Name: 形状记忆聚合物主动细胞培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 了解形状记忆聚合物主动细胞培养技术，通过温度触发实现基底形貌动态变化，结合荧光显微镜观察细胞骨架重组行为，为组织工程和细胞力学生物学研究提供创新方法。

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作者谨此感谢 Kelly A. Burke 在 ACC 底物制备方面的技术支持。基于发表于 生物材料，Davis KA， 等形状记忆聚合物基底上的细胞动态行为 生物材料，doi:10.1016/j.biomaterials.2010.12.006，版权所有 Elsevier (2011)。本材料基于美国国家科学基金会（NSF）资助号 DMR-0907578 支持的工作。

1. NOA63的等温紫外光固化
<ol>
<li>使用玻璃载片（75 mm × 25 mm × 1 mm）、1 mm 厚的聚四氟乙烯（Teflon）垫片和铝板（75 mm × 25 mm × 3 mm）制备了一个定制的固化室，如图1所示。该固化室使用小型文件夹夹固定。</li>
<li>通过聚四氟乙烯垫片上的孔，使用18号针头将NOA63注入固化室中。可轻微加热NOA63以利于注入。</li>
<li>将固化室置于设定为125 °C的加热板上，加热5分钟，使其温度均匀。</li>
<li>在紫外灯固化室（λmax = 365 nm；见表格）中对NOA63进行预固化，紫外灯距离玻璃表面6.5 cm，持续20分钟。</li>
<li>在NOA63仍处于温热状态时，使用刀片将其从固化室中取出。</li>
<li>将NOA63置于125 °C加热板上，在紫外光下后固化3小时40分钟。</li>
<li>将NOA63在-20 °C条件下干燥保存。</li>
</ol>
2. NOA63的形状记忆表征
<ol>
<li>使用定制冲头（见表格）热压成型固化的 NOA63 薄膜，制备哑铃形试样，其尺寸如图2所示。</li>
<li>将试样装入配备拉伸夹具的动态力学分析仪（DMA；见表格）中。将仪器设置为“力控制”模式，然后按以下程序设定测试步骤：
<ol>
<li>在 95.00 °C 下平衡</li>
<li>等温保持 10.00 分钟</li>
<li>以 0.300 N/min 的速率将力升至 2.500 N</li>
<li>等温保持 5.00 分钟</li>
<li>以 2.00 °C/min 的速率降温至 20.00 °C</li>
<li>等温保持 10.00 分钟</li>
<li>以 0.300 N/min 的速率将力降至 0.015 N</li>
<li>等温保持 5.00 分钟</li>
<li>以 2.00 °C/min 的速率升温至 95.00 °C</li>
<li>重复步骤 2–9 两次</li>
</ol></li>
</ol>
3. 活性细胞培养基质的制备
<ol>
<li>可从等温固化的SMP薄膜中制备单个样品。使用剃刀将SMP薄膜切割至所需尺寸。将SMP置于加热板上，温度设定高于其Tg，以降低模量并便于切割。</li>
<li>临时形状可通过多种不同方式固定。此处我们使用带有加热/冷却压板的台式液压机压印出临时表面形貌。将压板温度设定在高于Tg的水平。</li>
<li>通过在黑胶唱片上固化环氧树脂制备压印模具。该模具可产生平行沟槽的临时形状。此处，压印模具具有三角形峰，高度为35至40 μm，宽度为60 μm，间距为80 μm。压印模具可由其他材料制成，并具有不同的表面形貌，但在压印温度下必须比NOA63更刚硬。将SMP样品正面朝下放置在压印模具上，并将样品与模具一同放入压机中。</li>
<li>施加约100 kPa的预载荷，使加热压板与样品接触，并保持约5分钟，以使样品达到均匀温度。</li>
<li>对样品施加1–6 MPa的压力，并保持1分钟。4.7 MPa的应力会导致压印模具表面形貌复制不完全。所形成的临时表面形貌具有圆化峰，高度为25至35 μm，宽度为150 μm。若施加更高应力，SMP将发生断裂。施加较低应力可引入振幅较小的表面形貌。</li>
<li>将温度降至Tg以下。此处我们利用压机压板的水冷功能实现降温。</li>
<li>当温度低于Tg时，撤除外加力。</li>
<li>样品可在-20 °C条件下干燥保存。在该储存条件下，使用黑胶唱片压印模具制备的样品在两个月后其振幅恢复值下降小于1 μm。</li>
</ol>
4. 活细胞培养实验
<ol>
<li>使用生物安全柜（BSC）的紫外灯对样品进行灭菌。将样品正面朝下放置于无盖的无菌培养皿中，开启 BSC 紫外灯照射 6 小时。</li>
<li>将样品翻转后转移至新的无菌培养皿中，正面朝上。再次开启 BSC 紫外灯照射 6 小时。</li>
<li>样品在接种细胞前需达到相对稳定的状态。将样品放入 96 孔板中，并加入 150 μl 完全培养基。</li>
<li>将 96 孔板置于 30 °C、5% CO2 的培养箱中，培养至所需的初步恢复状态。本实验中采用 30 小时的培养时间，以获得足够形变幅度用于引导细胞排列。</li>
<li>现在可将细胞接种至样品上。将样品转移至新的 96 孔板中。</li>
<li>向每个样品中加入 150 μl 细胞悬液。本实验中使用浓度为 20,000 个细胞/ml 的 C3H/10T1/2 小鼠胚胎成纤维细胞，以实现单个细胞分离状态（通常不与其他细胞接触）。</li>
<li>为使细胞在临时拓扑结构上贴附并铺展，将样品置于 30 °C 培养箱中培养 9.5 小时。</li>
