Name: 低成本的低温光学显微镜舞台制作相关的光/电子显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学习使用常见材料制作低成本低温光学显微镜载物台，用于冷冻光镜与冷冻电镜的关联成像。该方法为研究人员提供了一种经济高效的低温成像解决方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢Brandon J. Zipp和Ken B. Kaplan提供了本研究中使用的酵母菌株。作者还感谢Julio Lenin Dominguez-Ramirez在视频录制方面的协助。J.E.E.感谢美国国立卫生研究院（NIH）通过资助号5RC1GM91755提供的资金支持。

1. 制备与组装
 <ol>
	<li>将铝制散热片放置在直径为22.96 cm（9英寸）的派盘内，距离盘边约2 cm，如图1c所示。使用黑色记号笔在散热片上标记钻孔位置。注意：如果铝块（可在当地废旧金属商店或在线网站 <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> 购买）未预先钻孔，则需在步骤1之前安排好钻孔和沉孔，以便将铝块固定在派盘上。我们使用了5个孔将铝块固定在平台上，并额外设置了4个孔，以便氮气气泡从铝块下方逸出。</li>
	<li>将冷冻网格盒放置在铝制散热片附近，并标记其凹槽及两侧位置。</li>
	<li>使用#17钻头为铝制散热片的标记位置钻导向孔，使用#35钻头为冷冻网格盒的标记位置钻导向孔。</li>
	<li>使用5颗#10、1.9 cm（3/4英寸）平头开槽螺栓及配套螺母，以及15个#10垫圈安装铝制散热片。每个孔下方在铝块底部放置两个垫圈，第三个垫圈置于派盘背面。注意：靠近观察区域的铝块若存在未固定的悬空部分，可能导致振动，从而限制载物台的成像能力。请检查并确保所有安装螺栓均已牢固拧紧。</li>
	<li>从派盘背面插入3颗#4、0.95 cm（3/8英寸）圆头开槽螺栓及配套螺母，作为冷冻网格盒的安装支架。</li>
	<li>用胶带将4根筷子两两并排绑在一起，每对筷子上下叠放。将每对筷子分别固定在烤盘的对边，作为间隔垫块。</li>
	<li>分别用ddH2O润湿烤盘和派盘的顶面与底面。</li>
	<li>在烤盘中填充两层隔热喷雾泡沫，并在进行下一步前将每一层润湿。</li>
	<li>将派盘压入泡沫中。</li>
	<li>将两个盘子翻转倒置，并向下按压烤盘，直至间隔垫块与派盘接触。在烤盘上方放置任意重物，并静置过夜使其固化。</li>
	<li>使用锯齿刀沿盘边缘切除多余的已干燥隔热喷雾泡沫，并取出筷子。</li>
	<li>将烤盘从派盘中移除。此时派盘及其铝制散热片已完成隔热处理，此后将称为“低温载物台”（图1a）。</li>
	<li>在低温载物台上放置一块透明塑料文件夹板（任意颜色，厚度大于3 mm）。使用黑色记号笔在板上标记冷冻网格盒安装位置，方法是画一个直径约为单个圆形冷冻网格盒1.5倍的圆圈。使用1.9 cm（3/4英寸）的孔锯切出该孔。此文件夹板此后将称为“加载屏”（图1b）。</li>
	<li>将一块新的透明文件夹板放置在低温载物台上，并将其置于显微镜下，使散热片正对物镜下方。使用黑色记号笔标记物镜旋转时的运动路径。</li>
	<li>沿所标记的路径线切割，从文件夹板边缘移除一个半圆形区域。此操作可通过曲线锯完成，或如视频所示多次使用7.62 cm（3英寸）孔锯实现。</li>
	<li>最后，在半圆形区域附近但仍位于盘体范围内的位置，再切出一个1.9 cm（3/4英寸）的孔，作为成像过程中液氮（lN2）液位下降时的补充加注口。此文件夹板此后将称为“观察屏”（图1c）。</li>
</ol>

