Name: 嗅觉感官神经元的慢病毒介导的遗传操作和可视化在体内 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 了解慢病毒介导的遗传操作方法，用于在体可视化单个嗅觉感觉神经元轴突及其终末分支形态。该技术通过微注射GFP标记的慢病毒实现单细胞水平神经形态学研究。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 DC052256 和 DC006015 以及美国国家科学基金会（NSF）资助项目 0324769 资助，QG 为负责人；同时获得 T32-DC008072 项目资助，BS 为负责人。

1. 准备
该操作属于生物安全二级，因此所有以下准备工作均在进行显微注射操作的生物安全柜中完成。
<ol>
	<li>准备并预热37°C水浴垫：将水注入一个塑料储物袋中，密封后放置在已清空的加热块培养箱上。此装置可用于小鼠注射后的恢复。</li>
	<li>在生物危害废物容器中加入10%次氯酸钠溶液，体积应足以浸没本实验过程中产生的全部废弃物。</li>
	<li>在生物安全柜内准备一个小的敞口培养皿，盛装70%乙醇，另准备一个培养皿盛装灭菌去离子水（ddH2O）。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒5μL容量的Hamilton注射器及其33号针头（活塞完全拉出），进行表面消毒；反复从乙醇培养皿中吸取并完全排出乙醇至少5次，以完成注射器的灭菌。</li>
	<li>通过反复吸取并推出无菌水至少5次，清洗注射器套管。将注射器安全放置于超净台内，静置晾干。</li>
	<li>从-80°C冰箱中取出病毒储备液，置于冰上解冻。每只小鼠显微注射需使用2μL病毒原液，滴度为109 感染单位/mL。慢病毒可从商业渠道获取，或根据已有方案在实验室自行制备（Lois et al., 2002）。</li>
	<li>准备一个注射平台，使其高于生物安全柜表面——可使用一个10cm培养皿，并在其上覆盖一张Kimwipe纸巾。</li>
	<li>在注射工作站附近放置酒精擦拭巾。</li>
</ol>
2. 将慢病毒颗粒显微注射至嗅上皮
本方法中进行的所有动物实验均按照IACUC批准的指南操作。所使用的动物模型为Mus musculus品系C57BL/6J，本研究所展示的所有实验均采用该品系。
<ol>
	<li>通过低温麻醉法麻醉新生小鼠：取出一只出生后0至3天（P0-P3）的小鼠，将其置于冰上预先剪开的手套中，持续5分钟，以实现低温麻醉。</li>
	<li>在等待小鼠完全麻醉期间，用已灭菌的哈密尔顿注射器吸取2μL病毒原液。</li>
	<li>将小鼠放置在注射平台上。轻柔地从耳部向颈部顶端方向牵拉头部皮肤，使鼻腔区域皮肤绷紧，便于注射操作。</li>
	<li>将针头从鼻腔顶部穿入，深入皮下约3mm，以到达嗅上皮。每次注射微量注射0.5μL病毒溶液，每侧选择两个注射位点（左右两侧共四个注射点，每只小鼠共需2μL病毒）。各注射位点应彼此错开。为精确定位注射部位，可观察颅骨背侧表面，寻找嗅球轮廓的投影。出生时因皮肤和颅骨半透明，该轮廓隐约可见。每侧进行两次注射：第一次注射位于嗅球轮廓前方、中轴线附近；第二次注射位于嗅球轮廓外侧，但针头需向内侧倾斜进针，以便到达位于嗅球腹侧下方的嗅上皮。注意避免穿刺进入嗅球内部！</li>
	<li>使用Kimwipe纸巾轻轻吸干从注射部位或鼻孔溢出的残留病毒溶液或血液。立即将使用过的Kimwipe纸巾丢弃至含稀释液体漂白剂的生物危害容器中。</li>
	<li>将完成注射的小鼠置于水浴孵育箱中。</li>
	<li>对所有待注射小鼠重复步骤1–4，注意每只小鼠需使用约2μL病毒原液。</li>
	<li>让小鼠在水浴孵育箱中恢复30分钟，随后将其放回原始育幼笼中。</li>
	<li>将使用过的微注射平台、消毒湿巾及其他额外清洁用纸制品丢弃至含液体漂白剂的生物危害废弃物容器中。</li>
	<li>按照准备步骤中的方法，通过反复吸入和推出乙醇，再用水冲洗，清洁哈密尔顿注射器。最后让注射器自然晾干。</li>
	<li>为获得最大转导效率，可在4小时后重复此操作一次。感染的嗅觉神经元可在细胞全长范围内于短短三天内被观察到。</li>
</ol>
3. 漂浮的嗅球切片免疫组织化学
<ol>
	<li>在预定时间点处死注射后的小鼠，并用4%多聚甲醛灌注固定组织。解剖取出嗅球（OB），在多聚甲醛中孵育过夜，随后在PBS中含30%蔗糖的溶液中孵育过夜。在干冰上用O.C.T.包埋介质进行包埋。</li>
