Name: 蛋白膜覆盖含量:一个协议测试可溶性和不溶性蛋白质之间的相互作用在体外 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-14T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 了解蛋白膜覆盖实验方法，用于检测固定化膜蛋白与可溶性蛋白之间的相互作用。该技术通过免疫印迹分析，为研究难溶性蛋白质相互作用提供了可靠的体外解决方案。

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我们实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）、美国农业部国家食品与农业研究所（USDA National Institute of Food and Agriculture）、美国国家科学基金会（NSF）、美以双方农业研究与发展基金（BARD）、美国能源部（DOE）以及美国-以色列两国科学基金会（BSF）向 V.C. 提供的资助。

1. 蛋白质的表达与提取
<ol>
	<li>对需要检测的蛋白质进行差异标记。将要固定在膜上的蛋白质（ProIM）用较大尺寸的标签进行标记（例如 GST），未融合的标签可用作固定的阴性对照（ProIMnc）。将用作可溶性探针的蛋白质（ProSOL）用较大或较小的标签进行标记。将相同的标签融合至适当的可溶性阴性对照蛋白质（ProSOLnc），并在相互作用检测中包含该对照，以确认所检测到的结合具有特异性。</li>
	<li>根据目标蛋白质是否需要潜在的翻译后修饰以及蛋白表达量的需求，选择合适的蛋白表达系统来表达带标签的蛋白质，例如 E. coli、杆状病毒系统等。</li>
	<li>使用含有蛋白酶抑制剂混合物的 SDS-PAGE 上样缓冲液（20% 甘油、4% SDS、20 mM Tris-HCl，pH 6.8），从选定的生物体（步骤 1.2）中提取 ProIM 和 ProIMnc。将细胞悬液在室温下放置 15 分钟，加入 0.5% 的 2-巯基乙醇，煮沸 5 分钟。</li>
	<li>使用标准方案16从选定的生物体（步骤 1.2）中提取 ProSOL 和 ProSOLnc。这些蛋白质应能 readily 溶于步骤 4.1 中使用的结合缓冲液（140 mM NaCl、10 mM Tris-HCl，pH 7.4、2 mM EDTA、2 mM DTT、1% BSA、0.1% Tween 20）中。</li>
	<li>使用标准方法（如 Bio-Rad 蛋白检测试剂盒）测定重组蛋白的浓度。若使用粗提物而非纯化蛋白进行检测，可通过考马斯亮蓝 R-250 染色的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶上相应条带的密度扫描，并以已知浓度的 BSA 作为参照，估算该粗提物中目标蛋白的浓度。</li>
</ol>
2. 将 ProIM 和 ProIMnc 固定在膜上
<ol>
	<li>根据标准方案16，将两组提取物（每组含有1 μg的ProIM和ProIMnc）在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。</li>
	<li>电泳结束后，将凝胶转移至含有100 ml转移缓冲液（60 mM甘氨酸，10 mM Tris，0.0006% SDS，20%甲醇）的容器中，室温下轻轻振荡孵育20分钟。</li>
	<li>根据标准方案16，通过电转移将凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。</li>
</ol>
3. 膜结合蛋白的复性
<ol>
	<li>电转印后，将膜置于15 ml缓冲液A（30 mM Tris-HCl pH 7.4，0.05% Tween 20）中，在温和振荡条件下孵育15分钟，以去除残留的SDS。</li>
	<li>小心沥干后，将膜转移至25 ml变性缓冲液（7 M 盐酸胍，2 mM EDTA，50 mM DTT，50 mM Tris-HCl pH 8.3）中，在室温下温和振荡孵育2小时。（注意：硝酸纤维素膜在变性缓冲液中孵育时会变浑浊）。</li>
	<li>将膜转移至25 ml TBS（10 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 7.4）中，在温和振荡条件下孵育5分钟。（注意：在此步骤中，膜恢复其原始白色外观）。</li>
	<li>将膜转移至25 ml结合缓冲液（见步骤1.2）中，在4°C下温和振荡孵育过夜。</li>
</ol>
4. 利用ProSOL探针检测ProIM
<ol>
	<li>将膜切成两条带，每条均包含 ProIM 和 ProIMnc。</li>