2. 样品制备
<ol>
	<li>将对数生长期的酵母细胞（在合成完全培养基 SC 中培养）稀释至适当浓度，即 1×10⁶ 个细胞/mL6 cells/mL 在水中</li>
	<li>将 2 mL 稀释的酵母用移液器滴加到 R2/1 400 目覆碳铜冷冻电镜载网（SPI Supplies, West Chester, PA）上，静置吸附 15 秒。</li>
	<li>用镊子夹住铜网背面，轻轻接触一片撕开的柔软纤维素纸（Kimwipe）2秒钟，吸去网格表面多余的液体。</li>
	<li>如有必要，可用以下溶液清洗网格： 3 μL 水滴（1-3次），然后像第3步一样从背面吸干。</li>
	<li>在最后一次洗涤前，将样品装入气动冷冻仪中，悬挂的载网按步骤2.4进行洗涤。用撕去边缘的纸巾（Kimwipe）轻轻 blot 载网表面以去除大部分水分后，迅速将载网浸入液氮中2 冷却的液态乙烷，并转移至冷冻电镜载网盒中保存 1. 注意： 保持样品湿润时，表面残留的液体层应尽可能薄。不当的 blotting 操作会导致样品干燥，或留下对电子束不透明的冰层。</li>
</ol>

3. 冷冻光学显微镜
<ol>
	<li>用液氮填充冷冻载台2 并迅速用加样板（带有一个1.9 cm（3/4英寸）孔的塑料文件夹）覆盖。</li>
	<li>一旦金属达到 lN2 温度下，将冷冻网格盒通过装载屏上1.9 cm（3/4"）的孔，移至由A5部分所述的3个螺丝所构建的转移支架中。将冷冻网格盒从其 holder 上旋下，并取下 holder 以获得更佳操作空间。将冷冻网格盒的 holder 置于液氮中保存2 在另一个杜瓦瓶中 
直至步骤 3.10。冷冻载网盒也应保持在液氮中2 以防止样品载网受热。</li>
	<li>补充 lN2 在低温阶段，位置略低于铝制散热片的顶部。 注意： lN2 成像过程中必须定期检查并补充液氮水平，以确保液氮供应充足2 始终与散热器保持接触。通常情况下，通过观察屏上的加注口每10分钟补充一次。</li>
	<li>将镊子尖端在液氮中预冷2然后用镊子将载网转移至铝制散热片的平坦观察面上，使用加样屏上直径为1.9 cm（3/4英寸）的孔进行定位。</li>
	<li>小心地将冷冻载台移至反射光显微镜物镜孔径下方。</li>
	<li>将透明观察屏置于加样屏上方，然后通过将加样屏缓慢滑动至观察屏下方的方式将其移除。 
	注意： 此时，样品最为脆弱。应尽量减少显微镜周围的任何气流，包括呼吸、附近开门、人员走动等。建议佩戴面部口罩，或在显微镜目镜下方悬挂透明面罩作为预防措施。</li>
	<li>将物镜旋转至冷冻载台的低温氮气环境中，在平坦的散热片观察区域扫描样品。使用标准的明场光学显微镜技术，以低倍物镜对网格进行聚焦，找到中心位置并拍摄概览图像。本实验所用光学显微镜物镜的具体参数详见“实验材料”部分。 注意： lN2 不会与物镜接触， 
且尚未观察到冷却效应对图像质量下降或物镜损伤的影响。</li>
	<li>在高倍镜下聚焦于感兴趣区域，并使用明场、暗场、偏振光或荧光成像采集数据。务必在低倍明场图像上记录该感兴趣区域的位置，以便后续关联分析。若上述所有重新填充液氮的预防措施均已落实2 随后，氮气蒸发所产生的正压足以在成像过程中维持一个无污染的环境（不受室温湿度影响）。</li>
	<li>完成后，将加载屏从观察屏上方滑动覆盖以替换观察屏。通过缓慢滑动将观察屏移至加载屏下方并取下。</li>
	<li>从显微镜上取下冷冻载台，使用预冷的镊子将载网转移回冷冻载网盒中。将冷冻载网盒盖拧紧至冷冻载网盒上，以密封载网并隔绝环境，随后将载网盒转移至液氮杜瓦瓶中，用于储存及后续成像。</li>
</ol>

