用于活性细胞培养的形状记忆聚合物

本实验的总体目标是在具有随时间变化形貌的基底上培养细胞。该目标通过以下步骤实现：首先将形状记忆聚合物编程为可“记忆”的永久形状，随后再将该聚合物编程为临时形状，并在该临时形状的表面接种细胞。

该操作的最后一步是通过升高温度触发形状记忆聚合物恢复其永久形状，最终可通过荧光显微镜观察到细胞行为变化的结果。大家好，我是帕特·马瑟（Pat Mather），雪城大学生物医学与化学工程教授，同时也是雪城大学雪城生物材料研究所的主任。

与商业或定制的细胞拉伸装置相比，该技术的主要优势在于，我们能够在单一的聚合物系统中对细胞施加多种复杂的应变。我叫 Jay Henderson，是生物医学与化学工程助理教授，也是雪城大学生物材料研究所的成员。

该方法有助于解答力学生物学领域的一些关键问题，例如细胞如何响应其物理环境的动态变化。我叫Kevin Davis，是雪城大学生物医学工程与化学工程系的一名博士研究生。尽管该方法可用于研究二维力学生物学，但它也可应用于其他系统，例如用于组织工程的三维形变支架。

在开始此操作之前，使用载玻片、1毫米厚的聚四氟乙烯（Teflon）垫片和铝板制备一个定制的固化室。先用小型文件夹夹子固定该固化室，然后通过聚四氟乙烯垫片上的孔，使用18号针头将NOA 63注入固化室内。随后将固化室置于设定为125摄氏度的加热板上。

在腔室加热后，使其升温至均匀温度并保持五分钟。将紫外灯置于玻璃表面6.5厘米处，照射20分钟以固化NOA 63。使用刀片在NOA 63仍处于温热状态时将其从腔室中取出。

然后将形状记忆聚合物直接置于125摄氏度的加热板上，在紫外光下后固化3小时40分钟。为表征NOA 63的形状记忆性能，使用定制冲头通过热压已固化薄膜制备哑铃形试样。最后，将试样装入配备拉伸夹具的动态力学分析仪中进行测试。

将仪器设置为力控模式，并按照本视频附带的书面方案编程测试程序。该程序的结果是得到等温固化的形状记忆聚合物或SMP薄膜，将CSMP置于加热板上，并将温度设置为高于玻璃化转变温度，以降低模量并便于切割。从等温固化的SMP薄膜上制备单个样品。

使用剃刀将 s 和 p 薄膜切割至所需的样品尺寸。临时形状可以通过多种不同方法固定。此处，使用带有可加热和冷却压板的台式液压机来压印出临时的表面形貌。

首先，将 PLA 的温度设定在玻璃化转变温度（tg）以上。在本演示中，通过在黑胶唱片上固化环氧树脂制备压印模具，以形成平行沟槽的临时形状。压印模具可由其他材料制成，并具有不同的表面形貌，但其刚度必须大于 NOA 63。

在压印温度下，将 s 和 p 样品倒置放在压印仪上。然后将样品和压印仪放入压机中。施加约 100 千帕的预载压力，使加热的 PLA 与样品接触，并保持约五分钟，使样品达到均匀的温度。

当达到均匀温度后，对样品施加一至六兆帕的压力，并保持一分钟。形状记忆聚合物将发生断裂。若施加更大的应力，则断裂更明显。

施加较小的应力以引入振幅较小的表面形貌。施加压力后，利用压机平台的水冷功能将温度降低至玻璃化转变温度（Tg）以下。当温度低于Tg时，在开始活性细胞培养实验之前撤除外加力。

生物安全柜中的紫外灯用于对样品进行灭菌。将样品朝下放置于无盖的无菌培养皿中，并开启紫外灯照射六小时。然后将样品翻转，转移至新的无菌培养皿中，呈朝上放置。

开启紫外光照射额外六小时。在接种细胞前，需将样品平衡至相对稳定的状态。将样品放入96孔板中，并加入150 µL完全培养基。

每孔加入适量培养基。将培养板置于含5% CO2的30 °C培养箱中，培养至达到所需的部分恢复状态。本实验中，样品孵育30小时，以产生足够大的振幅用于细胞排列。

部分恢复后，可将样品接种细胞。将样品放入新的96孔板中，然后向每个样品中加入150 µL细胞悬液，细胞类型为C3H10T1/2。

大多数胚胎成纤维细胞以每毫升20,000个细胞的密度使用。为获得分离的细胞，将细胞在30摄氏度下孵育9.5小时，使其附着并铺展在临时拓扑结构上。随后，在转换前取出样品，对细胞形态进行检测，通过染色及荧光成像分析样品。

该材料在大部分紫外和可见光范围内表现出自发荧光，因此建议使用光谱远红端的荧光染料（如 Alexa Fluor 647），以降低背景信号。为触发样品恢复，将培养板转移至 37°C 培养箱中，继续培养 19 小时。此步骤可使材料恢复，并使细胞适应新的拓扑结构。孵育结束后，加入适当的染色剂（如用于丝状肌动蛋白成像的鬼笔环肽）。

最后一步，可以在新的形貌上对细胞进行成像，此处显示的是单次NOA 63固化后整体的单向形状记忆效应。该过程重复了三次，其中星号表示实验起始时已固化。NOA 63是一种透明的玻璃态固体，具有优异的形状记忆性能。

在此情况下，材料已固化，并显示出均匀的玻璃化转变温度（Tg），根据储能模量下降的起始点测定为 51.1 摄氏度。此处观察到的应变下降发生在测得的 Tg 温度。在 20 摄氏度卸载后，所施加的 4.7% 应变中有很大一部分被固定，对应的固定率为 89.3%。随后在加热过程中，在相对较窄的温度范围内，固定应变的恢复率达到 84.4%。

形状记忆性能在三次循环内未出现劣化，所有曲线几乎完全重合，证明了其稳定性。在30摄氏度条件下，临时表面形貌的幅度随时间延长至30小时逐渐减小。在30摄氏度时。

此处以零时刻为参考，振幅已减小约50%。在接下来的9.5小时内，振幅进一步减小10%。当通过将温度升至37摄氏度触发恢复时，对于所用的压印器及4.9兆帕的压印应力，振幅在9.5小时内降至初始振幅的0.5%。

这对应于从13微米沟槽结构到近乎平坦表面的功能性转变。在细胞培养条件下，该聚合物在30至37摄氏度的温度范围内恢复。这是由于从培养基中吸收水分，水起到增塑剂的作用，降低了聚合物的玻璃化转变温度（Tg），从而使其在低于干燥状态下51摄氏度的Tg温度下即可恢复。

通过使用活性细胞培养基底来控制细胞行为的一个实例，是细胞在临时沟槽基底上细胞骨架结构的改变。在触发恢复之前，肌动蛋白微丝沿沟槽方向排列。通过升高温度引发恢复后，微丝重新组织并呈现随机取向。

相反，具有静态平面或静态沟槽的对照样品在温度升高后不会发生重组。在进行该操作时，需要注意，固化室的几何形状、聚合物的相变温度、应变固定方法以及聚合物本身的组成均可根据实验需求进行调整，以实现所需的相变效果。在完成该操作后，还可采用其他方法（如实时荧光定量PCR）来回答更多问题，例如基因表达如何响应基底机械刺激的变化。

该技术为细胞力学生物学领域的研究人员探索二维条件下的细胞骨架、重排以及软物质物理学奠定了基础。感谢您对我们工作的关注，感谢观看。