Name: 微波辅助植物病毒病的快速诊断用透射电子显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学习微波辅助透射电子显微镜技术用于植物病毒病的快速诊断。该方法将样品制备时间缩短至约两小时，可在半天内完成病毒检测，显著提高植物病毒学诊断效率。

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本工作由奥地利科学基金（FWF，项目编号P20619和P22988，授予B.Z.）资助。

微波辅助样品制备
<ol>
	<li>在开始样品制备之前，需预先对自动微波组织处理仪（Leica EM AMW；Leica Microsystems，奥地利维也纳）进行程序设置，用于透射电镜（TEM）的微波辅助样品制备（见表1）： 
		<img src="/files/ftp_upload/2950/2950table1.jpg" alt="用于树脂聚合的固定与脱水程序图表，包含温度和试剂详情。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 1"> 
		表 1. 采用微波辐照的样品制备程序。各列从左至右依次表示： 
		<ol>
			<li>瓶号（瓶号）：表示样品瓶在处理器转盘中的装载顺序。</li>
			<li>实际处理步骤。</li>
			<li>各瓶中的试剂。</li>
			<li>当前步骤的持续时间。</li>
			<li>微波辐照关闭前瓶内达到的最高温度。</li>
			<li>微波辐照设置：连续（Continuous）= 快速升温并维持设定温度；斜坡（Slope）= 缓慢升温，至步骤结束时达到最终温度；脉冲（Pulsed）= 快速升温，当温度下降5°C时关闭功率，待再次升温时恢复功率。</li>
			<li>微波辐照的最大功率。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>根据程序设定（表1）新鲜配制样品制备各步骤所需的溶液，将其分装至指定的样品瓶中，将样品瓶装载到转盘上，将转盘插入微波组织处理仪中，最后将第一个样品瓶装入单模腔室。</li>
	<li>在室温下，于建模蜡板上滴加3%戊二醛（Agar Scientific Ltd.，英国斯坦斯特德）溶于60 mM Sørensen磷酸缓冲液（pH 7.2）中，用剃刀片切取感染烟草花叶病毒（TMV）的Nicotiana tabacum叶片小片（1 mm2）。</li>
	<li>立即用精细镊子将组织片转移至指定的网孔宽度约为200 μm的篮筐中，将篮筐叠放在一起，并插入单模腔室。在装载和叠放篮筐过程中，必须确保样品始终被固定液完全覆盖，以防干燥。</li>
	<li>启动预先设定的微波辅助样品制备程序，进行固定、脱水和渗透处理。</li>
	<li>在微波组织处理仪自动进行样品制备的同时，使用剩余植物材料继续进行负染色操作，具体步骤见第3节（负染色）。</li>
	<li>新鲜配制Agar 100环氧树脂：按如下方法混合组分——将24 g Agar 100、16 g 十二烯基琥珀酸酐和10 g 甲基纳迪克酸酐（所有组分均来自Agar Scientific Ltd.，英国斯坦斯特德）加入塑料杯中，加热至40°C并充分混匀，随后加入1.2 g 苄基二甲基胺，彻底混合。在样品制备程序即将结束前（例如表1中第22步），将Agar 100环氧树脂注入指定的聚合模具中。</li>
	<li>程序完成后（表1中第22步结束后），将含有渗透样品的叠放篮筐从单模腔室释放至转盘的最后一个样品瓶中。将转盘从微波仪器中取出，拆开叠放的篮筐，并用精细镊子将样品转移至指定的聚合模具中。在拆解和装载过程中，必须始终确保样品被Agar 100环氧树脂完全覆盖，以防干燥。</li>
	<li>将聚合模具叠放在一起。在叠放和装载过程中，必须确保样品始终被Agar 100环氧树脂覆盖，以防干燥。</li>
	<li>从微波组织处理仪的转盘上移除已使用过的样品瓶，装载已叠放的篮筐，并将转盘重新插入仪器中。</li>
	<li>启动预先设定的聚合程序（表1）。</li>
	<li>在微波组织处理仪自动进行聚合的同时，使用透射电子显微镜［例如 Philips CM10 TEM，FEI（原 Philips），荷兰埃因霍温］观察负染色网格，并按照第3节和第4节所述进行图像分析（负染色与图像分析）。</li>
	<li>程序结束后，从单模腔室中取出聚合模具，拆开叠放的模具，取出含有样品的聚合块。样品现已准备好用于切片机切片。</li>
</ol>
2. 修剪与切片
<ol>
	<li>将一个或多个样品块分别插入样品架中，用于超薄切片，使样品顶部露出样品架约1 cm。</li>
	<li>使用透射电镜专用样品修整仪（例如 Leica Reichert Ultratrim；Leica Microsystems）修整样品块，使块面长度不超过1 mm、宽度约为200 μm，并尽可能包含最多的叶片材料（块面尺寸可能需根据金刚石刀的尺寸进行调整）。</li>