4. 冷冻电子显微镜
<ol>
	<li>采用标准且成熟的技术，在整个操作过程中始终保持样品处于液氮温度下，将样品载网装入冷冻电镜转移 holder 中。</li>
	<li>将带有样品载网的冷冻 holder 插入透射电子显微镜中。</li>
	<li>在适当的低倍率视野（50–500× 标称放大倍数）下，找到样品载网的中心位置。</li>
	<li>利用步骤 3.7 中先前采集的低倍率冷冻荧光显微镜数据，确定载网中央铜片标签的相对取向（如图 2 所示），并识别出用于关联分析的精确感兴趣区域。</li>
	<li>继续进行显微镜调校、低剂量冷冻电镜成像及数据采集。</li>
</ol>

5. 代表性结果
冷冻阶段（图1a）是获取冷冻荧光显微镜和相关冷冻光镜/冷冻电镜分析所需冷冻光镜数据的有效方法。图2展示了低倍率与高倍率冷冻光镜图像的结合如何帮助您构建参考图谱，从而引导您定位到冷冻电镜中的特定区域。在冷冻电镜数据采集过程中，使用了由此生成的冷冻光镜参考图谱（图2b），以精确定位图3所示的区域。
<img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="平台上的静态平衡装置；机械测试实验系列图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 冷冻载台。a) 冷冻载台的布局包括一个用白色箭头指示的冷冻载网盒转移架和一个铝制散热片。载网在液氮（lN2）环境下从冷冻载网盒中取出，并直接放置在散热片的观察区域，如黑色箭头所示。b) 显示带有加载屏蔽板的冷冻载台的图像。加载屏蔽板上的孔洞正好位于冷冻载网盒支架上方，作为转移样品的端口，并可用于镊子将样品从冷冻载网盒移至散热片上的样品观察区域。c) 冷冻载台位于物镜下方并安装观察屏蔽板后的状态。观察屏蔽板上的特殊切口设计可使物镜轻松摆动到位，而无需移动冷冻载台。观察屏蔽板上远离样品区域的孔洞则作为液氮（lN2）加注口，必要时可用于补充液氮（lN2）液位。
<img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="显微镜分析材料网格，显示光学激发与荧光测量。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 冷冻光镜（cryo-LM）中用于关联研究的导航。 a) 酵母细胞黏附于样品载网的低倍冷冻光镜图像。 b) (a) 中同一图像叠加了感兴趣区域的高倍荧光图像，并以实心橙色多边形标记载网中心。该中心由四个方格组成，其中三个方格外侧带有额外的金属标签，第四个则无。在带有额外金属标签的三个方格中，沿长轴和短轴方向分别有两对方格共享该标签，从而形成不对称中心。该不对称中心可见于图像左上角，用于指示载网在冷冻光镜与冷冻电镜（cryo-EM）之间转移时的旋转角度和手性。通过一张低倍图像可标记多个感兴趣区域，并作为参考图用于在冷冻电镜中定位相同的区域。 c) (b) 中感兴趣区域的放大荧光冷冻光镜图像。HTA1-CFP（一种C端CFP组蛋白标记物）显示为绿色点状结构，标记细胞核的位置。 d) (c) 中对应区域的冷冻电镜图像。 比例尺代表 50 微米。
<img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="显微镜分析；荧光和电子显微照片；细胞结构；荧光成像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 冷冻光镜与冷冻电镜的相关性。 两个视野显示了相同的酵母细胞，分别对应冷冻明场图像（a,d）、
冷冻荧光图像（b,e）和冷冻电镜图像（c,f）。比例尺代表5微米。

