Name: 无试剂检测核酸，蛋白质和小分子的电化学DNA生物传感器的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: 学习制备无试剂电化学DNA生物传感器，用于检测核酸、蛋白质和小分子等生物标志物。该方法采用金电极和硫醇自组装单层技术，可在血液等复杂生物基质中实现高灵敏度检测。

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本工作由比尔及梅琳达·盖茨基金会通过大挑战探索计划（项目编号：OPP1015402）以及美国国立卫生研究院（NIH）通过项目编号GM062958-01和2R01EB002046的资助完成。本工作部分是在美国能源部的授权下，由劳伦斯利弗莫尔国家实验室根据合同号DE-AC52-07NA27344执行的。

1. 实验准备
<ol>
	<li>从定制寡核苷酸合成公司（如 Biosearch Technologies（加利福尼亚州诺瓦托）或 Midland Certified（德克萨斯州米德兰））购买相应的化学修饰探针 DNA。该探针在合成过程中于其 3’-端添加 C6 巯基，并在 5’-端添加氧化还原活性亚甲蓝进行修饰。</li>
	<li>将探针 DNA 溶解于 pH 7.4 的磷酸盐缓冲盐水中，配制成浓度为 200 μM 的溶液，并使用分光光度计在 260 nm 处测定吸光度以确认其浓度。由于 DNA 探针上带有亚甲蓝基团，溶液应呈现可见的蓝色。</li>
	<li>新鲜配制 1 mL 的 10 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP）溶液，溶剂为蒸馏去离子水（DI-water）。根据我们的经验，该 TCEP 溶液在 4°C 黑暗条件下保存可保持活性达一周。</li>
	<li>为还原探针 DNA 溶液中可能存在的二硫键，将 1 μL 探针 DNA 储备液与 2 μL TCEP 溶液混合，并用移液器轻轻混匀。将混合物置于黑暗冷藏容器中孵育一小时。随着 TCEP 可逆地还原亚甲蓝，初始呈蓝色的溶液应变为无色。若溶液未变澄清，可使用新鲜 TCEP 溶液重复该步骤，或尝试在室温下进行。</li>
	<li>一小时后，用 1 mL 缓冲液稀释还原后的 DNA 探针溶液，使其浓度稀释至 200 nM。后续实验中，您将把一组金圆盘电极分别浸入 200 μL 该稀释后的探针溶液中进行孵育。</li>
	<li>新鲜配制至少 2 mL 的 2 mM 巯基己醇磷酸盐缓冲盐水溶液。</li>
</ol>
2. 传感器制备
<ol>
	<li>在精细抛光布上将0.05微米氧化铝粉末与水混合。将一组金圆盘电极（CH Instruments, Austin, TX）的金表面用力压入湿润的抛光布中，以“8”字形轨迹每电极抛光约三分钟。</li>
	<li>用去离子水冲洗抛光后的电极，并将其浸入装有去离子水的Eppendorf管中，超声处理五分钟以去除残留的氧化铝粉末。</li>
	<li>将电极放入0.5 M硫酸溶液中，连接至电化学工作站，并配合铂对电极和银/氯化银参比电极，进行一系列循环伏安扫描，以氧化、还原并电化学清洁其表面。随后在含有0.01 M KCl的0.1 M硫酸溶液中进行第二次电化学清洗。这些清洗步骤的详细信息可参见我们的Nature Protocols论文1以及本视频的补充材料。</li>
	<li>将一组2 mL Eppendorf管置于试管架中，每管加入200 μL探针DNA溶液。该溶液中探针DNA的浓度将决定其在传感器表面的排列密度。传感器性能高度依赖于探针密度，而最佳密度因不同传感器结构而异。因此，此步骤所用的探针浓度应针对每种新型传感器进行优化2。对于迄今我们研究过的探针结构，此步骤中使用的探针DNA浓度范围为15 nM至2 μM，典型值为200 nM。</li>
	<li>用去离子水冲洗金圆盘电极，然后将其浸入Eppendorf管中的相应探针DNA溶液中，孵育一小时。此时，探针DNA将通过巯基在金表面自组装形成单分子层而固定于电极表面。</li>
	<li>用去离子水冲洗电极后，将其浸入含2 mM巯基己醇的Eppendorf管中，在室温下避光孵育3小时至过夜，以确保自组装单分子层完全形成。此步骤通过引入巯基己醇构建混合单分子层，以保证单层结构的稳定性。为防止蒸发，可用封口膜将电极密封于Eppendorf管中。如需，传感器可在该溶液中保存数天。</li>
	<li>当准备使用传感器时，先用去离子水冲洗，然后在缓冲液中浸泡至少十分钟。用于抗体检测的传感器还必须在使用前浸入100 nM的相关识别链溶液中，随后用缓冲液极快速地冲洗一次。</li>