<li>为检测细胞在转变前的形态，取出样品并进行染色及荧光成像。该材料在大部分紫外光和可见光范围内具有自发荧光。建议使用远红光区域的荧光染料（如 Alexa Fluor 647），以降低背景信号。</li>
<li>为触发样品恢复，将 96 孔板转移至 37 °C 培养箱中继续培养 19 小时，使材料完成恢复，并使细胞适应新的拓扑结构而调整其形态。</li>
<li>取出样品，施加适当的染色剂（如用于纤维状肌动蛋白成像的鬼笔环肽）并进行成像操作。</li>
</ol>
5. 典型结果：
固化后的NOA63是一种透明的玻璃态固体，具有优异的形状记忆性能，如图3所示。本例中材料按上述方案1进行固化，表现出均匀的玻璃化转变温度Tg为51.1 °C（由储能模量E'下降起始点确定）。从单向形状记忆循环（加热、变形、冷却、恢复，图3）可以看出，在20 °C卸载后固定了较大比例的应变，对应的固定率15（Rf）为89.3%（三次循环取平均值；下文中Rr同理）。在加热过程中，该固定应变在相对较小的温度范围内以84.4%的恢复率（Rr）得以恢复。此外，形状记忆性能在三次循环内未出现退化，所有曲线几乎完全重合。
本方案中选用 NOA63，因其可从生产商处便捷获取，且以不含溶剂、易于光固化并含有光引发剂的预聚物形式提供。然而，供应商未公开其具体成分。研究发现，该材料可支持较高的细胞黏附率和细胞存活率。最终，其相变温度可调节至在两种适用于细胞培养的温度之间产生显著的恢复形变。若其他多种聚合物体系的相变温度与细胞培养条件兼容，并能促进细胞黏附与存活，则也可在本方案中使用。
在 30 °C 下，临时形貌（沟槽）的振幅随时间逐渐减小。在 30 °C 下持续 30 小时后，振幅已减少约 50%（图 4，时间 0）16。在接下来的 9.5 小时内进一步减少 10%。当通过将温度升高至 37 °C 触发恢复时，振幅在 9.5 小时内降至初始振幅的 0.5%。对于所使用的压印模具和 4.9 MPa 的压印应力，这相当于将 13 μm 的沟槽从功能性结构变为近乎平坦的表面。
通过使用活性细胞培养基底来控制细胞行为的一个例子是细胞骨架结构的改变。在触发恢复之前，临时沟槽基底上的肌动蛋白微丝沿沟槽方向排列（图5a）16。温度升高引发恢复后，微丝发生重组并呈现随机取向。具有静态沟槽或静态平坦表面的对照样品在温度升高后不会发生重组（图5b,c）。
<img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig1.jpg" alt="光学装置示意图；玻璃、聚四氟乙烯、铝层、NOA63胶粘剂。用于光子学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1： NOA63固化腔的示意图。左侧为截面图，右侧为移除玻璃盖后的俯视图。
<img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig2.jpg" alt="拉伸试验样品示意图；用于静力学平衡分析的尺寸标注；单位为 mm。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2： 用于块体形状记忆性能表征的哑铃形几何结构。W：窄段宽度，L：窄段长度，G：标距长度，WO：总宽度，LO：总长度，D：夹具间距，R：圆角半径，以及RO：外圆半径。
<img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig3.jpg" alt="应力-应变-温度图；力学行为；相变；三维图；材料科学。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3： 单次固化NOA63样品的整体单向形状记忆效应，重复测试3次（星号表示实验起始点）。在星号所示时刻，聚合物被加热，随后通过施加应力使其变形，以设定其临时形状。该应变保持恒定，同时降低温度，使材料在低于聚合物Tg的温度下固定临时形状。随后升高温度，随着临时应变减小，材料恢复至其永久形状。
<img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig4.jpg" alt="形状记忆激活图，相对振幅 vs. 时间（小时），实验数据，图表分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4：形状记忆聚合物（SMP）的恢复可在与细胞培养兼容的温度下触发。压印后初始振幅为25.6 ± 0.8 μm，在30 °C下平衡30小时后（时间0，黑色圆圈），振幅恢复至12.6 ± 1.5 μm。当样品转移至37 °C培养箱（9.5小时）后，振幅在3.5小时内进一步恢复至1.1 ± 0.2 μm。在随后的9.5小时内，振幅恢复至约0.3 ± 0.1 μm，且在最后9.5小时内未观察到可检测的下降（红色三角形）。误差棒表示一个标准差（n = 4–6）。曲线为典型样品的接触式轮廓仪扫描结果。
<img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig5.jpg" alt="细胞形态转变示意图、荧光显微镜图像、沟槽状与平面对照组，1200μm比例尺" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 图5： 细胞肌动蛋白细胞骨架在拓扑结构转变后发生重排。a， 在压印基底上用鬼笔环肽染色的细胞共聚焦图像显示，在转变前及温度升高前，微丝沿沟槽方向排列（白色箭头所示）；转变后，微丝发生重排，呈随机取向。b， 平面对照组基底上的细胞在温度升高前后均显示微丝呈随机取向。c， 沟槽状对照组基底上的细胞在温度升高前后均显示微丝沿沟槽方向排列。比例尺为100 μm。轨迹图同图4。