	<li>通过将制备物稀释，分别加入 1-10 μg 的 ProSOL 或 ProSOLnc，溶于 10 ml 新鲜结合缓冲液中，制备 ProSOL 和 ProSOLnc 杂交溶液。将每条膜转移至 ProSOL 或 ProSOLnc 杂交溶液中，室温下轻轻振荡孵育 1.5 小时。</li>
	<li>从杂交溶液中取出膜，用 TBS 洗涤三次，每次 15 分钟。</li>
</ol>
5. 通过免疫印迹法可视化蛋白质-蛋白质相互作用
<ol>
<li>用含2.5%脱脂奶粉的TBST（10 mM Tris-HCl，140 mM NaCl，0.05% Tween 20，pH 7.4）在室温下封闭膜1小时。按照生产商推荐浓度，将一抗（抗strepII多克隆兔抗体）用含0.5%脱脂奶粉的TBST稀释。</li>
<li>将封闭后的膜置于一抗溶液中，在室温下孵育1小时，或在4°C轻轻振荡孵育过夜。</li>
<li>用20 ml TBST在室温下轻轻振荡漂洗膜15分钟，再重复漂洗两次，每次5分钟。</li>
<li>按照生产商推荐浓度，将与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗（抗兔IgG抗体）用含0.5%脱脂奶粉的TBST稀释。将膜放入二抗溶液中，在室温下轻轻振荡孵育1小时。</li>
<li>用20 ml TBST在室温下轻轻振荡漂洗膜15分钟，再重复漂洗两次，每次5分钟。最后一次用TBS漂洗后，使用HRP化学发光底物（例如，Millipore Immobilon Western 化学发光HRP底物）显影蛋白-蛋白相互作用。</li>
<li>使用针对与ProIM融合标签的一抗对同一张膜进行探测，随后按照步骤5.1至5.4所述使用相应的二抗。按照步骤5.5所述方法显影ProIM和ProIMnc，以验证蛋白膜覆盖实验（步骤5.5）中获得条带的身份。大多数情况下无需剥离，因为此步骤获得的信号远强于步骤5.5残留的信号。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
 通过BiFC在烟草表皮细胞中观察到ANK与MP的相互作用（图1A）。由于MP在细菌或植物中表达时具有高度不溶性，因此采用蛋白质膜覆盖实验验证这一相互作用 体外 （图 1B）。含有蛋白质提取物 1 μg GST-MP（ProIM）或未融合的GST（ProIM）nc通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转至硝酸纤维素膜上。当使用可溶性ANK-strepII（ProSOL）探针检测这些ProIM时，GST-MP表现出结合信号，而未融合的GST则无结合（图1B，泳道1、2，与泳道5、6比较）。此外，当使用无关的ProSOLnc探针检测同一组ProIM时， 拟南芥细胞质 NADH激酶标记strepII（NADH3-strepII）未观察到结合，进一步证明了ANK-MP相互作用的特异性（图1B，泳道3、4）。 
<img src="/files/ftp_upload/2961/2961fig1.jpg" alt="蛋白质表达的显微镜与免疫印迹分析；荧光显微镜与凝胶电泳。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1。 烟草 ANK 与 TMV MP 的特异性结合 体内 和 体外. （A）通过BiFC检测活体烟草表皮细胞中ANK与MP的相互作用。将分别融合了YFP C端和N端片段的MP和ANK编码基因共转染至烟草表皮细胞后，观察到强烈的YFP荧光信号重建。该BiFC信号聚集于细胞边缘的点状结构，此特征为胞间连丝的典型标志 15. （B）ANK-MP 相互作用 体外 通过蛋白质膜覆盖实验检测。含有蛋白质提取物 1 μg GST-MP（ProIM）或未融合的GST（ProIMnc）样品在15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，随后通过电转移至硝酸纤维素膜。将GST-MPProIM和GSTProIMnc与 0.5 μg/ml ANK-strepII（ProSOL）的结合通过使用抗strepII兔多克隆抗体孵育膜，随后使用HRP标记的抗兔IgG+M二抗进行检测（泳道1和2）。GST-MPProIM和GSTProIMnc均不与无关蛋白发生相互作用。 拟南芥 细胞质NADH激酶与strepII标签融合（ProSOLnc，第3和4泳道）。本实验中观察到的条带通过使用抗GST抗体探测膜得以确认（第5和第6泳道）。当膜在未用缓冲液A洗涤的情况下直接用变性缓冲液处理时，GST-MP与ANK的结合消失，而GST-MP和含GST的蛋白提取物中的未识别蛋白仍能与ANK-strepII发生反应，表明在变性处理前执行步骤3.1至关重要（第7和第8泳道）。