</ol>
3. 传感器测试、DNA 检测
<ol>
	<li>在此方案中，一条17个核苷酸的探针链被固定在金电极上，其3’端带有亚甲基蓝氧化还原标记物（图1）。当探针分子与捕获链杂交时，传感器电路中的电流会降低。</li> 
	<li>用去离子水冲洗一支新的传感器，并将其浸入不含目标物的空白样品中，以记录其产生的背景信号。将传感器连接至恒电位仪的工作电极导线。将铂对电极和银/氯化银参比电极插入溶液中。</li> 
	<li>以 0 到 -0.6 V 进行方波扫描，振幅为 25 mV，步长为 1 mV。最佳方波频率取决于探针结构的具体细节。2,3；对于探针结构，我们所采用的最优值通常在60至600 Hz范围内。您应能在约-0.35 V处观察到一个圆润的峰，即亚甲蓝的氧化还原电位（该峰电位可能因测试溶液的精确pH值略有偏移）。从基线电流到该峰的高度与亚甲蓝和金电极之间电子转移效率成正比（图2）。保存此背景测量结果。</li>
	<li>将电极转移至含有目标DNA分子的溶液中，平衡5至120分钟（具体时间取决于目标物的大小、结构和浓度4,5），然后采集第二幅方波伏安图。在-0.35 V处的峰高将相对于初始背景测量值发生变化，该变化幅度与分析物的浓度相关，是该传感器的主要输出数据（图3）。</li> 
	<li>测量相对信号变化（即相对于背景峰的信号减少或增加的百分比）通常比测量电流的绝对变化更具可重复性，因为这种方法可校正电极表面积的差异。具体操作时，将峰电流与背景峰电流的差值除以背景峰电流。</li>
</ol>
4. 传感器再生
<ol>
	<li>测量完成后，将传感器移入盛有去离子水的容器中浸泡 30 秒，或用去离子水持续冲洗 30 秒。用新鲜的去离子水重复此步骤两次。注意：某些分析物对此清洗方法具有抗性；对于此类情况，可尝试使用 6 M 盐酸胍或 70% 乙醇进行强力冲洗。</li>
	<li>将传感器重新放入将要进行测量的溶液中。一分钟内，峰高应恢复至原始值。值得注意的是，这些传感器在首次测试与再生循环中通常会表现出略大的信号变化，而在后续循环中则呈现高度一致的结果6。</li>
</ol>
5. 传感器测试、抗体检测
<ol>
	<li>在本实验方案中，这些传感器所使用的亚甲蓝和巯基修饰的DNA探针作为“锚定”链7，直接连接到金电极表面。随后，该锚定链与第二条“识别”DNA链发生杂交，该识别链通过共价键连接相应的抗原（图4）。我们已成功通过商业合成公司（如Biosearch Technologies和Panagene）合成了所需的DNA-抗原嵌合体。杂交步骤的操作方法是将预制好的传感器转移至含有100 nM相应识别DNA链的PBS溶液的Eppendorf管中，孵育1小时。</li> 
	<li>将传感器置于相应的空白溶液中，连接至恒电位仪的工作电极引线，并将铂对电极和银/氯化银参比电极插入溶液中。</li>
	<li>按照上述方法进行方波伏安法检测。针对本研究中所采用的特定探针结构，最佳方波频率为60 Hz。您应在约-0.35 V处观察到一个圆润的峰信号。请保存此背景测量数据。</li>
	<li>将电极转移至含有目标分析物的溶液中，孵育5至60分钟，采集第二条方波伏安图。若目标抗体存在，-0.35 V处的峰电流将减小，该变化幅度与抗体浓度相关。</li>
</ol>
6. 传感器测试，小分子检测
<ol>
	<li>在此情况下，传感器表面的探针分子是一种适配体，即一种经过筛选的DNA或RNA分子 体外 特异性结合某一分子分析物，并在其与目标分析物结合时发生结构变化（折叠）8,9 （图5）。在此，我们采用Stojanovic开发的可结合可卡因的DNA适体10,11 实验室</li> 
	<li>用去离子水冲洗一个新的传感器，然后将其浸入不含目标物的空白样品中，以记录其产生的背景信号。将传感器连接到恒电位仪的工作电极导线上。将铂对电极和银/氯化银参比电极放入溶液中。</li> 
	<li> 按照上述方法进行方波伏安法检测。对于本实验所采用的特定探针结构，最佳方波频率为200 Hz（但60 Hz也可行）。您应观察到在约-0.35 V处出现一个圆润的峰。保存此背景测量结果。</li> 
	<li> 将电极转移至含有目标分析物的溶液中，孵育约5分钟，然后采集第二条方波伏安图。在-0.35 V处的峰高将发生变化，该变化幅度与目标分析物的浓度相关。若无法获得可卡因样品，可使用不受管制的普鲁卡因作为替代物。 </li>
</ol>
7. 代表性结果：