	<li>使用超薄切片机（例如 Reichert Leica Ultracut S；Leica Microsystems），采用45°刀角的金刚石刀（例如 Diatome Ultra 45，Gröpl，Tulln，奥地利）对样品块进行切片，切片厚度应调整至约70至90 nm，切速约为1 mm/s。用镀有formvar（Agar Scientific Ltd.）的铜或镍200目方格载网捞取多层切片。</li>
	<li>在培养皿中对载网上的切片进行后染色：先用柠檬酸铅（Agar Scientific Ltd.；1.1 g柠檬酸铅溶于42 mL双蒸水和8 mL 1 N NaOH中）染色5分钟，培养皿内需部分填充NaOH以营造无CO2环境；随后在室温下用1%醋酸铀（Agar Scientific Ltd.）溶于蒸馏水中染色15分钟。每次后染色步骤之间用蒸馏水清洗1分钟。将载网置于载网盒中自然晾干。</li>
	<li>使用透射电子显微镜（例如 Philips CM10 TEM，FEI，荷兰埃因霍温）观察切片。</li>
</ol>
3. 负染色法
<ol>
	<li>采集约100mg的TMV感染叶片材料，将材料置于载玻片上，加入100μl 60mM Søfrensen磷酸缓冲液（pH 7.2），用刀片研磨2分钟，制备粗汁液。</li>
	<li>取20μl上述匀浆液转移至带有4个或更多孔的聚四氟乙烯（特氟龙）涂层载玻片的第一个孔中（也可将匀浆液转移至一片Parafilm膜上）。</li>
	<li>将表面覆有Formvar膜的载网（Formvar coated grid）放置于匀浆液滴上，确保Formvar膜面（Agar Scientific Ltd.）朝向液滴，孵育5分钟。</li>
	<li>将载网置于两滴200μl 60mM Sørensen磷酸缓冲液（pH 7.2）上，每次2分钟，共洗涤2次。</li>
	<li>将载网在新配制的2%磷钨酸（Agar Scientific Ltd.）溶于60mM Sørensen磷酸缓冲液（pH 6.5）的溶液中孵育1分钟。</li>
	<li>取出载网，置于载网盒中自然晾干。</li>
	<li>使用透射电子显微镜（例如Philips CM10 TEM；FEI，荷兰埃因霍温）观察载网。在21000X或更高的一次放大倍数下，随机选取至少10个负染病毒粒子图像进行拍摄（每张图像中应至少可见10个或更多病毒粒子）。必须确保所有图像的放大倍数一致。</li>
</ol>
4. 图像分析
<ol>
	<li>使用任意图像分析软件（例如 Olympus Life and Material Science Europe GmbH, Hamburg, Germany 的 Cell D 软件，配合颗粒分析工具，或 Media Cybernetics Inc., Bethesda, Maryland, USA 的 Optimas 6.5.1 软件），测量从负染样品电镜照片中随机选取的至少 100 个单个病毒颗粒的长度和宽度。</li>
	<li>计算平均值和标准差，以获得通过负染色法和透射电子显微镜（TEM）观察到的病毒颗粒的平均长度和宽度。</li>
	<li>将测得的长度及超微结构特征（步骤 2.5 中获得）与文献中已知病毒病所引起的病毒大小及超微结构改变进行比较，以明确鉴定病毒病种类。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
经微波辅助样品制备后，通过透射电子显微镜可在感染的Nicotiana tabacum细胞胞质中观察到典型的烟草花叶病毒（TMV）诱导的超微结构改变，例如存在大量呈平行排列的病毒粒子区域（图1A）。此外，在TMV感染叶片的粗汁液中，经负染色后可观察到TMV粒子呈柔韧的杆状结构（图1B）。对100个病毒粒子的图像分析显示，TMV的平均长度为280 nm，宽度为17 nm（图2）。本研究中观察到的TMV感染细胞的超微结构以及病毒粒子的大小，与文献中先前报道的烟草中TMV诱导的超微结构特征及TMV粒子的尺寸范围一致9-15。
<img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig1.jpg" alt="细胞结构中的病毒粒子；电子显微镜图像；纳米级标尺测量；生物学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 感染烟草花叶病毒（TMV）的叶片细胞及病毒粒子的透射电子显微镜照片。A) 图像显示经微波辅助植物样品制备后，Nicotiana tabacum 叶肉细胞的超微结构。注意细胞质中大量平行排列并聚集的病毒粒子。C=含淀粉粒（St）的叶绿体，M=线粒体，N=细胞核，V=液泡，标尺=2μm。B) 图像显示通过负染色法在感病叶片汁液中检测到的病毒粒子。
<img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig2.jpg" alt="病毒颗粒大小分布；病毒粒子长度、宽度的柱状图；平均长度 280 nm，宽度 17 nm。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 病毒粒子的相对大小。对感染叶片汁液进行负染色后，在电子显微镜下观察到的烟草花叶病毒（TMV）颗粒长度与宽度的相对分布。平均值（平均长度/宽度 ± 标准差）由 100 个病毒粒子计算得出。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

