射器活塞，确认针头未插入血管内。然后轻轻左右移动针头，在皮下形成一个囊腔，以尽量减少因反压导致传感器从注射部位渗漏。注入传感器后，轻柔地拔出注射器。</li>
	<li>轻轻按压注射部位，并擦去可能从注射部位渗出的溶液，以尽量减少未注入皮肤的传感器产生的荧光。</li>
	<li>重复步骤5.4至5.7，直至达到所需的注射区域数量。建议在背部左右两侧各设置三个注射点，共六个注射位点，均匀分布。每只小鼠若针头插入皮肤困难，则需更换针头。 不应在小鼠之间共用针头。 这将最大限度地减少小鼠之间的疾病传播或交叉污染。</li>
	<li> 为成像钠离子荧光传感器，我们使用滤光片组获取小鼠的明场和荧光图像，该滤光片组的参数尽可能匹配纳米传感器的640 nm/680 nm（激发/发射）光谱，同时最大限度减少皮肤自发荧光。 </li>
</ol>
6. 典型结果
<img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig1.jpg" alt="平衡结合图、NaCl浓度、配体结合曲线、化学分析图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 五种不同纳米传感器组对钠离子的响应曲线。每组代表来自不同光学传感器配方的纳米传感器，这些传感器含有相同量的CHIII、NaTFPB、PVC和DOS，但NaIX的含量不同。数据通过639/680 nm处的荧光强度转换为α值。数据为3次重复的平均值，为清晰起见省略了误差线，并使用Origin软件拟合了S形曲线。在此响应曲线中，所用钠离子的最高浓度为500 mM。钠离子纳米传感器对钠离子的Kd值范围从10 mM（橙色菱形）到约150 mM（黑色方块）。
<img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig2.jpg" alt="显示红色蛋白定位的细胞荧光显微镜图像，显微镜图像，细胞研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 显微注射新生小鼠心肌细胞。细胞培养在盖玻片上，置于显微镜下并注射钠离子纳米传感器。图中显示荧光（639 nm 激发）、明场及叠加图像。请注意，部分传感器出现聚集现象，但细胞形态正常，传感器已扩散至整个细胞质，且未见细胞核摄取。
<img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig3.jpg" alt="活体成像，荧光强度图，小动物，分子标志物分布。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 图 3. 小鼠皮下注射钠纳米传感器。将九种不同的钠纳米传感器注射至裸鼠的皮下组织。图像叠加了明场与荧光图像（640/680）。

<ol><li>Adrogue, H. J., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyponatremia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Hyponatremia.</a> N Engl J Med. 342, 1581-1589 (2000).</li>
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<li>Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+ion-selective+nanosensors+for+intracellular+analysis+with+improved+lifetime+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Fluorescent ion-selective nanosensors for intracellular analysis with improved lifetime and size.</a> Nano Letters. 7, 1827-1831 (1021).</li>
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<li>Seiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+sodium-selective+optode+membranes+based+on+neutral+ionophores+and+assay+of+sodium+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of sodium-selective optode membranes based on neutral ionophores and assay of sodium in plasma.</a> Clin Chem. 37, 1350-1355 (1991).</li>
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<li>Harjes, D. I., Dubach, J. M., Rosenzweig, A., Das, S., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-Selective+Optodes+Measure+Extracellular+Potassium+Flux+in+Excitable+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Ion-Selective Optodes Measure Extracellular Potassium Flux in Excitable Cells.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31, 217-221 (2010).</li>
<li>Balaconis, M. K., Billingsley, K. L., Dubach, J. M., Clark, H. A. Pittsburgh Conference on Analytical Chemistry and Applied, , Forthcoming.</li>
<li>Park, E. J., Brasuel, M., Behrend, C., Philbert, M. A., Kopelman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+optical+PEBBLE+nanosensors+for+real-time+magnesium+ion+concentrations+inside+viable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells.</a> Anal Chem. 75, 3784-3791 (2003).</li>
<li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+Near-Infrared+Fluorescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">in vivo Near-Infrared Fluorescence Imaging.</a> Curr Op Chem Biol. 7, 626-634 (2003).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