当使用第一种结构检测DNA时，在200 nM靶标浓度下平衡后，信号应至少降低60%。 
用去离子水短暂冲洗三次后，信号应回到接近原始值的水平（在0.1–5%范围内）。抗体检测传感器的信号应降低40%至80%。 
用于可卡因检测的适配体传感器，其信号增幅可达200%，具体增幅取决于工作频率和表面覆盖率。对于可卡因传感器，较低的表面覆盖率效果最佳3。
<img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig1.jpg" alt="电化学DNA传感器示意图；通过金电极上的电子转移实现序列检测。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 利用电化学DNA生物传感器检测DNA。
<img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig2.jpg" alt="方波伏安法图谱，电位与电流关系，电化学数据分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 方波伏安法过程中E-DNA生物传感器产生的信号截图。
<img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig3.jpg" alt="方波伏安法图谱，电位与电流关系，电化学分析，SWV结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 屏幕截图显示E-DNA生物传感器在方波伏安法中与分析物杂交前后产生的信号。
<img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig4.jpg" alt="带有金电极、靶标检测和电子转移的电化学DNA传感器流程图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 利用支架型生物传感器检测抗体。
<img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig5.jpg" alt="DNA杂交；分子靶标在金电极上添加的示意图；电子转移（eT）。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5. 使用电化学适体生物传感器检测可卡因或普鲁卡因。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>定制寡核苷酸</td>
			<td>序列</td>
			<td>备注 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>线性探针DNA（LP17）</td>
			<td>5′-HS−(CH2)6−TGGATCGGCGTTTTATT−(CH2)7−NH−MB-3′</td>
			<td>HPLC纯化，可订购含S-S键的形式</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>目标分析物DNA </td>
			<td>AATAAAACGCCGATCCA</td>
			<td>未修饰 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>识别链</td>
			<td>5'-Antigen-TEG- CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3'</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>支架锚定链 </td>
			<td>5'-HS-(CH2)6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH2)7-MB</td>
			<td>HPLC纯化，可订购含S-S键的形式</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A4可卡因适配体</td>
			<td>5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3'</td>
			<td>HPLC纯化，可订购含S-S键的形式</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 探针和靶DNA序列。

