无试剂检测核酸，蛋白质和小分子的电化学DNA生物传感器的制备

无试剂，"E - DNA"的传感器，电化学传感器表现良好，即使在血液和其他复杂的矩阵直接挑战时，已适应了广泛的核酸，蛋白质和小分子分析物的检测。在这里，我们介绍了这种传感器的制造和使用的一般程序。

该程序的总体目标是准备和使用电化学 DNA 传感器。这是通过首先减少探针 DNA，然后清洁构建传感器的金电极来实现的。该程序的下一步是将硫醇沉积在包含探针 DNA 的金自组装单层上，并放置在金电极上。

然后用巯基乙醇回填金电极表面。为了确保形成完整的形状良好的单层，该程序的最后一步是使用传感器和样品，例如缓冲液、尿液、血清或血液。最终，可以获得通过方波峰值电流或交流电压的变化来显示分析物浓度的结果。

这项技术在分子诊断中具有广泛的意义，因为这些传感器可以直接检测尿液或血清中的许多不同的生物标志物和药物分子。我研究小组的研究生 Aaron Rowe 先生将演示该程序。他将得到与我们合作的两位博士后研究员 Ryan White 博士和 Andrew Bonham 博士的协助。

要开始从定制寡核苷酸合成公司购买相关探针 DNA，在合成过程中通过在探针的 5 个主要端添加 6 个碳硫醇和在其 3 个主要端添加氧化还原活性亚甲蓝来溶解探针 DNA，产生具有可见蓝色调的溶液亚甲基蓝部分。通过测量其在 260 纳米处的吸光度来验证其浓度，使用分光光度计减少探针 DNA 溶液中可能存在的任何二硫键。将 1 μL 探针 DNA 储备液与 2 μL 新鲜制备的 TEP 溶液混合。

用移液管轻轻混合所得溶液。将混合物在黑暗的冷藏容器中孵育 1 小时。在孵育过程中，蓝色溶液应变得透明，因为 TEP 可逆地降低亚甲基蓝。

接下来，用 PBS 缓冲液将还原的 DNA 探针溶液稀释至所需浓度，通常在 25 到 1000 之间。Ano 摩尔传感器的制备工作首先将 0.05 微米的 Illumina 粉末与水混合在细抛光布上。使用这块布抛光一组金圆盘电极，方法是将金表面牢牢地压入湿布中，然后以 8 字形图案移动每个电极大约三分钟。

冲洗后用去离子水冲洗抛光电极。将它们浸入装满去离子水的 EOR 管中。然后对电极进行超声处理 5 分钟，以去除残留的 Illumina 粉末。

超声处理后，将电极放入 0.5 摩尔硫酸溶液中。然后将铂对电极和银、氯化银参比电极放入溶液中，并将它们连接到电位定子上。然后运行一系列体积克级以电化学方式清洁电极表面。

这些程序的详细信息包含在本视频的书面补充和该小组之前发表的 Nature protocols 论文中。在此之后，根据前面描述的程序在 KCL 硫酸溶液中进行第二次电化学清洗。接下来，在 Iraq 中安排一组两毫升的 einor 管，并用 200 μL 的探针 DNA 溶液填充每个管。

该溶液中探针、DNA 的浓度将决定探针 DNA 在传感器表面的填充密度，应针对每种新型传感器进行优化。用去离子水冲洗金盘电极。然后将它们浸入相关探针中，在泥石流管中的 DNA 溶液中浸泡 1 小时。

此时，探针 DNA 将通过在金自组装单层上形成硫醇来附着在金电极表面。用去离子水再次冲洗电极后，将它们浸入 einor 管中的两个毫摩尔巯基乙醇中。这回填了表面，确保了完整和稳定的自组装单层。

为防止蒸发，请用 Paraform 将电极密封到惰形管中。将浸入的电极在室温下避光处存放 3 小时至过夜，以确保自组装单层完全形成。要准备传感器在孵育后使用，请用去离子水冲洗传感器，然后将其浸泡在缓冲液中至少 10 分钟。

使用通过其 5 个主要端的硫醇将 17 个核苷酸探针链通过金电极上固定，该探针在其 3 个主要端包含一个亚甲基蓝氧化还原报告基因。当探针分子与捕获链杂化时，传感器产生的电化学电流减小。首先，用去离子水冲洗新传感器，然后将其浸入空白样品中。

