嗅觉感官神经元的慢病毒介导的遗传操作和可视化在体内
2011年5月22日
我们提出了一种慢病毒基因操纵和单一的嗅觉感官神经元轴突的可视化技术及其终端树枝状在体内。
研究神经科学发展的挑战之一是在体内单细胞水平捕获树突状和轴突形态。在嗅觉系统中，嗅觉感觉神经元将其轴突从鼻子的嗅觉上皮延伸到大脑的嗅球。当多个嗅觉感觉神经元向嗅球投射时，它们会聚集成束。
这使得单个轴突轨迹及其末端形态的研究复杂化。我们开发了一种通过显微注射 GFP 构建体在体内可视化单个嗅觉感觉神经元的方法。携带慢病毒。
用慢病毒成功转导可照亮整个嗅觉感觉轴突长度，包括末端心轴。除了可视化单个嗅觉感觉神经元外，这种方法还允许我们纵特定目标基因的基因表达，以研究其在体内环境中的功能。该慢病毒程序是生物安全二级，需要在层流罩中进行。
为了保持无菌环境，请在罩中用 70% 乙醇喷洒插入罩内的所有物品，准备并预热 37 度的水床至少 20 分钟。注射前。将塑料储存袋半满密封，然后将其放在空的加热块培养箱上。
这将使小鼠在注射后恢复。用 10% 漂白剂填充生物危害废物容器，以净化所有病毒暴露的材料。通过此程序，准备一个装有 70% 乙醇的小开放式培养皿和第二个装有无菌蒸馏水的培养皿。
在层流罩中，我们将使用容量为 5 微升的 Hamilton 注射器和 33 号针头。这种特殊型号允许您通过转动位于柱塞腔顶部的张力刻度盘来调整柱塞阻力。此功能提供显微注射量控制，以对针头和注射器腔室进行消毒。
反复从培养皿中吸出和喷射乙醇数次。通过吸出和喷射无菌水数次来冲洗注射器卡式瓶。将注射器安全地放在一旁的 Flow 罩中。
在注射站附近放置酒精湿巾。准备一个注射阶段，提供一个凸起的表面，以便于鼠标的定位。可以使用覆盖有 Kim 湿巾的倒置 10 厘米培养皿。
小鼠幼崽可以通过体温过低麻醉，直到断奶年龄。剪下橡胶手套的一根手指，将鼠标幼崽放入手指切割处。然后放在冰上 5 分钟。
该手套可以防止因皮肤直接接触冰测试而发生的皮肤灼伤，通过捏住幼犬的后腿和四只脚以确保动物没有反应。我们现在已准备好进行慢病毒的显微注射。我们将与一只新生幼犬一起演示。
如果使用较老的小鼠，则应将 33 号针头替换为较粗号的针头，以便穿透颅骨表面。用酒精棉片擦拭鼠标的鼻子表面进行消毒。从冷冻储存中取出慢病毒原液并在冰上解冻。
我们自己在实验室中使用既定方法生产了慢病毒。在开发这种方法时，我们发现要获得良好的转导率，需要 10 到第 9 个感染单位/mil 的最小病毒滴度。将两微升慢病毒原液吸出到灭菌的 Hamilton 注射器中。
将鼠标幼崽放在注射阶段的顶部。抓住耳朵处的头顶皮肤，然后轻轻向后拉。我们为 Flow 罩配备了解剖镜。
为了准确指导显微注射，请在前脑的颅骨背表面搜索嗅球的轮廓。我们的微注射靶标紧密围绕着嗅球，但不应包括嗅球本身。我们对每只幼犬的嗅觉上皮进行四次注射。
这些用蓝点表示的位置需要以指向内侧的角度插入针头。用绿点表示的另外两次注射是交错的，更位于嗅球的内侧和前方。这些注射可以倾斜
。针角建议是考虑到嗅上皮的腹侧位置，嗅上皮主要位于嗅球下方。因此，垂直访问受到限制。将针头穿过鼻腔顶部，距离皮肤表面下方约 3 毫米。
到达嗅觉上皮。当达到鼻腔间隙时，训练有素的手应该感觉到阻力下降。应避免此区域。
每个位置显微注射 0.5 μL 病毒原液。同样，每侧选择两个部位，左侧和右侧，四次注射共 0.5 微升。每只小鼠每只意味着每只小鼠在一次注射中需要 2 微升病毒。
同样，小心不要注射嗅球吸干任何可能从注射部位或鼻孔开口逸出的残留病毒溶液或血液。使用乙醇湿巾，将湿巾丢弃在稀释的液体漂白容器中，立即将注射的小鼠放在水床培养箱上进行回收。通过重复制备过程中执行的灭菌程序对针头注射器进行消毒 注射的小鼠可以在水床培养箱上恢复 30 分钟后放回笼子。
整个显微注射可以在 4 小时内再次重复。如果您想增加将被感染的嗅觉感觉神经元的数量，受感染的嗅觉感觉神经元可能会在短短三天内在整个细胞长度上出现。动物处死并灌注以在所需的时间点进行观察。
使用标准方法 为了可视化转导的单细胞嗅觉感觉神经元轨迹和轴突末端，我们以 60 微米的厚度解剖和切片嗅球冠状体。因此，该切片将包含嗅球的所有细胞层，包括嗅觉感觉神经元轴突束和轴突末梢，它们在球表面结合的肾小球结构中形成突触，为浮动免疫组织化学做准备。制作嗅球的连续切片，并集体扫入装有 5 毫升磷酸盐缓冲盐水的 10 厘米培养皿中。
将漂浮切片转移到 50 mL 锥形瓶中。切片沉淀到样品瓶底部后，抽真空去除磷酸盐缓冲盐水。小心不要用吸尘器吸尘。
您的切片补充 10 毫升新鲜缓冲液，以洗去任何残留的固定剂或包埋材料。立即将再悬浮液移液到 15 mL 锥形瓶中，确保捕获所有漂浮切片，吸出冲洗液，然后用 0.3%Triton X 100 磷酸盐缓冲盐水溶液在切片上穿孔，置于摇床平台上 10 分钟。在室温下，您可以在同一个锥形瓶中进行标准免疫染色方案，根据该尺寸容器的需要重复真空和摇杆步骤，保留 10 mL 体积用于染色和冲洗步骤。
以下是我们用于 cos 染色阳性转导的嗅觉感觉神经元和一般嗅觉感觉神经元群的抗体列表。为了彻底渗透 60 微米球切片的抗体，建议在 4 摄氏度下孵育过夜。每次洗涤深度也应不短于 20 分钟。
用画笔轻轻地将每个切片铺在载玻片上，用补充有染色质染色溶液的 flora Mount G 固定每张载玻片。努力消除封固剂中的所有气泡。将切片成行安装以简化后续筛选步骤。
扫描免疫染色球切片上的这些层，寻找 GFP 阳性轴突纤维和末端。然后使用荧光显微镜，阳性感染的神经末梢可以通过共聚焦显微镜成像。使用 DPI 和嗅觉标记蛋白通道校准您感兴趣区域的焦平面是有帮助的。
这些结果显示肾小球内有一个嗅觉传感器神经元轴突纤维和轴突末端，即 CO，红色为嗅觉标志蛋白，灰色为 vlu 2，感染的嗅觉传感器神经元细胞体及其树突状旋钮也可以在嗅觉上皮内可视化如果该组织包含在解剖和免疫染色步骤中。嗨，我的共聚焦投影为我们提供了单个嗅觉感觉神经元轴突延伸路径和末端心轴的非常详细的形态。人们可以看到轴突纤维钩回其肾小球目标，以及它在肾小球神经丸内的分支模式的细节。
慢病毒显微注射方法允许单细胞轴突、嗅觉感觉神经元的形态可视化，并允许纵基因表达的研究，慢病毒转导导致构建体的稳定基因组整合。慢病毒不会跨突触感染邻近细胞。可视化可以在短短三天内实现，并且已确认至少持续三个月，并且可能会持续更长的时间。
嗅觉感觉神经元不容易被慢病毒溶液的鼻腔输注感染。因此，在此过程中需要通过表面进行显微注射。这就是我们的慢病毒显微注射程序。
我希望你已经发现所有这些信息对实现你自己的 Happy hunting 的单细胞形态有用。
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概览
本研究提出了一种新颖的慢病毒技术，用于体内单个嗅觉感觉神经元轴突及其末端分枝的基因操作和可视化。该方法解决了在复杂的嗅觉系统中研究单个轴突轨迹的挑战。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因操作
- 嗅觉系统
背景
- 在单细胞水平上研究树突和轴突形态具有挑战性。
- 嗅觉感觉神经元将其轴突投射到嗅球，形成束状结构。
- 这种束状结构使得单个轴突轨迹的可视化变得复杂。
- 现有的方法可能无法有效地分离和可视化单个神经元。
研究目的
- 开发一种体内可视化单个嗅觉感觉神经元的方法。
- 增强对轴突轨迹和末端形态的理解。
- 提供一种在细胞水平上研究嗅觉系统的工具。
使用的方法
