蛋白膜覆盖含量:一个协议测试可溶性和不溶性蛋白质之间的相互作用在体外

检测蛋白质。蛋白质相互作用对于蛋白质功能的剖析是必不可少的。本视频介绍了一种体外蛋白结合测定法，用于测试膜和固定化蛋白与可溶性蛋白之间的相互作用。

首先，克隆、表达和提取融合蛋白。标记的不溶性蛋白固定在硝酸纤维素膜上，并经过处理以重新折叠至其天然确认。然后用标记的可溶性蛋白探测膜，并进行免疫印迹以检测蛋白质。

如果标记的蛋白质相互作用，它们会被固定在膜上的蛋白质捕获，并观察到来自免疫印迹的信号。因此，该测定提供了一种可靠的方法来测试不溶性蛋白质和溶液中蛋白质之间的相互作用。与 GST Pull Down 等现有容器相比，该技术的主要优点是您可以在体外可靠地评估不溶性蛋白质和可溶性蛋白质之间的结合。

该程序的第一步是生成用于检测的遗传标记蛋白质。首先克隆将固定在膜上的蛋白质。此处将 pro Im 用于将蛋白质固定到表达载体中，编码一个大标签，例如 GST，空表达载体，仅编码标签将用作固定蛋白阴性对照，称为 pro IM nc。

接下来，将用作可溶性探针的蛋白质克隆到表达载体中，编码不同的标签，例如 strep two。这将被称为 prosol for soluble protein 作为阴性对照，克隆，将阴性对照可溶性蛋白克隆到相同的表达载体中。这将被称为 Prosol NC，用于可溶性蛋白阴性对照。

接下来，使用蛋白质表达系统（如大肠杆菌或 balo 病毒）表达所使用的标记蛋白 应根据翻译后修饰的要求仔细选择所使用的表达系统。从所选生物体中提取表达的蛋白质。对于 pro IM 和 pro I mnc Resus。

将细胞悬浮在含有蛋白酶抑制剂混合物的 SDS 页面加载缓冲液中。然后将细胞煮沸 5 分钟，然后离心以去除沉淀物以提取 Prosol 和 Prosol NC。使用标准程序。pro IMS 可以在变性条件下提取，因为蛋白质在固定在硝酸纤维素膜中后会重新折叠。

然而，应提取 prosol 以提供天然确认，因为一旦提取了标记的蛋白质，它们就会被添加到结合缓冲液中。使用标准方法（如 BioRad 蛋白质检测试剂盒）测定重组蛋白的浓度。如果是粗提取物而不是纯化的蛋白质，则用于测定。

通过在 kumasi 染色的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶上扫描相应条带的光密度测定来估计目标蛋白质的浓度。使用已知浓度的 BSA 作为参考。然后根据 BSA 扫描密度测定法测量的信号强度绘制标准曲线，并计算粗提取物中所含的蛋白质量。

该程序的下一步是将 pro Iam 和 pro IAM NC 固定在膜上。首先在 SDS 聚丙烯酰胺凝胶上加载 1 微克，pro Iam 和 pro IAM NC 提取物各一式两份。电泳后，从玻璃板中取出凝胶，将其置于 100 mL 转印缓冲液中，然后在室温下轻轻搅拌孵育 20 分钟。

孵育后，进行蛋白质印迹，在转印后将蛋白质转印到硝酸纤维素膜上，以使膜结合的蛋白质重新折叠。将膜置于 15 mL 缓冲液 A 中，轻轻搅拌孵育。要去除残留的 SDS，请在室温下轻轻搅拌孵育 15 分钟。

孵育后，小心地从缓冲液中取出膜。然后将膜放入 25 毫升变性缓冲液中。在室温下孵育 2 小时，轻轻搅拌。

在孵育过程中，硝酸纤维素膜将变得不透明。接下来，使用镊子将膜转移到 25 毫升 TBS 中，并在轻轻搅拌下孵育 5 分钟。在此步骤中，膜恢复为原来的白色。

接下来，将膜转移至 25 mL 结合缓冲液中。在 4 摄氏度下孵育，轻轻搅拌过夜。接下来，可溶性蛋白将用于探测膜中固定的蛋白质。

首先，制备杂交缓冲液，在含有 10 ml 新鲜结合缓冲液的单独试管中稀释 1 至 10 μg prosol 和 prosol NC。然后将缓冲液转移到杂交袋中。接下来，将膜切成两条，均含有 pro IM 和 pro IAM nc。

这些膜将被置于杂交缓冲液中。将每个膜转移到 prosol 或 prosol NC 杂交溶液中，并在室温下轻轻搅拌孵育 1.5 小时。从杂交溶液中取出膜，在 TBS 中冲洗 3 次，每次 15 分钟。

为了可视化蛋白质蛋白质相互作用，用 TBST 中的 2.5% 脱脂牛奶封闭膜 1 小时。孵育后，将封闭的膜置于一抗溶液中。这里使用抗链球菌 2 多克隆兔抗体。

在室温下孵育 1 小时，孵育后轻轻搅拌。在 20 毫升 TBST 中冲洗膜 15 分钟，然后在室温下轻轻搅拌，每次 2 次，每次 5 分钟。接下来将膜放入 HRP 偶联的二抗溶液中 这里，使用与 HRP 偶联的抗兔 IgG 抗体。

在室温下孵育 1 小时，轻轻搅拌。在 20 毫升 TBST 中冲洗膜 15 分钟，在室温下两次，每次 5 分钟，像以前一样轻轻搅拌，在 TBS 中最后一次冲洗后，使用 HRP 化学发光底物 Here Millipore 观察蛋白质蛋白质相互作用。Im Molan Western 化学发光。

HRP 底物在对 prosol 进行免疫印迹后使用。在室温下冲洗膜和 TBST 15 分钟，然后冲洗两次，每次 5 分钟。然后用一抗重新探测膜，以寻找 pro 的标签。

Im 后跟适当的二抗。通过检测化学发光来可视化 PRO I 和 pro Im NNC，以验证在蛋白质膜覆盖测定中获得的条带的身份。使用本视频中描述的方法在烟草表皮细胞中评估蛋白质 A 和 K 以及 YFP 和 MP CYFP 之间的相互作用，如此处所示。

当评估生物分子荧光互补时，重建了强 YFP 信号。该 BFC 信号在细胞外围的 Punta 中积累，可诊断血浆，因为 MP 是一种高度不溶的蛋白质。当在细菌或植物中表达时，采用蛋白质膜覆盖测定来验证这种相互作用。

含有 1 μg GST MP 或未融合 GST 的体外蛋白提取物通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后电转印到硝酸纤维素膜上。当这些 pro iams 用可溶性 a nnk strep two GST mp 探测，但不是未融合时，GST 表现出结合。此外，当用不相关的 pro saw nc IE 拟南芥细胞质，NADH 激酶标记的链球菌 2 探测同一组 pro IMS 时，未观察到结合，进一步证明了 A NK MP 相互作用的特异性在尝试此过程时，重要的是要记住按照提出的方案正确填充固定的蛋白质。