一旦指示剂溶液配制完成且PEG脂质干燥后，纳米传感器的形成不应超过10分钟。指示剂不仅可在需要时快速制备，而且在4摄氏度下储存时可保持数月稳定。我们已证明，纳米传感器一旦形成，在溶液中至少可稳定保持一周；然而，必须注意防止在此期间发生光漂白，应将纳米传感器避光保存6。尽管本文展示的是钠离子纳米传感器，但指示剂已被用于检测大多数生物学相关的离子，如钾离子和氯离子10,12。我们还已将该技术扩展至葡萄糖等小分子的检测13。
除了制备用于监测不同分析物的纳米传感器外，这些纳米传感器还可进行多种改造，使其适用于绝大多数生物学实验。例如，本例中的表面涂层（聚乙二醇）可通过使用任何水溶性两亲分子轻松替换。这使得纳米颗粒能够针对不同应用或靶标进行功能化修饰。此外，通过改变表面涂层、超声处理强度或所用溶剂，也可调节纳米颗粒的尺寸。
钙离子荧光指示剂在确定细胞内钙信号传导方面具有不可估量的价值；然而，目前尚无可用的钠离子敏感染料具备类似的理想特性。旨在为细胞内离子成像提供替代方法的光导纳米颗粒已研发多年14。我们在先前研究的基础上，开发出专用于细胞内钠离子成像的纳米传感器，有望为理解钠离子信号如何影响细胞功能，以及信号异常如何导致某些疾病提供有效手段。
荧光纳米传感器的应用 体内 为监测分析物提供了一种实时、微创的替代方法，相较于抽血等其他方法更具优势。3 基于上述技术的钠离子和葡萄糖纳米传感器已被证明可分别追踪钠和葡萄糖的变化 体内.3,13 然而，该方法作为监测工具目前仍存在一些局限性。例如，传感器必须包含一种荧光团，其光谱需充分向近红外红区偏移，以尽量减少皮肤背景自体荧光的干扰。15 其次，目前的注射技术无法实现纳米传感器的均匀注射，这可能是由于注射深度不一致等误差所致。尽管存在这些局限性，此类荧光纳米传感器的开发及其成功验证有望使其成为监测患者健康状况的宝贵研究工具与方法。

<table><tbody><tr><td>IVIS Lumina II 仪器套装</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>126273</td><td></td></tr><tr><td>CD-1裸鼠</td><td>查尔斯河实验室</td><td>品系编号：086</td><td>免疫缺陷</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD 生物科学</td><td>328438</td><td>3/10 &lt;sub&gt;cc&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;mL&lt;/sup&gt; ，8毫米，31G</td></tr><tr><td>高分子量PVC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaTFPB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaIX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>薄壁毛细玻璃管</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEG脂质</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;表1.&lt;/strong&gt; 提供本实验所用化学品和设备的清单。未列出的常见化学品均购自 Sigma。</td></tr></tbody></table>

用于生物系统中离子浓度检测的荧光纳米颗粒

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

全身范围内严格调控的离子稳态对于预防脱水等衰弱状态至关重要。1 相比之下，可兴奋细胞产生动作电位需要细胞水平上的快速离子流。2 钠的调节在上述两种情况下均起着重要作用；然而，目前尚无能够持续监测钠水平的方法 体内 3 细胞内钠离子探针 4 无法提供与钙离子探针类似的详细结果。为了弥补这两方面的不足，已开发出可监测钠离子浓度的荧光纳米传感器 体外 和 体内.5,6 这些传感器基于离子选择性光极技术，由增塑聚合物颗粒构成，其中嵌入了钠特异性识别元件、pH敏感型荧光染料以及添加剂。7-9 从机制上讲，钠识别元件将钠离子富集到传感器中。 10 这种提取会导致pH敏感型荧光团释放一个氢离子，以维持传感器内部的电荷中性，从而引起荧光变化。钠离子传感器具有可逆性，并且对钠离子的选择性高于钾离子，即使在高浓度细胞内钾离子存在的情况下也是如此。6 它们直径约为120 nm，表面包被聚乙二醇以赋予生物相容性。利用显微注射技术，可将这些传感器递送至细胞胞质中，已证明其能够监测搏动心肌细胞中钠离子的时间和空间动态变化。11 此外，他们还追踪了钠离子浓度的实时变化 体内 当皮下注射到小鼠体内时。3 本文详细阐述并演示了荧光钠纳米传感器的制备方法，并简要展示了本实验室所采用的生物应用：将传感器显微注射至细胞内，以及将传感器皮下注射至小鼠体内。