	<li>使用冷冻切片机获取厚度为60μm的冠状面嗅球切片。将切片用5mL 1×PBS（pH 7.4）转移至10cm培养皿中。切片应保持漂浮于PBS中，以使O.C.T.充分溶解。将漂浮的切片连同PBS一起转移至50mL锥形管中。</li>
	<li>让切片自然沉降至管底，抽真空去除PBS时注意勿吸走切片。用20mL PBS清洗组织切片，重复沉降和抽真空步骤。用10mL PBS重悬组织，并将漂浮的切片转移至15mL锥形管中用于免疫染色。待切片沉降后，小心抽去PBS上清液而不扰动组织。用含0.3% Triton X-100的1×PBS（pH 7.4）（即PBS-Tx）重悬切片，使去垢剂穿透细胞膜。室温孵育10分钟。吸去上清液，并用PBS-Tx重复孵育两次。</li>
	<li>将组织切片在封闭液（含5%马血清的PBS-Tx）中室温孵育2小时。</li>
	<li>用PBS-Tx在室温下至少清洗两次，每次15分钟。</li>
	<li>在PBS-Tx中配制2mL一抗溶液。本实验所用抗体详见试剂与设备部分。</li>
	<li>用一抗溶液替换第二次PBS-Tx封闭洗涤液。将样品置于缓慢摇动平台（约30rpm）上，4°C孵育24–48小时，以确保抗体充分渗透进入60μm厚的漂浮切片中。</li>
	<li>孵育结束后，可用移液器小心回收一抗溶液，并于4°C保存，两周内可重复使用最多两次，且染色强度无明显下降。</li>
	<li>用PBS-Tx在室温下轻轻旋转洗涤切片三次，每次20分钟。</li>
	<li>在PBS-Tx中配制2mL二抗稀释液。抽去最后一次洗涤液，加入二抗溶液至组织切片中。用铝箔包裹染色管外壁以避光，防止荧光染料发生光漂白。将包裹好的管子置于缓慢摇动平台上，4°C过夜孵育。</li>
	<li>孵育结束后抽去二抗溶液。用PBS-Tx在室温下洗涤一次，每次20分钟；再用PBS（pH 7.4）额外清洗两次，每次20分钟。使用Fluoromount G将染色后的组织切片封片于载玻片上。</li>
	<li>使用荧光显微镜观察染色切片中呈阳性感染的嗅觉感觉神经元（OSN）轴突及其轴突终末。</li>
	<li>为构建标记的OSN轴突及终末树突的三维图像，利用共聚焦显微镜沿z轴方向对目标嗅球组织切片（厚度60μm）进行一系列光学切片扫描。</li>
	<li>随后可将该Z轴图像序列合并投影，重建出单个标记OSN轴突及其完整终末树突结构的360°旋转视角图像。任一特定旋转角度均可捕获并导出为图像文件（如JPG、TIFF格式），用于二维展示。</li>
</ol>
4. 代表性结果
利用此处所述方法，我们可通过慢病毒转导嗅觉感觉神经元 体内迄今为止，我们已利用GFP和mCherry荧光报告基因，以及通过免疫细胞化学检测myc标签融合蛋白，对感染的嗅觉感觉神经元（OSNs）进行了可视化。该技术可获得大量感染的OSNs，同时感染呈足够随机分布，从而实现单个神经元的标记，便于进行单细胞形态学分析。通过共聚焦显微镜，可在嗅球（OB）组织切片的天然环境中对轴突及其轴突终末进行成像（图1）。通常，完整的OSN轴突终末分支结构可被完整捕获于一个40-50μm 光学切片。对感染的嗅觉感觉神经元轴突末端进行高倍放大，可对嗅小球层中的轴突分支形态进行详细分析。
<img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" alt="显示OMP、VGluT2、GFP标记物（不同颜色）的神经组织免疫荧光显微图像。" data-altupdatedat="1787630408000"> 
图1. 单个嗅觉感觉神经元轴突的轨迹及其终末分支。 A) 一只P7小鼠嗅球的冠状切面，显示嗅神经层（ONL）经OMP免疫染色呈红色，小球层（GL）经OMP和Vglut2双重免疫染色呈灰色。一条表达GFP（绿色）的单个嗅觉感觉神经元轴突在ONL内延伸，并穿入小球结构。B) 轴突终末分支在小球内的形态，由GFP表达清晰显示。Vglut2以灰色共染色，标示出GFP阳性轴突形成终末分支的整个小球区域。C) 嗅上皮（OE）中经慢病毒转染并表达GFP（绿色）的OSN。DAPI染色（蓝色）显示嗅上皮的细胞结构。GFP的表达使得OSN细胞体及其在OE中的细胞突起得以可视化。D) 通过shRNA敲低Rap1GAP2表达的OSN轴突及其终末形态。将携带双表达盒的慢病毒（在小鼠U6启动子下表达Rap1GAP2 shRNA，在CMV启动子下表达GFP）应用于OE。与仅表达GFP的对照组相比，感染后的嗅觉轴突终末表现出更为简化的终末分支结构。比例尺 = 20μm。