<ol><li>Xiao, Y., Lai, R. Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+electrode-immobilized%2C+redox-modified+oligonucleotides+for+electrochemical+DNA+and+aptamer-based+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of electrode-immobilized, redox-modified oligonucleotides for electrochemical DNA and aptamer-based sensing.</a> Nat. Protocols. 2, 2875-2880 (2007).</li>
<li>Ricci, F., Lai, R. Y., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Sumner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Molecular+Crowding+on+the+Response+of+an+Electrochemical+DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Molecular Crowding on the Response of an Electrochemical DNA Sensor.</a> Langmuir. 23, 6827-6834 (2007).</li>
<li>White, R. J., Phares, N., Lubin, A. A., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensors+via+Optimization+of+Probe+Packing+Density+and+Surface+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Optimization of Electrochemical Aptamer-Based Sensors via Optimization of Probe Packing Density and Surface Chemistry.</a> Langmuir. 24, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Lubin, A. A., Vander Stoep Hunt, B., White, R. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Probe+Length%2C+Probe+Geometry%2C+and+Redox-Tag+Placement+on+the+Performance+of+the+Electrochemical+E-DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Probe Length, Probe Geometry, and Redox-Tag Placement on the Performance of the Electrochemical E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 2150-2158 (2009).</li>
<li>Lubin, A. A., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-Based+Electrochemical+Biosensors%3A+The+Case+for+Responsive+Nucleic+Acid+Architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Folding-Based Electrochemical Biosensors: The Case for Responsive Nucleic Acid Architectures.</a> Accounts of Chemical Research. 43, 496-505 (2010).</li>
<li>Lubin, A. A., Lai, R. Y., Baker, B. R., Heeger, A. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-Specific%2C+Electronic+Detection+of+Oligonucleotides+in+Blood%2C+Soil%2C+and+Foodstuffs+with+the+Reagentless%2C+Reusable+E-DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence-Specific, Electronic Detection of Oligonucleotides in Blood, Soil, and Foodstuffs with the Reagentless, Reusable E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 78, 5671-5677 (2006).</li>
<li>Cash, K. J., Ricci, F., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Sensor+for+the+Detection+of+Protein%3FSmall+Molecule+Interactions+Directly+in+Serum+and+Other+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Sensor for the Detection of Protein?Small Molecule Interactions Directly in Serum and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6955-6957 (2009).</li>
<li>Baker, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electronic%2C+Aptamer-Based+Small-Molecule+Sensor+for+the+Rapid%2C+Label-Free+Detection+of+Cocaine+in+Adulterated+Samples+and+Biological+Fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electronic, Aptamer-Based Small-Molecule Sensor for the Rapid, Label-Free Detection of Cocaine in Adulterated Samples and Biological Fluids.</a> Journal of the American Chemical Society. 128, 3138-3139 (2006).</li>
<li>Ferapontova, E. E., Olsen, E. M., Gothelf, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+Aptamer-Based+Electrochemical+Biosensor+for+Detection+of+Theophylline+in+Serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An RNA Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Detection of Theophylline in Serum.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 4256-4258 (2008).</li>
<li>Stojanovic, M. N., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Based+Colorimetric+Probe+for+Cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Based Colorimetric Probe for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 124, 9678-9679 (2002).</li>
<li>Stojanovic, M. N., Prada, P. de, Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Based+Folding+Fluorescent+Sensor+for+Cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Based Folding Fluorescent Sensor for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4928-4931 (2001).</li>
<li>Cash, K. J., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Reusable%2C+DNA+Pseudoknot-Based+Electrochemical+Sensor+for+Sequence-Specific+DNA+Detection+in+Blood+Serum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Reusable, DNA Pseudoknot-Based Electrochemical Sensor for Sequence-Specific DNA Detection in Blood Serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 656-661 (2009).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Sensor+for+Single+Nucleotide+Polymorphism+Detection+in+Serum+Based+on+a+Triple-Stem+DNA+Probe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Sensor for Single Nucleotide Polymorphism Detection in Serum Based on a Triple-Stem DNA Probe.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 15311-15316 (2009).</li>
<li>Zuo, X., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Specificity%2C+Electrochemical+Sandwich+Assays+Based+on+Single+Aptamer+Sequences+and+Suitable+for+the+Direct+Detection+of+Small-Molecule+Targets+in+Blood+and+Other+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">High Specificity, Electrochemical Sandwich Assays Based on Single Aptamer Sequences and Suitable for the Direct Detection of Small-Molecule Targets in Blood and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6944-6945 (2009).</li>
<li>Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Supersandwich+Assay+for+Sensitive+and+Selective+DNA+Detection+in+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Supersandwich Assay for Sensitive and Selective DNA Detection in Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 14346-14348 (2010).</li>
<li>Patterson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Triplex-Forming+Oligonucleotide+Probes+for+the+Reagentless%2C+Electrochemical+Detection+of+Double-Stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using Triplex-Forming Oligonucleotide Probes for the Reagentless, Electrochemical Detection of Double-Stranded DNA.</a> Analytical Chemistry. 82, 9109-9115 (2010).</li>
<li>Ferguson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Electrochemical+DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Electrochemical DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 6503-6508 (2009).</li>
<li>Swensen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous%2C+Real-Time+Monitoring+of+Cocaine+in+Undiluted+Blood+Serum+via+a+Microfluidic%2C+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Continuous, Real-Time Monitoring of Cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4262-4266 (2009).</li>
</ol>