我们实验室制备的荧光纳米颗粒可用于成像生物系统中的离子浓度和离子流，例如细胞在信号传导过程中以及生理稳态下间质液中的离子动态。

全身范围内严格调控的离子稳态对于预防脱水等致残状态至关重要。1 相比之下，快速的离子……

以下实验的总体目标是制备用于体外和体内应用的钠离子纳米传感器。首先制备含有纳米传感器组分的光学生物混合物（opto mixture）。第二步是将表面活性剂在水溶液中进行超声处理，使其均匀分散，从而在加入光学生物混合物（opto）后能够形成纳米传感器。接下来，在超声处理下将光敏混合物加入水相表面活性剂混合物中，以在溶液中形成纳米传感器。本视频展示了传感器响应具有可调性，这些传感器可显微注射至心肌细胞内，也可皮下注射到小鼠体内。与现有的荧光指示剂染料等方法相比，该技术的主要优势在于，我们可以将传感器调节至与生理环境相匹配的动态范围，检测更广泛的分析物，并进行比率测量以实现定量分析。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为一旦制备好传感器，将其引入生物环境时可能会感到操作复杂。根据书面方案，在制备光学传感器之前，需预先准备好干燥的钠离子载体四苯硼酸钠（sodium TFPB）和铬莫福尔三号（chromo 43）的储备液。在通风橱中，将所有材料加入一个 1.5 毫升玻璃小瓶内。使用聚四氟乙烯涂层螺旋盖，轻轻涡旋振荡小瓶，直至所有聚氯乙烯完全溶解。溶液应呈现红色。开始制备纳米传感器，将100微升浓度为10毫克/毫升的PEG脂质加入一个4克重的玻璃小瓶中。接着，加入4毫升所需水溶液，例如10毫摩尔的HEPES溶液。使用实验室升降台将振荡探头同步插入小瓶中7毫米深度，并施加低功率超声处理30秒。在0.6毫升离心管中，用移液器加入50微升光敏材料和50微升二氯甲烷，确保混合均匀。接着，开始持续3分钟的超声处理。超声开始时，将移液管尖端浸入溶液，加入100 µL的光响应混合物，并一次性快速均匀地注入全部体积。如果pH值升至七以上，溶液将变为蓝色；若无钠存在，则无法从溶液中去除残留的四氢呋喃和二氯甲烷。将超声探头插入深度调整至两毫米。随着剩余的三分钟时间结束，溶液将逐渐变得不透明。超声处理完成后，用一支五毫升注射器吸取纳米传感器溶液。安装滤器，并将纳米传感器溶液分装至带螺口盖的玻璃小瓶中。首先配制10种钠离子浓度逐步升高的溶液，用于测定纳米传感器的灵敏度。将0摩尔和1摩尔的钠离子储备液加入50毫升锥形管中进行混合。随后，在光学底96孔板中，向每列的三个孔中各加入100微升不同浓度的钠离子溶液。然后向每个孔中加入 100 µL 新鲜配制的纳米传感器，将酶标板装入微孔板荧光计，并设置适合所用发色团的最佳激发波长、发射波长和截止波长。所选波长取决于具体应用，这些波长可用于细胞内快速动态测量或降低信号噪声。为获得α值，将570纳米处的光强比值除以670纳米或680纳米处的光强比值。将α值对钠浓度的对数作图，设定零钠浓度的对数值为负一。现在将响应拟合为S形曲线，并从该曲线计算α值为0.5时的钠离子浓度。这代表传感器响应最适的钠离子浓度。利用该信息，调整钠离子载体四苯基硼酸盐（sodium TFPB）与铬离子载体四（chromo iono four three）在光学传感器（opto）中的比例，以制备具有最适钠离子浓度的纳米传感器。例如，五组不同纳米传感器的典型响应曲线，代表了不同的光敏配方，仅在四种10的钠含量上有所差异。进行细胞内成像时，将细胞培养基替换为透明介质（如Tyrode溶液），并将细胞转移至成像腔室。随后，用含有5毫克/毫升葡萄糖水溶液配制的纳米传感器溶液回填经拉制的玻璃微针。然后将移液管安装到显微操作器上，并连接至压力控制的注射系统。将移液管下移至细胞表面并进入细胞质。有时需要轻敲操作器支架以刺穿细胞膜。注射数百皮升的纳米传感器溶液，然后迅速撤出移液器。使用麻醉室通过异氟烷麻醉一只CD-1裸鼠。麻醉后，将小鼠放入已消毒的成像室中。接着，用适当的 KD 值在 10 毫摩尔 PBS 中配制 10 微升纳米传感器，注入无菌的 31 号胰岛素注射器中。使用镊子确保去除所有气泡。在小鼠背部预定注射部位轻轻捏起一小褶皮肤，同时固定住皮肤。将注射器斜面向上、针头与皮肤平行地刺入皮肤。现在回抽注射器活塞，以确认针头未插入血管内。为减小回流压力，可轻轻左右移动针头，在皮肤内形成一个囊腔。然后注入传感器，并轻柔地拔出注射器。对注射部位施加轻柔压力，并擦去可能从注射部位渗出的溶液。通常沿背部进行六个等间距的注射。若在不同小鼠上进行操作，应更换针头以最大限度减少疾病传播和交叉污染。注射后，使用与纳米传感器激发-发射光谱相匹配的滤光片组，采集明场和荧光图像，以同时降低皮肤自发荧光的干扰。这些新生小鼠心肌细胞在盖玻片上培养，并注射了钠离子纳米传感器。该荧光图像的激发波长为639纳米。这是同一细胞的明场图像，而此图为两者的叠加图像。会出现一定程度的传感器聚集，但细胞形态正常。传感器已扩散至整个胞质溶胶，且未见细胞核摄取。此明场与荧光图像的叠加图显示，将九种不同的钠离子纳米传感器注射至裸鼠皮下组织的皮下间隙中。只要操作得当，Masten 制备纳米传感器的过程可在数分钟内完成，并可应用于任何研究中以测量可逆的实时分析物通量。观看本视频后，您应能充分理解如何将纳米传感器载入细胞内或皮下空间，以在生物环境中进行定量测量。

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