<ol><li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li>
<li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb%3A+a+long-term+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otol+Rhinol+Laryngol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li>
</ol>

本方案符合生物安全二级标准。已相应建立所有适当的实验区域、个人防护和病毒废弃物处理措施。所有动物实验均按照国际实验动物使用与管理委员会（IACUC）指南进行。

慢病毒显微注射可将基因构建体永久性地转入嗅觉感觉神经元（OSN）的基因组DNA中。该方法使我们能够通过过表达或shRNA介导的基因敲低，对候选基因进行短期或长期的功能操控。此外，我们还可以在现有的转基因小鼠品系中对单个OSN进行荧光标记，以观察气味受体群体的共定位情况。慢病毒转导OSN必须通过显微注射完成。我们曾尝试将慢病毒悬液灌注至鼻腔以实现OSN转导，但未获成功。因此，我们选择通过鼻背表面进行显微注射，将病毒递送至嗅上皮（OE）的内层，即OSN胞体所在的位置。
与已建立的腺病毒操作相比，使用慢病毒具有多种优势。慢病毒转导可整合到基因组中，从而实现长期研究；而腺病毒仅能实现瞬时转染，基因操作的时间窗口有限（Doi et al., 2005）。我们已在显微注射后长达三个月的时间点检测到慢病毒转导的嗅觉感觉神经元（OSNs）。成年啮齿类动物OSNs的寿命通常为1至3个月。因此，慢病毒感染的OSNs可在其生命周期的大部分时间内被观察，从而便于研究OSN轴突生长、突触形成与维持、气味刺激反应以及细胞更替过程。此外，慢病毒还能感染前体细胞，从而实现对OSNs更长时间的可视...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;em&gt;显微注射&lt;/em&gt; 新生小鼠使用5&amp;#x03BC;Hamilton 注射器（Hamilton #7647-01），配备 33 号针头（Hamilton #7762-06）。&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;em&gt;免疫细胞化学试剂：&lt;/em&gt; 一抗：兔多克隆抗体GFP（Molecular Probes# A-6455），鸡多克隆抗OMP抗体（定制）（Chen et al., 2005），豚鼠多克隆抗VGlut2抗体（Millipore# AB2251）。二抗：Cy2标记的驴抗兔抗体（Jackson Immunolab# 711-225-152），Cy3标记的驴抗鸡抗体（Jackson Immunolab# 703-165-155）和Cy5标记的山羊抗豚鼠抗体（Jackson Immunolab# 106-175-008）。切片用含50 ng/mL DAPI染色质染液的Fluoromount G（Southern Biotech# 0010-01）封片于玻璃载片上。&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;em&gt;共聚焦成像：&lt;/em&gt; 使用 Olympus Flouview FV1000 共聚焦显微镜采集Z轴层扫图像，并利用 Olympus FV10-ASW 2.01 共聚焦图像采集与分析软件对图像进行收集和处理，生成三维投影。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