<ol><li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li>
<li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%3A+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li>
<li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li>
<li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li>
<li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy%3A+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li>
<li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li>
<li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li>
<li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

利用我们的冷冻载台和样品制备技术，冷冻荧光显微镜（cryo-LM）与冷冻电镜（cryo-EM）的关联研究相比传统的室温方法具有多项优势，包括但不限于：快速固定1,2、减少光漂白3，以及在进行冷冻电镜观察4,5或化学固定/包埋6前对样品完整性进行扫描评估。冷冻电镜数据采集的一个瓶颈在于将样品转移至透射电镜并扫描载网以寻找合适成像区域所需的时间。借助冷冻荧光显微镜的快速数据采集能力5，寻找合适细胞所花费的时间可大幅缩短。因此，我们可通过在冷冻荧光显微镜中预先扫描并标记感兴趣区域，节省时间和成本，从而缓解这一瓶颈问题。
更昂贵或更复杂的低温载台可能实现更高分辨率的低温荧光显微成像。然而，本文所制备的载台已完全满足许多应用需求。若按照文中文字与视频所述谨慎进行低温荧光显微成像及样品载网转移操作，即可实现完全无污染的成像。该方法可实现同一细胞、细胞器或分散于碳支持膜上或存在于薄组织切片中的大分子复合物的荧光显微镜与电子显微镜数据的直接关联7。需要注意的是，该低温载台的价值不仅限于低温荧光显微镜/低温电子显微镜的关联研究，还可广泛应用于整个光学显微镜领域。该低温载台非常适合对温度敏感的样品以及在室温下经戊二醛和多聚甲醛化学固定与包埋过程中可能不稳定的荧光染料/染色剂8、量子点或荧光标记蛋白9。因此，我们希望该低温载台能够为此前因成本高昂或资源受限而望而却步的研究人员提供更便捷的途径。
冷冻光镜技术问题排查
1. 样品吸附： 不同样品对碳支持膜的吸附特性可能有所不同。您可能需要使用其他类型的支持载网，例如连续碳膜、多孔碳膜或聚乙烯醇缩甲醛（formvar）包被的载网来支撑样品。此外，如果样品结合在载网的铜网上而非碳膜表面，则可能需要在加入样品前通过润湿剂孵育或辉光放电处理来调整碳膜表面的化学性质。
2. 载物台稳定性：如果观察到振动，这很可能是由于样品载物台负载过重，而非液氮（lN2）沸腾所致。低温载物台的额外重量有时会导致低频振动沿标准的三轴移动显微镜载物台传播，从而因图像模糊而对成像产生不利影响。该问题可通过使用可调式迷你升降台或带有双螺杆臂的可调适配器从下方支撑显微镜的移动载物台来轻松解决，如视频所示。这两种可调支撑装置均与移动载物台的不可动部分接触，因此仍可实现成像所需的X轴和Y轴方向平移。