为了记录背景信号，它会产生一个从零到负 0.6 伏的方波测量，振幅为 25 毫伏，步进电压为 1 毫伏。最佳方波频率将取决于探头架构的细节。圆角峰值应出现在大约负 0.25 伏特处，即亚甲蓝的氧化还原电位。

到该峰值的基线电流高度与亚甲蓝和金电极之间的电子转移效率成正比。保存此背景测量。接下来，将电极移至包含目标目标 DNA 分子的溶液中，并使其平衡。

或者，可以将目标 DNA 添加到传感器浸没的溶液中。收集第二个方波伏特格雷厄姆。负 0.25 伏特的峰值高度将与初始背景测量值不同。

这种变化的大小与分析物的浓度有关。它是传感器的主要输出数据。测量后，计算相对信号变化。

这个百分比通常比测量电流的绝对变化更具可重复性，因为它可以校正电极间表面积的变化。程序完成后，可以按照随附的抗体检测书面程序中的说明重新生成传感器。使用传感器，亚甲蓝和硫醇修饰的 DNA 用作锚链，并直接连接到金电极上。

然后将其与第二个识别杂交，即已与相关抗原共价偶联的 DNA 链。然后添加与特异性抗体靶标的孵育。通过将预制传感器转移到包含 100 纳摩尔相关识别的 einor 管中来执行杂交步骤。

PBS 中的 DNA 链将传感器孵育 1 小时。然后浸入 PBS 缓冲液中，以去除任何未杂交的探针，然后进入空白溶液。接下来，将传感器置于相关的空白溶液中，并将铂计数器和银、氯化银参比电极放入溶液中。

将电极连接到电位统计器。如前所述执行方波体积遥测，此示例中使用的特定探头架构的最佳方波频率为 60 赫兹。圆角峰值应出现在负 0.25 伏特附近。

保存此背景测量。孵育 5 至 60 分钟后，将电极转移到含有目标分析物的溶液中，收集第二个方波伏特。如果存在靶标抗体，负 0.25 伏特的峰值将减小。

这种变化的幅度与抗体浓度有关。为了演示小分子检测，传感器表面的探针 DNA 是 aptr。aptr 是在体外选择以结合特定分子分析物的 DNA 或 RNA 分子。

适配子通常可以重新设计以改变其结构。在这种约束下。这里使用的 aptima 在与药物可卡因结合时改变了它的确认。

首先，用去离子水冲洗新传感器并将其浸入没有目标的空白样品中，以记录其产生的背景信号。然后将铂计数器和银、氯化银参比放入溶液中。将电极连接到电位统计器的引线上，执行方波或交流电保险库遥测。

如前所述，此处使用的特定探头结构的最佳方波频率为 60 赫兹。同样，一个圆角峰值应出现在负 0.25 伏特附近，并应保存为背景测量值。然后将电极转移到含有目标分析物的溶液中。

第 32 次孵育后，收集第二个方波或交流电压 Graham。负 0.25 伏特的峰值高度将发生变化。这种变化的大小与目标分析物的浓度有关。

当使用电化学 DNA 生物传感器检测具有此处描述的探针结构的 DNA 时，信号应至少降低 60%当在去离子水中短暂冲洗 3 次后与 200 纳摩尔靶标平衡时，信号应恢复到其原始值的 0.1% 至 5% 范围内。同样，当此处描述的传感器用于检测抗体时，抗体结合后信号应减弱 40% 至 80%。相反，用于检测可卡因的基于 aptima 的传感器在小分子结合后信号增加 200%。

这种变化的幅度取决于传感器上的电化学询问频率和表面覆盖率。用于可卡因传感器。相对较低的表面覆盖率是最好的一旦掌握了这些传感器，就可以在一天内完成这些传感器的制造和使用。

在执行此过程时，请务必记住，电极表面的平方频率或探头密度等参数会极大地影响传感器性能。观看本视频后，您将了解如何准备电化学、DNA 生物传感器、适配子生物传感器和支架生物传感器，并了解如何使用它们进行各种基本测量。该协议中唯一重大的危险是使用硫酸，这显然是腐蚀性的护目镜，并且必须戴手套。