慢病毒介导的嗅觉感觉神经元遗传操作与可视化 体内

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

精确嗅觉环路的发育依赖于嗅觉感觉神经元（OSN）轴突准确投射至嗅球（OB）中的突触靶区。目前对OSN轴突生长与靶向投射的分子机制仍了解甚少。迄今为止，在特定时间范围内调控基因表达并进而对单个OSN轴突及其终末分支形态进行可视化观察仍具有挑战性。为了在特定时间窗内于单细胞水平研究基因功能，我们开发了一种基于慢病毒的技术以调控OSN中的基因表达 体内通过显微注射将慢病毒颗粒递送至嗅觉上皮（OE）中的嗅觉神经元（OSNs）。表达盒随后永久整合到被转导的OSN基因组中。绿色荧光蛋白（GFP）的表达可标记被感染的OSN，并清晰显示其完整形态，包括轴突终末分支。由于显微注射与报告基因检测之间的时间间隔较短，该方法可将基因功能研究聚焦于发育过程中的极窄时间窗口。采用此方法，我们已在注射后仅三天至长达三个月内检测到GFP表达。通过慢病毒显微注射，我们已成功实现基因的过表达以及shRNA介导的基因敲低。该技术可在单细胞水平上提供OSN胞体及轴突的精细形态学信息。 体内，从而允许在嗅觉发育过程中对候选基因功能进行表征。

我们介绍一种利用慢病毒技术对单个嗅觉感觉神经元轴突及其终末分支进行遗传操作和可视化的方法 体内.

精确嗅觉回路的发育依赖于嗅觉感觉神经元（OSN）轴突准确投射至其在...中的突触靶点

神经科学领域研究发育过程的一个挑战是在活体中以单细胞水平捕捉树突和轴突的形态。在嗅觉系统中，嗅觉感觉神经元从鼻腔内的嗅觉上皮延伸其轴突至大脑中的嗅球。当多个嗅觉感觉神经元向嗅球投射时，它们会聚集成束。这使得单根轴突的投射路径及其终末形态的研究变得复杂。我们开发了一种方法，通过显微注射携带GFP构建体的慢病毒，以在体内可视化单个嗅觉感觉神经元。使用慢病毒成功转导可照亮整个嗅觉感觉神经元轴突长度，包括其终末分支。除了可视化单个嗅觉感觉神经元外，该方法还允许我们操控特定目的基因的表达，以研究其在活体环境中的功能。此慢病毒操作属于生物安全二级实验，需在层流罩中进行。为保持无菌环境，将所有放入生物安全柜的物品用70%乙醇喷洒；在注射前至少20分钟，准备并预热37摄氏度的水浴床。用塑料密封袋装入半袋水并封口，然后将其置于空的加热块培养箱上。这将使小鼠在注射后得以恢复。用10%的漂白剂填充生物危害废物容器，以对所有接触过病毒的物品进行去污处理。在此过程中，准备一个盛有70%乙醇的小型敞口培养皿和另一个装有无菌蒸馏水的培养皿。在超净工作台中，我们将使用一支容量为5 µL、带有33号针头的汉密尔顿注射器。该特定型号可通过调节位于活塞腔顶部的张力旋钮来调整活塞的阻力。此功能可实现显微注射体积的控制，并对针头及注射器腔体进行灭菌。反复从培养皿中吸取并推出乙醇数次。通过反复吸取和推出无菌水清洗注射器套件。将注射器安全放置于生物安全柜中备用。在注射工作站附近放置酒精棉片。准备一个注射平台，提供一个抬高的表面，便于小鼠的定位。可以使用倒置的直径10厘米的培养皿，并用Kim棉片覆盖。在断奶前，可通过低温使小鼠幼崽麻醉。剪下橡胶手套的一个指套，将小鼠幼崽放入该指套中，然后置于冰上五分钟。手套可防止皮肤直接接触冰块测试时可能引起的冻伤。通过捏压幼崽的后肢和四肢足部，检查是否完全麻醉，确保动物无反应。现在我们已准备好进行慢病毒的显微注射，将以新生幼崽为例进行演示。若使用年龄较大的小鼠，应将33号针头替换为更粗的针头，以穿透颅骨表面。用酒精棉片擦拭小鼠鼻部表面进行消毒。从冷冻保存中取出慢病毒原液，并在冰上解冻。我们已在实验室内部使用既定方法自行制备慢病毒。在开发该方法的过程中，我们发现要实现良好的转导效率，慢病毒的最低滴度需达到每毫升10的9次方个感染单位。用无菌Hamilton注射器吸取2 µL慢病毒原液。将小鼠幼崽放置在注射台上。抓住耳部上方头部的皮肤，轻轻向后拉。我们在超净工作台中配备了体视显微镜。为了准确定位微量注射，在前脑的背侧颅骨表面寻找嗅球的轮廓。我们的微量注射位点应紧邻嗅球周围，但不应包含嗅球本身。对每只幼鼠的嗅上皮进行四次注射。以蓝色圆点表示的这些位置要求将针头以朝向内侧的角度插入。另外两个以绿色圆点表示的注射位点呈交错排列，位置更靠内侧且位于嗅球前方。这些注射可以以倾斜的角度