微波辅助植物样品制备用于透射电镜（TEM）已被证实可在数小时内提供快速且可靠的超微结构数据3,4,16。本研究所采用方法在细胞器和膜结构的精细结构保存方面，可达到与传统固定及冷冻固定样品相当的水平5,15，同时将样品固定和包埋时间从3天或更长显著缩短至约2小时。这代表了目前文献中报道的最快的透射电镜样品制备方案。本研究描述的方法结合了微波辅助植物样品制备与负染色技术，能够清晰、快速地识别烟草花叶病毒（TMV）诱导的超微结构改变以及病毒颗粒本身。在固定开始后约4小时内，即可完成修块、切片和复染，并在透射电子显微镜下观察TMV诱导的超微结构变化。利用全自动样品制备模式，研究人员可在等待过程中同步进行负染色操作，以确定病毒颗粒的大小和直径。因此，我们可以得出结论：该方法可在约半天内实现对植物病毒病的清晰、快速诊断，这对于未来在农业及植物病理学科研实验中的应用具有重要意义。由于该方法也可用于动物和人类疾病的快速诊断，其在医学和兽医病理学领域具有广阔的应用前景。

<table><tbody><tr><td>戊二醛</td><td>Agar Scientific</td><td>R1312</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Agar Scientific</td><td>R1022</td><td></td></tr><tr><td>Agar 100 树脂</td><td>Agar Scientific</td><td>R1043</td><td></td></tr><tr><td>十二烯基琥珀酸酐</td><td>Agar Scientific</td><td>R1051</td><td></td></tr><tr><td>甲基纳迪克酸酐</td><td>Agar Scientific</td><td>R1081</td><td></td></tr><tr><td>苄基二甲胺</td><td>Agar Scientific</td><td>R1060</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铅</td><td>Agar Scientific</td><td>R1210</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Agar Scientific</td><td>R1260A</td><td></td></tr><tr><td>磷钨酸</td><td>Agar Scientific</td><td>R1213</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>Agar Scientific</td><td>R1202</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM AMW</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica (Reichert) Ultratrim</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>已有更新型号</td></tr><tr><td>Leica (Reichert) Ultracut S</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>已有更新型号</td></tr><tr><td>Diatome Ultra 45</td><td>Gr&amp;#246;pl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM10 透射电子显微镜</td><td>FEI</td><td></td><td>已有更新型号</td></tr><tr><td>Cell D</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimas 6.5.1</td><td>Media Cybernetics Inc.</td><td></td><td>已有更新版本</td></tr></tbody></table>