<ol><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+Caenorhabditis+elegans+using+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis.</a> Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).</li>
<li>Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> Methods. 45, 196-206 (2008).</li>
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<li>Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li>
<li>Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P30+movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+is+a+single-strand+nucleic+acid+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein.</a> Cell. 60, 637-647 (1990).</li>
<li>Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+tobamovirus+movement+proteins+with+the+plant+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton.</a> Science. 270, 1983-1985 (1995).</li>
<li>Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+by+immunogold+cytochemistry+of+the+virus+coded+30+K+protein+in+plasmodesmata+of+leaves+infected+with+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus.</a> Virology. 160, 363-371 (1987).</li>
<li>Ding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+plasmodesmata+are+specific+sites+of+localization+of+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants.</a> Plant Cell. 4, 915-928 (1992).</li>
<li>Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+30+kd+protein+of+tobacco+mosaic+virus%3A+involvement+in+cell-to-cell+movement+and+dispensability+for+replication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication.</a> EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).</li>
<li>Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+modifies+plasmodesmatal+size+exclusion+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit.</a> Science. 246, 377-379 (1989).</li>
<li>Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+functional+assay+for+tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein+and+identification+of+a+domain+involved+in+increasing+plasmodesmal+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).</li>
<li>Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANK%2C+a+host+cytoplasmic+receptor+for+the+Tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein%2C+facilitates+intercellular+transport+through+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata.</a> PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).</li>
<li>Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Taylor, G. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIP1%2C+an+Arabidopsis+protein+that+interacts+with+Agrobacterium+VirE2%2C+is+involved+in+VirE2+nuclear+import+and+Agrobacterium+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity.</a> EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).</li>
<li>Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+and+host+cell+pectin+methylesterases+is+required+for+viral+cell-to-cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement.</a> EMBO J. 19, 913-920 (2000).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

该方法适用于检测蛋白质组合之间的蛋白-蛋白相互作用，前提是其中至少有一种蛋白质在结合缓冲液中易于溶解，并已成功应用于其他蛋白质组合17,18。在这些条件下，若两种蛋白质均不溶，则无法通过本方案检测其相互作用。
此外，ProIM 的成功复性对于该检测至关重要。电转移后用 TBS 缓冲液冲洗膜是关键步骤，因为残留的 SDS 可能会干扰变性/复性过程。
最后，为避免非特异性结合，结合缓冲液中 ProSOL 的浓度不应超过 1 μg/ml。ProSOL 浓度过高时，可能会与 ProIM 发生非特异性结合。此外，为阻断膜上固定化蛋白与 ProSOL 的非特异性结合，可在步骤 4.2 使用的杂交缓冲液中用脱脂奶粉替代 BSA。

<table><tbody><tr><td>蛋白质检测试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 电泳系统</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>半干式转膜仪（SD 电转移系统）</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的抗兔 IgG 抗体</td><td>GenScript</td><td>A00098</td><td></td></tr><tr><td>抗 GST 兔多克隆抗体</td><td>GenScript</td><td>A00097</td><td></td></tr><tr><td>抗 StrepII 抗体</td><td>GenScript</td><td>A00626</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace NT 硝酸纤维素转印膜</td><td>Pall Corporation</td><td>27377-000</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western 化学发光 HRP 底物</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr></tbody></table>