<ol><li>Liu, C., Qin, H., Mather, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+progress+in+shape-memory+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Review of progress in shape-memory polymers.</a> J. Mater. Chem. 17, 1543-1543 (2007).</li>
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<li>Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+behavior+on+shape+memory+polymer+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates.</a> Biomaterials. 32, 2285-2285 (2011).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

Tg NOA63 的性能可通过固化温度轻松调控。我们利用这一特性制备了可在细胞相容温度范围内触发的形状记忆聚合物基底。NOA63 可被水塑化，从而降低其干燥状态下的 Tg，因此我们提高了干燥的Tg 通过在125 °C下固化，使湿态玻璃化转变温度（Tg）范围移至30至37 °C之间。
所展示的活性细胞培养基质能够调控细胞行为。微丝重组的结果凸显了在动态基质上控制和检测细胞行为的潜力。ACC基质形貌的制备方法简单，且可根据固化模具和压印模具的形状进行扩展。纳米级、微米级和中尺度的形貌均可固化为永久形状，或压印成临时形状。此外，细胞在NOA6316上保持高存活率，并能贴附和铺展。
使用NOA63作为SMP确实提示了若干有待改进的方面。该材料在可见光谱的较宽范围内存在自发荧光，限制了高对比度探针的使用数量。此外，该材料在30 °C时表现出部分恢复，因此在接种细胞之前，压印的表面形貌已经发生变化。这种现象与材料的玻璃化转变温度（Tg</su...

<table><tbody><tr><td>NOA63</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63</td><td>批号 111</td></tr><tr><td>狗骨形冲头</td><td>TestResource, Inc. Shakopee, MN</td><td></td><td>缩小版 IV 型狗骨试样（ASTM D638-03）</td></tr><tr><td>台式液压压机</td><td>Carver</td><td>3851</td><td></td></tr><tr><td>C3H10T1/2 小鼠胚胎成纤维细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-226</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>1357</td><td></td></tr><tr><td>紫外灯</td><td>Spectroline</td><td>SB-100PC</td><td></td></tr><tr><td>动态机械分析仪 (DMA)</td><td>TA Instruments</td><td>Q800</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DMI 4000B</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM 710</td><td>20x/0.8 NA 空气物镜或 40x/1.30 NA 油浸物镜</td></tr></tbody></table>