微波辅助通过透射电子显微镜快速诊断植物病毒病

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

研究病毒引起的超微结构变化对于明确鉴定植物病毒病常常是必要的。采用传统的透射电子显微镜（TEM）样品制备方法，此类研究通常需要数天时间1,2，因此不适用于植物病毒病的快速诊断。微波固定法可显著缩短TEM样品制备时间，同时获得与传统方法相当的超微结构结果3-5。目前已有多种自制微波设备可用于生物样品的成功固定和包埋，以进行TEM观察5-8。本研究以感染烟草花叶病毒（TMV）的Nicotiana tabacum植株为例，证明利用微波辅助的样品制备方法，可在约半天内完成对叶片中超微结构改变的诊断。我们选择使用一种 commercially available 微波设备进行本研究，因其几乎可全自动完成样品制备过程5，而其他现有设备仍需大量手动操作步骤6-8，耗时且费力。由于样品制备过程完全自动化，可在固定和包埋的同时，对剩余TMV感染叶片汁液中的病毒颗粒进行负染，并进一步观察其超微结构与大小。

本研究介绍了一种结合微波辅助植物样品制备与负染色法用于透射电子显微镜检测的技术，可在约半天内实现对植物病毒病的快速、清晰诊断。

病毒诱导的超微结构变化研究对于明确鉴定植物病毒病常常是必要的。采用常规样品制备方法……

本实验的总体目标是通过透射电子显微镜在数小时内诊断植物病毒病。该流程首先采用微波辅助法对感染的植物材料进行固定和包埋。下一步是从植物样品中提取病毒颗粒，并通过负染色法进行染色，随后对包埋的植物样品进行切片。随后在透射电子显微镜下观察样品，并通过图像分析测量病毒颗粒的大小。最终结果表明，该方法能够显示典型的病毒诱导的超微结构改变，并确定病毒颗粒的大小。与现有方法（如在室温下进行常规固定和包埋，该过程可能需要数天）相比，该技术的主要优势在于可将透射电子显微镜的样品制备时间缩短至约两小时，从而在约半天内实现对病毒性疾病的明确诊断。与我共同演示该实验步骤的有来自我们实验室的技术员格哈德·卡巴（Gerhard Kaba）以及同事泽尔尼克教授（Professor Zelnik）。在样品制备程序开始之前，需准备好适用于电子显微镜样品处理的自动微波组织处理仪 LA A-E-M-A-M-W，并设置相应的程序。根据程序化方案中描述的不同步骤，配制固定、脱水和浸润所需的溶液，并按照方案要求将溶液加入指定的小瓶中，然后将小瓶装载到转盘上。将转盘插入微波组织处理仪中，随后将第一个小瓶放入单模腔室。接下来，在室温下，将感染烟草花叶病毒（TMV）的烟草（nicotiana tobacco）叶片切成小片，置于盛有戊二醛的索伦森磷酸盐缓冲液液滴中的石蜡板上，用剃刀片进行操作。在样品收获及将样品装入篮子的过程中，必须始终确保样品被固定液完全覆盖，以防止其干燥。使用精细镊子，立即将组织小片转移至指定的网孔宽度约为200 µm的篮子中。将篮子叠放在一起，插入单模腔室。启动先前编程的微波辅助样品制备程序，进行固定、脱水和浸透。在样品制备程序即将结束前，将新配制的Agar 100环氧树脂倒入指定的聚合模具中。完成实验方案后，将含有浸润样品的堆叠篮子从单模腔室中释放至转盘的最后一个样品瓶中。从微波仪器上取下转盘，并从转盘中取出含有样品的样品瓶。然后用精细镊子将篮子从样品瓶中取出并拆开堆叠。将样品加入指定的聚合模具中。接着，将聚合模具叠放在一起，并从微波组织处理仪的转盘上取下先前使用的样品瓶。用叠放好的篮子装入转盘，并将转盘插入微波设备中。