<table><tbody><tr><td>1 &amp;#8211; 22.86 cm（9&quot;带斜边的派盘</td><td>好厨</td><td></td><td>当地杂货店</td></tr><tr><td>1 &amp;#8211; 22.86 cm（9&quot;蛋糕模具</td><td>好厨师</td><td></td><td>当地杂货店</td></tr><tr><td>4双筷子</td><td></td><td></td><td>当地杂货店</td></tr><tr><td>1 - Great Stuff 喷涂泡沫</td><td>泡沫填充剂</td><td></td><td>当地五金店</td></tr><tr><td>1 块 4 厘米 × 8 厘米 × 1 厘米的铝块 </td><td></td><td></td><td>当地五金店或金属废料场</td></tr><tr><td>5 - #10 1.91 厘米（3/4）&quot;平头槽口螺栓配螺母</td><td></td><td></td><td>当地五金店</td></tr><tr><td>3 - #4 0.95 厘米（3/8）&quot;圆头带槽螺栓及螺母</td><td></td><td></td><td>当地五金店</td></tr><tr><td>15 个 #10 垫圈</td><td></td><td></td><td>当地五金店</td></tr><tr><td>2 - 透明塑料文件夹</td><td></td><td></td><td>当地办公用品商店</td></tr><tr><td>1 - 冷冻电镜载网盒支架 </td><td>Ted Pella</td><td>160-41</td><td></td></tr><tr><td>1 - 冷冻电镜载网盒操作杆</td><td>Ted Pella</td><td>160-46</td><td></td></tr><tr><td>1 - R2/1 多孔碳膜，400目铜质冷冻电镜载网</td><td>SPI Supplies</td><td>4340C-XA</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;实验材料&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;李&gt;&lt;em&gt;酵母菌株：&lt;/em&gt; Hta1-CFP::Kan（KSC-3382：MATa，ura3-52，lys2-801，ade2-101，trp1-&amp;#916;63, his3-&amp;#916;200, leu2-&amp;#916;1, Hta1-CFP::KanMX6，来自加州大学戴维斯分校Kaplan实验室）。&lt;/li&gt; &lt;李&gt;&lt;em&gt;冷冻光镜技术：&lt;/em&gt; 在 Leica DM4000M 反射式显微镜上，使用 Leica DFC310 FX CCD 相机采集冷冻光学显微图像。明场、暗场和荧光图像采用以下物镜之一获取：HCX PL FLUOTAR 5× 0.15 数值孔径（N.A.）干镜、HCX PL FLUOTAR 10× 0.30 N.A. 干镜、PL FLUOTAR 50× 0.55 N.A. 干镜或 NPLAN 100× 0.75 N.A. 干镜。明场与暗场成像使用 12 V 100 W 钨灯作为光源。荧光成像采用 EL6000 紫外光源，并配合 Leica JC1 滤光片组（激发滤光片：BP 480/30，二向色镜：LP 505，发射滤光片：BP 535/40） &amp;amp; LP 580) 滤光片组&lt;/li&gt; &lt;李&gt;&lt;em&gt;冷冻透射电子显微镜技术&lt;/em&gt; 冷冻电镜图像使用在200 keV电压下运行的JEM-2100-FEG透射电子显微镜（JEOL，日本）采集，配备Gatan 626冷冻转移 holder（Gatan，美国）。显微照片在4,096 × 4,096像素的Tietz CCD相机（TVIPS，Gauting，德国）上以50、200、1,200和4,000倍的标称放大倍数记录。&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

低成本冷冻光镜载台的制备用于关联光镜/电镜成像

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

冷冻光学显微镜（cryo-LM）与冷冻电子显微镜（cryo-EM）的联用在研究细胞动态过程和超微结构方面具有多项优势。首先，两种技术均可在接近天然状态的环境中对细胞进行成像。其次，由于玻璃化过程通过快速物理固定而非缓慢的化学固定来保存样品，从而更好地维持了样本的原始结构。第三，对同一样品先后进行cryo-LM和cryo-EM成像，可实现单个细胞内的数据关联，而非不同“代表性样本”之间的比较。尽管这些优势已在先前研究中得到广泛认可，但由于购置或构建合适的低温光学显微镜载台成本高昂且技术复杂，相关联用技术的普及仍受到限制。本文展示了如何组装并使用一种低成本的低温载台，该载台可在任何实验室以低于40美元的成本自制，所需部件均可在当地五金店或杂货店购得。该cryo-LM载台专为配备长工作距离空气物镜的反射光显微镜设计。在进行关联cryo-LM与cryo-EM研究时，我们采用碳膜覆盖的标准3 mm cryo-EM载网作为样品支撑。将样品吸附至载网后，依照已建立的常规流程进行样品玻璃化处理以及载网的转移与操作，从而实现多技术联用成像。因此，该装置使得任何配备反射光显微镜的实验室均可开展对冷冻水合样品的直接关联成像研究。