蛋白质膜覆盖实验：检测可溶性与不溶性蛋白质相互作用的实验方案 体外

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

验证不同蛋白质之间的相互作用对于研究其在分子水平上的生物学功能至关重要。目前有多种方法可用于评估蛋白质结合，包括体外（in vitro）和体内（in vivo）方法，应至少采用两种能够互补彼此不足的方法，以获得可靠的结果。
对于体内检测，双分子荧光互补（BiFC）检测是目前最常用且侵入性最小的方法，可用于在活细胞内检测蛋白质-蛋白质相互作用，并确定相互作用蛋白的细胞内定位1,2。在该检测中，绿色荧光蛋白（GFP）或其变体的非荧光性N端和C端片段分别与待测蛋白融合；当两种融合蛋白因待测蛋白之间的相互作用而靠近时，荧光信号得以重建3-6。由于该信号可通过落射荧光显微镜或共聚焦显微镜轻松检测，BiFC已成为细胞生物学家研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的首选有力工具3。然而，该检测有时可能产生假阳性结果。例如，由于在较小的亚细胞区室中紧密排列，即使两个GFP片段相距达7 nm，也可能重建荧光信号，而非源于特异性相互作用7。
由于这些局限性，通过活细胞成像技术获得的结果应采用基于不同原理的独立方法来验证蛋白质相互作用。免疫共沉淀（Co-IP）或谷胱甘肽S-转移酶（GST）下拉实验即为常用的替代方法，可用于体外分析蛋白质-蛋白质相互作用in vitro。然而，在这些实验中，待测蛋白质必须在用于结合反应的缓冲液中具有良好的溶解性。因此，涉及不溶性蛋白质的特异性相互作用无法通过这些技术进行检测。
 在此，我们介绍蛋白膜覆盖结合实验的方案，该方法可克服上述困难。在此技术中，由于其中一种蛋白被固定于膜基质上，因此可可靠地检测可溶性蛋白与不溶性蛋白之间的相互作用。该方法结合 体内 实验，例如双分子荧光互补（BiFC），为可靠地研究和表征可溶性与不溶性蛋白之间的相互作用提供了有效方法。本文中，烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）运动蛋白（movement protein, MP）——在病毒细胞间转运过程中发挥多种功能——的结合作用8-14以及最近发现的一种植物细胞互作蛋白——烟草含锚蛋白重复序列蛋白（ANK） 15, 可通过此技术进行演示。

测试蛋白质-蛋白质相互作用对于解析蛋白质功能至关重要。本文介绍了一种 体外 利用可溶性蛋白探测膜固定化蛋白的蛋白质-蛋白质结合实验。该实验为检测不溶性蛋白与溶液中蛋白之间的相互作用提供了可靠方法。