现在启动先前编程的聚合反应程序。程序完成后，从单模腔室中取出聚合模具并将其拆开。取出含有样本的聚合块，这些聚合块现已准备好使用切片机进行切片，以开始对含有样本的聚合块进行切片的步骤。将一个或多个样品块分别插入样品 holder 中，用于超薄切片。样品朝上，露出 holder 约一厘米。使用透射电镜专用样品修块仪修整样品块，使样品断面长度不超过一毫米，宽度为 200 微米，并尽可能包含最多的叶片材料。将超薄切片机设置为以约每秒一毫米的切削速度，切出厚度约为70至90纳米的切片。使用45度刀角的金刚石刀对样品块进行切片。用经VAR涂层处理的铜或镍200目方格载网捞取多个切片，然后将载网上的切片置于部分装有氢氧化钠（NaOH）的培养皿中，以营造无二氧化碳的环境，用柠檬酸铅染色五分钟。用蒸馏水冲洗载网1分钟。最后，在用蒸馏水冲洗载网1分钟后，于室温下用1%醋酸铀的蒸馏水溶液复染15分钟，然后在载网盒中空气干燥。在微波组织处理仪自动进行样品制备的同时，对剩余的植物材料进行负染色。首先，采集约100毫克感染烟草花叶病毒（TMV）的叶片材料，并在载玻片上加入磷酸盐缓冲液，用刀片研磨2分钟，制备粗制SAP提取液。将20微升所得匀浆液转移至聚四氟乙烯（Teflon）包被的载玻片的第一个孔中。使用四个或更多孔的载玻片。然后将一层有碳膜（form VAR 涂层）的铜网置于匀浆液滴上，碳膜面朝向液滴，孵育五分钟。通过将铜网置于一滴索伦森磷酸盐缓冲液上，清洗铜网两分钟。再重复洗涤两分钟。接着，将载网与新鲜配制的磷酸化棉签酸溶液孵育一分钟。一分钟后，取出载网，使其自然风干。在网格框中，将经负染色的载网放入样品台，并用透射电子显微镜观察。当微波组织处理仪自动进行聚合反应时，随机选取至少10个负染色离子拍摄图像。每张图像上应至少可见10个或更多的离子。使用透射电子显微镜在21,000倍或更高的一次放大倍数下观察时，必须确保所有图像具有相同的放大倍数。经微波组织处理仪自动处理的组织样本切片也需通过透射电子显微镜进行观察。透射电子显微镜所获取图像的分析可采用任意图像分析软件进行。使用带有颗粒分析工具的计算机软件。从负染样品的显微照片中随机选取至少100个单独的病毒颗粒，测量其长度和大小。计算均值和标准差，以获得经微波辅助样品制备后通过负染色法和透射电子显微镜观察到的病毒颗粒的平均长度和宽度。通过透射电子显微镜可在感染烟草花叶病毒（TMV）的烟草属烟草细胞的细胞质中观察到典型的TMV诱导的超微结构改变，例如含有离子并呈平行排列的大片区域。在此透射电子显微照片中，C代表含有淀粉的叶绿体，St.M代表线粒体，N代表细胞核，V代表液泡。此外，在感染烟草花叶病毒（TMV）叶片的粗制SAP中，经负染色后可观察到TMV颗粒呈杆状结构。图一B。该图显示了在电子显微镜下观察到的100个TMV颗粒的长度和宽度的相对分布情况。经负染色后，对感染叶片汁液中的病毒颗粒进行图像分析，结果显示TMV的平均大小为长280纳米，宽17纳米。在开发用于快速诊断脑部病毒性疾病的技术之后。该技术可能为动物和人类病理学领域的研究人员提供一条新途径，使其能够通过透射电子显微镜快速诊断动物和人类疾病。

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免疫学与感染

微波辅助植物病毒病的快速诊断用透射电子显微镜

通过瞬时表达带有荧光标记的目标蛋白质，并利用共聚焦显微镜分析其在细胞内和细胞间的分布，可以评估大分子在植物细胞间的转运情况。...