我们演示了一种低成本低温载台的制作方法，该载台设计适用于大多数反射光显微镜。这种实验室自制的低温载台可实现冷冻光学显微镜与冷冻电子显微镜之间的高效、可靠的关联成像。

冷冻光镜（cryo-LM）与冷冻电镜（cryo-EM）的联用在理解细胞动态方面具有诸多优势……

大家好，我是 David Carlson，加州大学戴维斯分校生物化学与分子生物学系 James Evans 实验室的一名研究生。在本视频中，我将向您展示如何构建一个结构简单但性能高效的冷冻光学载台，用于关联冷冻光学显微镜与电子显微镜。一个冷冻载台包括一个透明的观察窗口、用于物镜的开孔、液氮杜瓦瓶、用于观察样品的散热片，以及一个样品转移支架。所使用的大部分材料均在当地五金店和杂货店购买。这些材料包括一个9英寸的管状蛋糕模具、一个9英寸的圆形蛋糕模具、四双筷子、发泡填充喷雾剂、一块尺寸为4厘米×8厘米×1厘米的铝块（钻有用于安装编号10-5螺栓的孔）、10号¾英寸平头开槽螺栓及配套螺母、三个4号3/8英寸圆头开槽螺栓及配套螺母、15个10号垫圈、两个透明塑料文件夹、水，以及可从Ted Pella公司购买的冷冻电镜载网盒支架和操作杆。将派盘置于显微镜载物台上，位于物镜下方。将铝块放置在盘子边缘附近，聚焦于铝块表面。检查物镜能否自由地在派盘边缘上方进出。如果未对准，请重新调整铝块的位置并再次检查。一旦确定铝块的位置，即用记号笔标记固定螺栓的位置。将冷冻网格盒放置在铝块旁边，用记号笔在培养皿表面根据已标记的螺栓布局，记录下网格盒缺口及每侧边缘的位置。使用锋利的螺丝和锤子，配合17号钻头，在每个标记点上敲击出起始孔。钻出用于安装铝块的孔，并将每个孔边缘修圆以打磨光滑。接下来，使用35号钻头对冷冻网格盒和培养皿的安装孔进行钻孔并修圆边缘。准备并钻孔完毕。将10号、长度为3/4英寸的带槽平头螺钉插入铝块上的孔中，并在铝块的每个螺钉上放置两个10号SAE垫圈。在派盘上安装螺孔。接下来，先用手指将每个螺栓旋入固定块，再使用电钻拧紧。将派盘翻转，每个螺栓上放置一个10号垫圈，并用螺母固定。使用扳手确保所有螺母均已牢固固定。接下来，从派盘背面将4号圆头开槽螺栓穿过冷冻网格盒的安装孔，并从派盘顶部用螺母将其固定。完成冷冻载台顶部的组装后，我们演示如何在没有塑料夹板和液氮的情况下转移冷冻网格盒。接下来，我们开始准备隔热泡沫模具。首先，将两根筷子用胶带捆扎成一组。然后将每束筷子用胶带固定在蛋糕烤盘的边缘，彼此相对。筷子的作用是确保泡沫保温层具有均匀的厚度。接下来，用水润湿蛋糕烤盘以及派盘的底面。首先添加一层优质材料。将发泡剂均匀喷洒在整个蛋糕模具的底部，然后喷水。再添加第二层填充型发泡剂，并喷水。将派盘均匀而牢固地压入蛋糕模具中。将组合好的模具翻转，并在模具上方放置一个重物。让泡沫过夜固化。泡沫固化后，使用锯齿刀将盘子切割下来，并去除盘子侧面多余的泡沫。取下筷子间隔物，将派盘与蛋糕模具分离。泡沫应保留在派盘上。接下来，将冷冻载台置于物镜下方，并在其上放置一个塑料文件夹。使用记号笔描出物镜来回摆动时的运动轨迹。在靠近培养皿边缘的半圆外侧标记一个 X。使用第二个剪贴板标记人群网格盒安装位置。使用直径为三又四分之三英寸的孔锯和电钻，在另一块剪贴板上钻出用于安装人群网格盒的孔，然后用三又四分之三英寸的孔锯切出X形切口。使用三英寸的空心钻头和台式钻机多次切割，移除半圆形区域，至此 fabrication 完成。