验证不同蛋白质之间的相互作用对于在分子水平上研究其生物学功能至关重要。有多种……

检测蛋白质。蛋白质相互作用对于解析蛋白质功能至关重要。本视频介绍了一种体外蛋白质-蛋白质结合实验方法，用于检测膜结合蛋白或固定化蛋白与可溶性蛋白之间的相互作用。首先，克隆、表达并提取融合蛋白。将带有标签的不溶性蛋白固定在硝酸纤维素膜上，并处理使其复性至天然构象。然后用带有标签的可溶性蛋白探查膜，并通过免疫印迹检测蛋白。如果标记的蛋白质发生相互作用，则会被固定在膜上的蛋白质捕获，并可通过免疫印迹检测到信号。因此，该检测方法为验证不溶性蛋白质与溶液中蛋白质之间的相互作用提供了一种可靠手段。与现有的GST pull-down等方法相比，该技术的主要优势在于能够可靠地在体外评估不溶性蛋白质与可溶性蛋白质之间的结合能力。该实验步骤的第一步是生成用于检测的基因标记蛋白。首先克隆将要固定在膜上的蛋白，此处将其称为固定化蛋白（pro Im），并将其插入表达载体中，该载体编码一个较大的标签，例如 GST；仅编码标签的空表达载体将用作固定化蛋白的阴性对照，此处称为 pro IM nc。接下来，将用作可溶性探针的蛋白质克隆到表达载体中，该载体编码不同的标签，例如Strep标签（strep two）。该构建体将被称为prosol（可溶性蛋白质），作为阴性对照；同时将一个阴性对照的可溶性蛋白质克隆至相同的表达载体中，该构建体将被称为Prosol NC（可溶性蛋白质阴性对照）。接下来，使用蛋白表达系统（如大肠杆菌或杆状病毒）来表达带标签的蛋白，所选用的表达系统应根据翻译后修饰的需求谨慎选择。从选定的生物体中提取表达的蛋白。针对前体胰岛素原和前体胰岛素原mnc恒河猴。在含有蛋白酶抑制剂混合物的SDS-PAGE上样缓冲液中重悬细胞。然后将细胞煮沸5分钟，再离心以去除沉淀物，从而提取Prosol和prosol NC。采用标准操作步骤。pro IMS可在变性条件下提取，因为蛋白质在固定于硝酸纤维素膜后会重新折叠。然而，应提取prosol以获得天然构象，因为一旦带标签的蛋白质被提取出来，prosol将被加入到结合缓冲液中。使用标准方法（如BioRad蛋白检测试剂盒）测定重组蛋白的浓度。如果实验将使用粗提物而非纯化蛋白。通过考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上目标蛋白对应条带的扫描光密度分析，估算目标蛋白的浓度。以已知浓度的牛血清白蛋白（BSA）作为参考，根据BSA的扫描光密度测得的信号强度绘制标准曲线，并计算粗提物中所含蛋白的量。该实验步骤的下一步是将前体Iam和前体IAM NC固定在膜上。首先，将前体Iam和前体IAM NC提取物分别以每份1微克的量，重复加样至SDS聚丙烯酰胺凝胶中。电泳结束后，将凝胶从玻璃板中取出，放入100毫升转膜缓冲液中，并在室温下轻轻振荡孵育20分钟。孵育结束后，进行蛋白质印迹（western blot），将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，转移后使膜上结合的蛋白质复性。将膜置于15毫升缓冲液A中，在温和振荡条件下孵育。为去除残留的SDS，在室温下温和振荡孵育15分钟。孵育结束后，小心地将膜从缓冲液中取出，然后将其放入25毫升变性缓冲液中，在室温下轻轻振荡孵育2小时。孵育过程中，硝酸纤维素膜将变得不透明。接下来，用镊子将膜转移至25毫升TBS中，在温和振荡条件下孵育5分钟。此步骤中，膜将恢复至其原始的白色。接下来，将膜转移至25毫升结合缓冲液中，在4°C下轻轻振荡孵育过夜。随后，使用可溶性蛋白作为探针检测膜上固定的蛋白。首先，配制杂交缓冲液：在分别装有 10 毫升新鲜结合缓冲液的试管中，将 prosol 和 prosol NC 各稀释至一到十微克。然后将缓冲液转移至杂交袋中。接着，将膜切成两条，每条均包含 pro IM 和 pro IAM nc。将这些膜放入杂交缓冲液中。将每张膜转移至prosol或prosol NC杂交溶液中，在室温下轻轻振荡孵育1.5小时。从杂交溶液中取出膜，用TBS洗涤三次，每次15分钟。为了观察蛋白质-蛋白质相互作用，用含2.5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭膜1小时。孵育结束后，将封闭好的膜置于一抗溶液中。此处使用抗Strep II多克隆兔抗体。孵育结束后，在室温下轻轻振荡孵育一小时。用 20 毫升 TBST 在室温下轻轻振荡漂洗膜 15 分钟，随后再漂洗两次，每次 5 分钟。接下来将膜置于 HRP 标记的二抗溶液中。此处使用 HRP 标记的抗兔 IgG 抗体。室温下轻柔振荡孵育1小时。用20毫升TBST室温轻柔振荡洗涤膜15分钟，随后同样条件振荡洗涤两次，每次5分钟。最后一次用TBS洗涤后，使用HRP化学发光底物（Millipore）检测蛋白质-蛋白质相互作用。Im Molan Western Chemiluminescent。在目的蛋白的免疫印迹后使用 HRP 底物。室温下用 TBST 将膜漂洗 15 分钟，再重复漂洗两次，每次 5 分钟。然后使用针对标签的一抗对膜重新进行探针杂交。随后加入相应的二抗。通过检测化学发光来显示PRO I和pro Im NNC，以验证蛋白质膜覆盖实验中获得条带的身份。如图所示，利用本视频中所述方法，在烟草表皮细胞中评估了蛋白质A与K以及YFP与MP CYFP之间的相互作用。当检测双分子荧光互补时，观察到强烈的YFP信号重建。该BFC信号在细胞边缘的Punta处积累，这是质膜的诊断性特征，因为MP是一种高度不溶性蛋白。当在细菌或植物中表达时，采用蛋白膜覆盖实验来验证这一相互作用。含有1微克GST MP或未融合GST的体外蛋白提取物通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后电转至硝酸纤维素膜。当用可溶性Strep二标记的ANK STREP二探针检测这些蛋白印迹时，仅GST MP（而非未融合的GST）显示出结合信号。此外，当用无关的Strep二标记的拟南芥细胞质NADH激酶探针检测同一组蛋白印迹时，未观察到结合信号，进一步证明了ANK MP相互作用的特异性。在尝试该实验流程时，重要的是需牢记按照所提供的方案正确地重新填充固定化蛋白。

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蛋白质膜覆盖实验：检测可溶性与不溶性蛋白质相互作用的实验方案体外

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