无任何披露内容。

需要注意的是，上述所有实验若要正常进行，电极必须经过适当清洁。以下是我们的电化学清洁步骤指南。使用CH Instruments电化学工作站时，我们通过一组三个宏程序来执行这些清洁步骤。
零相（E-clean O） 
将电极浸入0.5 M H2SO4中，并将其连接至恒电位仪的工作电极。同时连接并浸入Ag/AgCl参比电极和铂对电极。首先进行氧化步骤（2 V，5 s），然后进行还原步骤（0.35 V，10 s）。
第一阶段（E-clean 1） 
在相同的酸性条件下（0.5 M H2SO4），从 0.35 至 1.5 V 进行氧化和还原扫描（以 4 V/s 的扫描速率和 0.01 V 的采样间隔进行 20 次扫描，随后以 0.1 V/s 的扫描速率和 0.01 V 的采样间隔进行 4 次扫描）。
第二阶段（E-clean 2） 
在酸性条件下（0.01 M KCl/0.1 M H2SO4）进行另一组电化学氧化和还原扫描，覆盖四个不同的电位范围（均在0.1 V/s的扫描速率和0.01 V的采样间隔下进行10个循环）：(i) 电位范围从0.2 V到0.75 V；(ii) 电位范围从0.2 V到1.0 V；(iii) 电位范围从0.2 V到1.25 V；(iv) 电位范围从0.2 V到1.5 V。
多种类型的金电极可用于进行这些实验。除了本实验所使用的金圆盘电极外，我们还成功使用了微加工金表面、金丝以及印刷电路板上的金电极。
除了本文所述的传感器外，已有许多其他电化学DNA生物传感器结构被报道。这些结构包括具有假结（pseudoknot）12、三链（triple strand）13、夹心（sandwich）14、超级夹心（super sandwich）15或三螺旋（triplex）16结构的传感器。
未来，我们预计这些传感器将被用于即时医疗诊断。它们已成功整合到多种微流控装置中17,18，相较于光学分析物检测系统具有诸多优势。特别是，这些传感器可在浑浊、光学密度高以及具有强自荧光的样品中正常工作。

<table><tbody><tr><td>金盘电极</td><td>CH Instruments, Inc.</td><td>CHI101</td><td>可重复使用</td></tr><tr><td>合成探针DNA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>合成靶标DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>巯基己醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>725226-1G</td><td>需存放于阴凉避光处</td></tr><tr><td>铂电极</td><td>BASi</td><td>MW-1032</td><td>可重复使用</td></tr><tr><td>Ag/AgCl参比电极</td><td>BASi</td><td>MF-2052</td><td>可重复使用</td></tr><tr><td>抛光布</td><td>Buehler</td><td>40-7212</td><td></td></tr><tr><td>氧化铝抛光剂</td><td>Buehler</td><td>40-6325-016</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7059-1L</td><td></td></tr><tr><td>CH Instruments 605A</td><td>CH Instruments, Inc.</td><td>605A</td><td>可使用任意恒电位仪</td></tr><tr><td>新生小牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4637-500ML</td><td>冷冻保存</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>可使用任意紫外-可见光分光光度计</td></tr><tr><td>PCR混合液</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8862</td><td>冷冻保存</td></tr><tr><td>可卡因</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5776</td><td>需持有美国药品执法局许可证</td></tr><tr><td>普鲁卡因</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9879</td><td>可作为可卡因的替代物</td></tr><tr><td>抗Flag抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804-1mg</td><td></td></tr></tbody></table>

无试剂检测核酸、蛋白质和小分子的电化学dna生物传感器的制备

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

目前的医学实践中，医生需将样本送至中心实验室进行检测，因此必须等待数小时甚至数天才能获得结果。许多患者将从快速的床旁检测中获益更多。为此，本实验室及其他研究团队已开发出一种多功能、无需试剂的生物传感器平台，可直接在未经处理的临床和环境样本中实现对核酸（DNA、RNA）、蛋白质（包括抗体）以及小分子分析物的定量、无需试剂的电化学检测。在本视频中，我们将演示此类“E-DNA”生物传感器的制备与使用方法。具体而言，我们制备并演示了用于检测聚合酶链式反应混合物中的目标DNA序列、HIV特异性抗体以及可卡因药物的传感器。该制备过程仅需三小时的动手操作时间，随后进行过夜孵育，而传感器的实际使用仅需几分钟。