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神经科学

嗅觉感官神经元的慢病毒介导的遗传操作和可视化在体内</em

遗传操作的时间和空间分辨率决定了其能够干扰的生物学现象的范围。本文中，我们采用具有时间与空间特异性的 体内...

联合靶向嗅球神经元 体内 电穿孔与基于Gal4的增强子捕获斑马鱼品系

利用在吻侧迁移流中注射表达通道视紫红质2的慢病毒，并结合植入式微型LED进行慢性光刺激，可对嗅球中成年新生神经元进行光遗传学操控。...

选择性病毒感染转导成年出生的嗅觉神经元以实现长期研究 体内 光遗传学刺激

来源：Kozin, E. D., 等．用于听觉通路光遗传学刺激的小鼠背侧耳蜗核直接可视化．J. Vis. Exp.

利用病毒介导的基因转移技术向小鼠背侧耳蜗核导入基因以实现光诱导听觉刺激

病毒载体可实现靶向基因操作。本文演示一种在小鼠脊髓中进行条件性基因表达或基因剔除的方法，通过立体定位注射将病毒载体注入脊髓背角，此处是初级躯体感觉传入神经与中枢神经系统神经元之间突触联系的重要部位。...

在小鼠脊髓中进行病毒载体的立体定位注射以实现条件性基因操作

我们描述了一种实验方案 体内...

嗅觉系统作为研究体内轴突生长模式与形态的模型 In Vivo

本文介绍了一种基于慢病毒颗粒的方法，用于对成年动物脑内室-脑室下区神经发生微环境中神经干细胞和/或其邻近的室管膜细胞进行长期遗传修饰，从而能够分别分析细胞自主性及非自主性、依赖微环境的效应在神经干细胞中的作用。...

成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

通过注射依赖重组酶的重组腺相关病毒（rAAV）可操控脊髓中任意基因标记的细胞类型。本文介绍如何转导腰段脊髓背角中的神经元。该技术可实现对被操控神经元亚型的功能性研究。...

腺相关病毒介导的脊髓遗传学定义神经元中转基因表达

本方案展示了一种追踪腹侧被盖区（VTA）谷氨酸能投射至海马体的简单方法。通过光刺激VTA谷氨酸能神经元并结合CA1区记录，以展示VTA谷氨酸能末梢如何在体内调节CA1区假定锥体神经元的放电频率。...

腹侧被盖区谷氨酸能神经末梢在海马中的体内解剖与功能联合示踪

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

我们在此描述了诱导和分析触角叶突触小球在嗅觉经验依赖性重塑过程中的方法 果蝇...

幼年期关键阶段中依赖经验的嗅觉感觉神经元突触连接的脑部重塑

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