样品制备所需的材料包括冷冻电镜载网盒及操作杆镊子、冷冻电镜载网盒转移块、撕碎的化学擦拭纸、冷却杯、液态乙烷杯、400目R2/1方华膜碳支持膜EM载网、泡沫箱以及气动 plunge 冷冻仪。将泡沫箱、冷冻电镜载网盒、转移块、冷却杯和液态乙烷杯用液氮预冷。接下来，将冷冻电镜载网盒放入冷冻载网盒转移块中。用镊子夹住透射电镜载网，使碳膜面朝上。取 2 微升浓度为每毫升 2 × 10⁶ 个细胞的细胞悬液，滴加到载网上表面。将镊子装到气动冲头装置上，用一片撕开的化学擦拭纸贴在透射电镜载网上表面，吸取网格表面的液体，然后迅速浸入液态乙烷悬浊液中。快速将载网从液态乙烷转移至液氮中，并放入冷冻载网盒内。使用冷冻载台时，首先在培养皿中加入液氮，并用文件夹盖住。将冷冻网格盒穿过塑料夹板的整个切口后，从盒中取出一个网格，放置在铝块的观察表面上。将冷冻载台移至显微镜指定位置后，将第二个夹板叠放在第一个夹板上方，并小心地将第一个夹板滑出。插入物镜并正常使用显微镜。首先以低倍放大倍率扫描由三个金属标记指示的网格中心区域。此处以50倍进行聚焦。可以看到覆盖在载网上的薄层玻璃态冰发出荧光。可以看到CFP组蛋白标记物定位于细胞核内。接下来，我切换至100倍物镜，对单个酵母细胞进行聚焦观察。从显微镜上取下冷冻载台时，先将第一个写字板放在第二个写字板上方，然后小心地抽出底部的写字板。将冷冻载台从显微镜上取下，并利用写字板上的完整切口将载网放回冷冻载网盒中。最后，将冷冻载网盒操作杆拧入冷冻载网盒，转移至液氮中，以便日后观察。电子显微镜下，载物台的稳定性非常重要。在显微观察中，我们发现本系统中大多数图像不稳定问题主要来源于冷冻载物台增加的重量对显微镜载物台造成的影响。在没有液氮的情况下，当聚焦于铝块时，可观察到大量不稳定性现象。通过在显微镜载物台前方增加支撑，可显著降低不稳定性。此处展示了一种支撑结构，该结构包含一个可调节的螺钉装置，置于显微镜载物台与底座之间。额外支撑的优势也在冷冻光学显微镜中得到验证，表明不稳定性来源于附加重量，而非液氮气泡。如您所见，这种冷冻光学载台是一种经济且有效的方法，可用于获取冷冻水合细胞的荧光信息。通过明场和暗场扫描，可以定位冰层均匀的区域。一旦找到这些感兴趣的区域，我们便可利用荧光通道观察荧光信号，以标记目标蛋白，在本例中为 CFP 组蛋白标记物。在冷冻荧光成像后，我们可以利用低倍率图像来定位并找到相同的载网、方格，并在冷冻电子显微镜下对相同的细胞进行成像。如您所见，这种冷冻光学载台是一种获取冷冻氢样品荧光图像的有效且经济的方法。通过遵循标准的冷冻电镜转移和成像技术，同一区域也可在冷冻电镜中进行观察。在这种情况下，冷冻光学显微成像数据可作为参考图谱，用于确定进行关联研究的精确区域。该装置可应用于多种样品的关联成像，包括完整细胞、大分子复合物的体外反应、分离的细胞器以及组织的冷冻超薄切片。感谢您的观看，希望您发现这一冷冻光学显微成像装置与我们一样具有实用价值。

low-cost-cryo-light-microscopy-stage-fabrication-for-correlated

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

低成本的低温光学显微镜舞台制作相关的光/电子显微镜

无透镜光学断层成像是一个三维显微技术，在x、y和z方向上的空间分辨率分别达到&lt;1 μm × &lt;1 μm × &lt;3 μm，成像体积可达15–100...