一种细胞间大分子转运检测方法 在活体植物中 利用基因枪轰击技术

要更好地理解并有效防控多种由昆虫传播的植物病毒，必须使用其传播介体。昆虫传播植物病毒是一种三营养级相互作用，因此需要对昆虫、病毒和植物进行操作。必须大量饲养传播介体，并以确保向测试植物实现高传播率的方式对其进行操控。本文介绍了烟粉虱（Bemisia tabaci，Hemiptera:...

利用烟粉虱传播植物病毒

植物病毒纳米颗粒（VNPs）是生物医学应用中有前景的平台。本文介绍了植物VNPs的增殖、纯化、表征及生物偶联的操作步骤。最后，我们展示了利用小鼠异种移植模型和荧光成像技术，将VNPs应用于肿瘤靶向与成像的研究。...

病毒纳米颗粒用于 在体 肿瘤成像

来源：Bou Khalil, J. Y., et al．利用 Vermamoeba vermiformis 从环境样本中快速分离新型 Faustovirus 的策略．J. Vis. Exp.

使用电子显微镜观察和评估法斯托病毒的形态与大小

我们在此描述一种简单的荧光方法 原位 一种用于定位昆虫和植物组织中病毒与细菌的荧光原位杂交（FISH）方法。该方案可扩展用于整体标本及显微切片中 mRNA...

荧光原位杂交（FISH）用于植物和昆虫组织中病毒及内共生细菌的定位

获得高质量的透射电子显微镜图像具有挑战性，尤其是在植物细胞中，因其含有大量充满水的液泡和通气空间。串联的高压冷冻与快速冷冻置换技术可显著缩短植物样品透射电镜制样的时间，同时获得超微结构保存极为良好的样品。...

植物组织的串联高压冷冻与快速冷冻置换透射电子显微镜制样技术

本文介绍了病毒分离技术的最新进展，用于表征福斯托病毒（Faustovirus）的新基因型，该病毒属于与非洲猪瘟病毒相关的一类新型巨大病毒谱系。本方案可应用于病毒的高通量分离，尤其适用于感染阿米巴原虫的巨大病毒。...

一种利用Vermamoeba vermiformis从环境样本中快速分离新型福斯托病毒的策略

快速准确地在现场检测植物病原体，特别是土传病原体，对于防止田间植物病害的进一步接种体产生和扩散至关重要。本研究开发的基于便携式实时PCR检测系统的方法，能够在田间条件下实现现场诊断。...

利用便携式实时PCR系统对土传植物病原体进行现场分子检测

本实验方案可用于对离体昆虫肠道中的植物病毒蛋白和媒介昆虫蛋白进行免疫荧光标记，从而研究病毒与媒介昆虫之间的相互作用、昆虫蛋白功能以及病毒传播背后的分子机制。...

半翅目昆虫肠道中植物病毒与昆虫媒介蛋白的免疫荧光标记

本文介绍了一种通过在诱导细胞死亡后连续成像接种叶片来研究程序性细胞死亡起始速率的实验方案。...

使用数字显微镜研究细胞死亡的启动

本视频方案演示了如何对病毒学样本进行扫描透射电子显微镜断层成像。为获得最佳结果，样本需通过高压冷冻及后续的冷冻置换方法进行制备。...

病毒学中的扫描透射电子显微镜断层成像：高压冷冻-冷冻置换样品的三维成像

学习微波辅助透射电子显微镜技术用于植物病毒病的快速诊断。该方法将样品制备时间缩短至约两小时，可在半天内完成病毒检测，显著提高植物病毒学诊断效率。

微波辅助通过透射电子显微镜快速诊断植物病毒病

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