“E-DNA”传感器是一种无需试剂的电化学生物传感器，即使直接在血液及其他复杂基质中检测，仍表现出良好的性能，目前已适用于多种核酸、蛋白质和小分子分析物的检测。本文介绍了一种此类传感器的制备与使用通用方法。

无试剂检测核酸、蛋白质和小分子的电化学DNA生物传感器的制备

目前的医疗实践中，医生将样本送至中心实验室进行检测，因此必须等待数小时或数日才能获得结果。

本实验的总体目标是制备并使用电化学DNA传感器。首先还原探针DNA，然后清洗用于构建传感器的金电极。接下来的步骤是将含有探针DNA的巯基自组装单分子膜沉积到金电极表面。然后用巯基乙醇对金电极表面进行封闭。为了确保形成完整且结构良好的单分子层，该实验步骤的最后一步是使用传感器检测缓冲液、尿液、血清或血液等样品。最终，可通过方波伏安法或交流伏安法的峰值电流变化获得反映分析物浓度的结果。该技术在分子诊断领域具有广泛的应用前景，因为这些传感器能够直接在尿液或血清中检测多种不同的生物标志物和药物分子。本实验操作将由我研究团队的研究生 Aaron Rowe 先生进行演示，协助他的是两位与我们共事的博士后研究员 Ryan White 博士和 Andrew Bonham 博士。首先，从定制的寡核苷酸合成公司购买相应的探针DNA。该探针在合成过程中，其5'端被添加了一个六碳硫醇基团，3'端被添加了一个氧化还原活性的亚甲蓝基团。将探针DNA溶解，得到具有由亚甲蓝基团产生的可见蓝色色调的溶液。使用分光光度计在260纳米处测量其吸光度，以确认其浓度。为还原探针DNA溶液中可能存在的任何二硫键，将1微升探针DNA储备溶液与2微升新鲜配制的TEP溶液混合。用移液管轻轻混合所得溶液。将混合物置于避光的冷藏容器中孵育1小时。在孵育过程中，随着TEP可逆地还原亚甲蓝，蓝色溶液应逐渐变为澄清。接下来，用 PBS 缓冲液将还原后的 DNA 探针溶液稀释至所需浓度，通常为 25 至 1000 阿摩尔。纳米摩尔传感器的制备首先将 0.05 微米的 Illumina 粉末与水混合，涂布于精细抛光布上。使用该抛光布抛光一组金圆盘电极，将金表面牢固地压在湿润的布上，并以“8”字形轨迹移动，每个电极抛光约三分钟。冲洗抛光后的电极后，用去离子水冲洗。将它们浸入装有去离子水的EOR管中。然后超声处理电极五分钟，以去除任何残留的Illumina粉末。超声处理后，将电极放入 0.5 摩尔的硫酸溶液中。然后将铂对电极和银/氯化银参比电极放入溶液中，并连接至恒电位仪。随后运行一系列循环伏安图，以电化学方法清洁电极表面。这些操作步骤的详细信息包含在本视频的书面补充材料中，以及该研究团队此前发表于《自然实验指南》（Nature Protocols）的一篇论文中。随后，根据先前所述方法，在硫酸中的氯化钾（KCl）溶液中进行第二次电化学清洗。接下来，将一组2毫升的艾诺（Einor）离心管排列于伊拉克（Iraq）中，并向每管中加入200微升（µL）的探针DNA溶液。探针DNA在此溶液中的浓度将决定探针DNA在传感器表面的固定密度，应针对每种新型传感器进行优化。用去离子水冲洗金盘电极，然后将其浸入装有相应探针DNA溶液的离心管中，孵育一小时。此时，探针 DNA 将通过巯基在金电极表面形成自组装单分子层而固定在电极上。用去离子水再次冲洗电极后，将其浸入含有 2 毫摩尔巯基乙醇的 einor 管中。此步骤可填补表面空隙，确保形成完整且稳定的自组装单分子层。为防止蒸发，使用对苯二甲醛将电极密封于玻璃管中。将浸入式电极置于室温避光处保存三小时至过夜，以确保自组装单分子层完全形成。孵育完成后，将传感器用于实验前，先用去离子水冲洗传感器，然后在缓冲液中浸泡至少10分钟。使用传感器进行DNA检测时，采用一条17个核苷酸的探针链，该探针链通过其5'端的巯基固定在金电极上，探针的3'端含有一种亚甲基蓝氧化还原信号分子。