无透镜片上断层显微技术结合多角度照明与像素超分辨率

我们介绍了一种关联显微技术，该技术结合了高速三维活细胞荧光光学显微镜与高分辨率冷冻电子断层扫描技术。通过成像动态的小型HIV-1颗粒与宿主HeLa细胞的相互作用，我们展示了该关联方法的能力。...

动态相互作用三维结构分析的关联显微技术

在此，我们利用直接激光写入技术，制备出三维聚合物微/纳米结构，其形状和分子取向均可实现纳米级精度的精确调控。多种类型的液晶弹性体微结构在光照下产生的形变可在微观尺度上进行控制。...

自由形态光驱动器——微观尺度下驱动的制备与控制

采用相关联的光镜与电镜显微技术（CLEM），通过电子显微镜（EM）对先前经光镜（LM）筛选出的细胞中病毒诱导产生的细胞内结构进行成像。将光镜与电镜结合为一种混合成像方法，以实现对病毒与宿主相互作用的整合性观察。...

用于追踪和成像冷冻固定细胞中病毒蛋白相关结构的关联光镜与电镜技术

基于芯片的超分辨率光学显微镜是一种荧光显微镜的新方法，在成本效益和通量方面具有优势。本文展示了用于全内反射荧光（TIRF）显微镜和基于定位的超分辨率显微镜的芯片制备与成像方案。...

基于光子芯片的高通量全内反射荧光与直接随机光学重建显微技术

本实验方案展示了如何利用冷冻结构光照明显微镜对生物冷冻保存样品进行成像。我们通过成像U2OS细胞的细胞骨架来演示该方法。...

冷冻保存细胞的冷冻结构光照显微镜数据采集

利用聚焦离子束铣削技术，从浸冻的生物样品中制备用于冷冻电子断层扫描的玻璃态原位薄片。...

使用双束扫描电子显微镜制备玻璃态生物样品薄片用于冷冻电子断层扫描

本方案描述了利用标准荧光显微镜对球状体的氧合状态和细胞死亡进行多参数分析，从而实现用于生物打印的高通量球状体制备。该方法可用于控制球状体的活力并实现标准化，这对于构建三维组织、肿瘤微环境以及成功进行（微）组织生物制造具有重要意义。...

低成本氧气显微镜辅助的多细胞球体生物制造

开发了一种多模态快速高光谱成像框架，用于获取宽带振动和频生成（VSFG）图像，同时结合明场和二次谐波产生（SHG）成像模式。由于红外频率与分子振动共振，该方法可揭示具有对称性允许特性的样品的微观结构和介观形貌信息。...

使用线扫描振动和频产生显微技术的多模态非线性高光谱化学成像

本方案详细描述了如何构建单物镜光片荧光显微镜，并用于观察细胞骨架网络。...

可定制单物镜光片荧光显微镜的设计与构建用于细胞骨架网络的可视化

该工作流程利用低温三重共定位成像平台，能够针对尺寸微小（轴向尺寸&lt;1...

使用低温荧光、电子与离子束联用显微镜对细胞进行靶向切割的工作流程

学习使用常见材料制作低成本低温光学显微镜载物台，用于冷冻光镜与冷冻电镜的关联成像。该方法为研究人员提供了一种经济高效的低温成像解决方案。

低成本冷冻光镜载台的制备用于关联光镜/电镜成像

探索更多视频