用于活性细胞培养的形状记忆聚合物

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

形状记忆聚合物（SMPs）是一类“智能”材料，能够在外界刺激（如热刺激）作用下，从固定的临时形状恢复至预设的永久形状1-5。在典型的形状记忆循环中，首先在高于其转变温度 Ttrans（即熔融温度 Tm 或玻璃化转变温度 Tg）的条件下对 SMP 施加形变。该形变本质上为弹性形变，主要导致构成网络链的构象熵降低（符合橡胶弹性理论）。随后，在保持外部应变或应力恒定的条件下，将形变后的 SMP 冷却至其 Ttrans 以下的温度。在冷却过程中，材料转变为更刚性的状态（半结晶态或玻璃态），从而在动力学上将材料“冻结”于该低熵状态，实现宏观形状的固定。在无应力（无约束）条件下，通过持续加热使材料通过 Ttrans，即可触发形状恢复过程。此时网络链重新获得运动能力，并松弛至其热力学上更稳定、熵最大的状态，从而使材料从临时形状恢复至永久形状。
细胞能够感知其周围环境的力学特性6。细胞与其物理环境之间的力学相互作用如何调控细胞行为，是当前研究的热点领域。具有明确形貌特征的基底已成为研究这些机制的有力工具。研究表明，介观、微观和纳米尺度的基底形貌图案可引导细胞取向、细胞黏附以及细胞牵引力7-14。这些发现凸显了基底形貌在细胞培养过程中调控和检测细胞与其物理环境之间力学相互作用的潜力。然而，迄今为止所使用的基底通常为被动型，无法在培养过程中被编程以实现显著变化。这种物理上的静态特性限制了形貌基底在调控培养细胞方面的潜力。
本文介绍了采用表面形状记忆效应的活性细胞培养（ACC）SMP基底，可对基底形貌和变形实现程序化控制。这些基底能够从临时的沟槽形貌转变为第二种近乎平坦的预设形貌。这种形貌变化可用于在标准细胞培养条件下调控细胞行为。

介绍了一种能够在外培养过程中改变拓扑结构的细胞培养基底的制备方法。该方法利用了一类被称为形状记忆聚合物的智能材料，这类材料具有记忆永久形状的能力。此概念可适用于多种材料和应用领域。