当探针分子与捕获链杂交后，传感器产生的电化学电流会降低。实验开始时，先用去离子水冲洗一个新的传感器，并将其浸入空白样品中。为了记录背景信号，需从0至负0.6伏特进行方波测量，振幅为25毫伏，步进电压为1毫伏。最佳方波频率将取决于探针结构的具体细节。在约负0.25伏特处应出现一个圆滑的峰，此即亚甲基蓝的氧化还原电位。该基线电流峰值的高度与亚甲蓝和金电极之间电子转移效率成正比。保存此背景测量结果。接下来，将电极转移至含有目标DNA分子的溶液中，并使其达到平衡。或者，可将目标 DNA 加入传感器所浸入的溶液中。采集第二幅方波伏安图。在负 0.25 伏处的峰高将与初始背景测量值不同。该变化的幅度与分析物的浓度相关，是传感器的主要输出数据。测量后，计算相对信号变化。该百分比通常比测量电流的绝对变化更具可重复性，因为它校正了电极间表面积的差异。程序完成后，传感器可按照随附的书面程序中所述的方法进行再生，以用于抗体检测。使用经亚甲蓝和巯基修饰的DNA传感器作为锚定链，可直接连接到金电极上。随后与第二条识别DNA链杂交，该DNA链已通过共价键与相应抗原偶联。接着加入特异性抗体进行孵育。通过将预制的传感器转移至含有100纳摩尔相应识别物的离心管中，完成杂交步骤。将传感器在 PBS 中的 DNA 链内孵育一小时。随后将其浸入 PBS 缓冲液中，以去除未杂交的探针，然后转移至空白溶液中。接下来，将传感器放入相应的空白溶液中，并将铂对电极和银/氯化银参比电极置入该溶液中。将电极连接到恒电位仪。按照之前所述进行方波伏安遥测，本示例中所用探针结构的最佳方波频率为 60 赫兹。在约负 0.25 伏处应出现一个圆润的峰。保存此背景测量值。将电极转移至含有目标分析物的溶液中，孵育5至60分钟后，采集第二次方波伏安图。如果目标抗体存在，负0.25伏处的峰电流将减小。这种变化的幅度与抗体浓度相关。为了演示小分子检测，传感器表面的探针 DNA 是一种适配体。适配体是一种在体外筛选获得的 DNA 或 RNA 分子，能够特异性结合特定的分子分析物。适配体通常可以被重新改造以改变其结构。在此结合过程中，本研究所采用的Aptima在结合可卡因药物后会发生构象变化。首先，用去离子水冲洗一个新的传感器，并将其浸入不含目标物的空白样品中，以记录其产生的背景信号。然后将铂对电极和银/氯化银参比电极放入溶液中。将电极连接到电位恒定仪的导线上，进行方波或交流伏安遥测。如前所述，针对此处使用的特定探针结构，最佳方波频率为 60 赫兹。同样，应在负 0.25 伏特附近出现一个圆润的峰，并将其保存为背景测量值。然后将电极转移至含有目标分析物的溶液中。经过第32次孵育后，采集第二次方波或交流伏安图。在负0.25伏处的峰高将发生变化，该变化的幅度与目标分析物的浓度相关。当使用电化学DNA生物传感器并采用此处所述的探针结构来检测DNA时，信号应至少降低60%。在去离子水中短暂冲洗三次后，加入200纳摩尔的目标物使其达到平衡，信号应恢复至原始值的0.1%至5%范围内。类似地，当采用此处所述传感器检测抗体时，抗体结合后信号应降低40%至80%。相反，基于适体（aptamer）的可卡因检测传感器在结合小分子后，信号可增加至最高200%。这种变化的幅度取决于电化学检测频率以及传感器上的表面覆盖率。对于可卡因传感器，较低的表面覆盖率最为理想。一旦掌握，这些传感器的制备和使用可在一天内完成。在进行该实验操作时，必须牢记方形波频率或电极表面探针密度等参数会显著影响传感器的性能。观看本视频后，您将掌握如何制备电化学DNA生物传感器、适体生物传感器和支架生物传感器，并了解如何利用这些传感器进行多种基础测量。本实验方案中唯一的显著危险因素是使用硫酸，其具有强腐蚀性，因此必须佩戴护目镜和手套。

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