- 绿色荧光蛋白构建体的显微注射。
- 利用慢病毒进行基因操作。
- 体内可视化技术。
- 分析轴突和末端分枝模式。
主要结果
- 成功可视化了单个嗅觉感觉神经元轴突。
- 详细观察了轴突末端分枝。
- 证明了慢病毒技术的有效性。
- 洞察了嗅觉神经元投射的复杂性。
结论
- 慢病毒技术是神经科学研究的宝贵工具。
- 该方法允许体内研究单个神经元的形态。
- 进一步的应用可能增强对嗅觉系统的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Precise genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neurons in vivo enables direct interrogation of gene function during neural circuit development. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for neurodevelopmental pathways, informing early-stage portfolio decisions. The method's temporal control and single-cell resolution provide predictive confidence for translational neuroscience programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of candidate genes in neural circuit formation at single-cell resolution.
- Supports mechanistic de-risking by linking gene perturbation to axonal morphology and targeting outcomes.
- Facilitates hypothesis-driven studies of molecular pathways underlying sensory neuron development.
Screening & Assay Development
- Provides a platform for quantitative assessment of gene overexpression or knockdown effects in vivo.
- Delivers reproducible visualization of neuronal morphology for assay standardization.
- Enables rapid screening of genetic constructs with observable phenotypic outputs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling manipulation and tracking of neuronal development in vivo.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by allowing longitudinal studies of gene function.
- Offers predictive value for translational biomarker identification based on morphological phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This lentiviral microinjection method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging genetic target validation and phenotypic screening in neural systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct gene manipulation and morphological readout in olfactory neurons.
- Screening: Provides quantitative, reproducible outputs for evaluating genetic perturbations in vivo.
- Analytics: Delivers high-resolution morphological data for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease models by enabling in vivo studies of neuronal development and targeting.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for genetic manipulation and visualization across diverse neural targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neural development studies.
- Operational Value: Standardizes in vivo genetic manipulation and visualization workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking gene function to observable phenotypes in relevant biological systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets based on functional and morphological evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in vivo microinjection and biosafety level two procedures.
- Demands access to fluorescence microscopy and confocal imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of injection, staining, and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different neuronal populations or developmental stages.
- Limited to systems where direct microinjection and single-cell visualization are feasible.