形状记忆聚合物（SMPs）是一类“智能”材料，能够从固定的临时形状恢复至预设的永久形状……

本实验的总体目标是在具有随时间变化的表面形貌的基底上培养细胞。首先将形状记忆聚合物编程为可“记忆”的永久形状，再将其编程为临时形状，随后在该临时形状的基底上接种细胞。该操作的最后一步是通过升高温度触发形状记忆聚合物恢复其永久形状，最终可通过荧光显微镜观察到细胞行为变化的结果。大家好，我是Pat Mather。我在雪城大学担任生物医学与化学工程教授，同时也是雪城生物材料研究所的主任。与商业或定制的细胞拉伸装置相比，该技术的主要优势在于，我们能够在单一的聚合物系统中对细胞施加多种复杂的应变。我叫 Jay Henderson，是生物医学与化学工程助理教授，也是雪城大学生物材料研究所的成员。该方法有助于解答力学生物学领域的一些关键问题，例如细胞如何响应其物理环境的动态变化。我叫 Kevin Davis，是雪城大学生物医学工程与化学工程系的一名博士研究生。尽管该方法可为二维力学生物学提供深入见解，但它也可用于其他系统，例如组织工程中的三维形变支架。在开始本操作之前，使用载玻片、1 毫米厚的聚四氟乙烯（Teflon）垫片和一块铝板制备一个定制的固化室。先用小型文件夹夹子固定该固化室，然后通过 Teflon 垫片上的孔，使用 18 号针头将 NOA 63 注入固化室中。随后，将该固化室置于设定为 125 摄氏度的加热板上。在腔室加热后，使其升温至均匀温度并保持五分钟。将紫外灯置于玻璃表面6.5厘米处，对NOA 63照射20分钟以完成固化。使用刀片在NOA 63仍处于温热状态时将其从腔室内取出。然后将形状记忆聚合物直接置于125摄氏度的加热板上，在紫外光下后固化3小时40分钟。为表征NOA 63的形状记忆性能，使用定制冲头通过热压已固化薄膜制备哑铃形试样。最后，将试样装入配备拉伸夹具的动态力学分析仪中进行测试。将仪器设置为力控模式，并按照本视频附带的书面方案编程测试程序。该程序的结果是得到等温固化的形状记忆聚合物或 SMP 薄膜。将 CSMP 置于加热板上，并将温度设定至高于玻璃化转变温度，以降低模量并便于切割。从等温固化的 SMP 薄膜中制备单个样品。使用剃刀将 s 和 p 薄膜切割至所需的样品尺寸。临时形状可以通过多种不同方法固定。此处使用带有可加热和冷却压板的台式液压机来压印出临时的表面形貌。首先，将 PLA 的温度设定在高于其玻璃化转变温度（tg）的水平。在本演示中，通过在黑胶唱片上固化环氧树脂来制备压印模具，从而形成平行沟槽的临时形状。该压印模具可由其他材料制成，并具有不同的表面形貌，但其刚度必须大于 NOA 63。在压印温度下，将 s 样品和 p 样品倒置放置于压印机上。然后将样品和压印机放入压机中。施加约 100 千帕的预载压力，使加热的 PLA 与样品接触，并保持约五分钟，使样品达到均匀的温度。当达到均匀温度后，对样品施加一至六兆帕的压力，并保持一分钟。形状记忆聚合物将发生断裂。若施加更大的应力，则断裂更明显。施加较小的应力以引入振幅较小的表面形貌。施加压力后，利用压机的水冷功能将温度降低至玻璃化转变温度（Tg）以下。当温度低于Tg时，在开始活性细胞培养实验之前撤去施加的力。生物安全柜中的紫外灯用于对样品进行灭菌。将样品朝下放置于无盖的无菌培养皿中，并开启紫外灯照射六小时。随后将样品翻转，转移至新的无菌培养皿中，呈朝上位置。打开紫外灯，持续照射额外六小时。在接种细胞前，需将样品平衡至相对稳定的状态。将样品放入96孔板中，并加入150 µL完全培养基。每孔加入培养基。将培养板置于30摄氏度、5% CO2的培养箱中孵育，直至达到预期的部分恢复状态。本演示中，样品孵育30小时，以产生足够大的振幅用于细胞排列。当达到部分恢复后，可将样品接种细胞。将样品放入新的96孔板中，然后向每个样品中加入150 µL细胞悬液，细胞类型为C3H10T1/2。大多数胚胎成纤维细胞以每毫升20,000个细胞的密度使用。为获得分离的细胞，将细胞在30摄氏度下孵育9.5小时，使其附着并延展于临时拓扑结构上。随后，在转换前取出样品，对细胞形态进行检测，通过染色及荧光成像观察样品。该材料在大部分紫外和可见光范围内表现出自发荧光，因此建议使用光谱远红端的荧光染料（如 Alexa Fluor 647），以降低背景信号。为触发样品恢复，将培养板转移至 37 摄氏度的培养箱中，继续培养 19 小时。此步骤可使材料恢复，同时细胞适应新的拓扑结构。培养结束后，加入适当的染色剂，如用于丝状肌动蛋白成像的鬼笔环肽（phalloidin）。最后一步，可以在新的形貌上对细胞进行成像，此处展示的是单次NOA 63固化后整体的单向形状记忆效应。该过程重复了三次，其中星号表示实验起始时已固化。NOA 63是一种透明的玻璃态固体，具有优异的形状记忆性能。在此情况下，材料已固化，并显示出均匀的玻璃化转变温度（Tg），根据储能模量下降起始点测定为 51.1 摄氏度。此处观察到的应变下降发生在测得的 Tg 温度。在 20 摄氏度卸载后，所施加的 4.7% 应变中有很大一部分被固定，对应的固定率为 89.3%。随后在加热过程中较窄的温度范围内，固定应变的恢复率达到 84.4%。形状记忆性能在三次循环内未出现劣化，所有曲线几乎完全重合，证明了其稳定性。在30摄氏度条件下，临时表面形貌的幅度随时间延长而减小，30小时后显著降低。在30摄氏度条件下。在时间零点处，振幅已减小约50%。在接下来的9.5小时内，振幅进一步减小10%。当通过将温度升高至37摄氏度触发恢复时，对于所使用的压印器和4.9兆帕的压印应力，振幅在9.5小时内减小至初始振幅的0.5%。这相当于将13微米的沟槽结构转变为近乎平坦的表面。该聚合物在细胞培养条件下，于30至37摄氏度的温度范围内发生恢复。这是由于从培养基中吸收水分，水分子对聚合物起到增塑作用，从而降低了玻璃化转变温度（Tg），使其能够在低于干燥状态下51摄氏度的Tg温度下实现恢复。通过使用活性细胞培养基底来控制细胞行为的一个示例，是细胞在临时沟槽基底上细胞骨架结构的改变。在触发恢复之前，肌动蛋白微丝沿沟槽方向排列。通过升温诱导恢复后，微丝发生重组并呈现随机取向。相反，具有静态平面或静态沟槽的对照样品在温度升高后不会发生重组。在进行该实验步骤时，需要注意固化腔的几何形状、聚合物的相变温度、应变固定方法以及聚合物本身的组成均可根据具体实验需求进行调整，以实现所需的相变效果。此外，还可采用其他方法，如实时荧光定量 PCR（real time PCR），来进一步探究基底形变后其机械刺激对细胞基因表达的影响。该技术为细胞力学生物学领域的研究人员探索细胞骨架、重排以及二维软物质物理特性开辟了道路。感谢您对我们工作的关注，感谢您的观看。

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