线粒体分离：一种从人卵巢癌组织样本中分离线粒体的技术

线粒体是细胞质中的细胞器，被称为细胞的“能量工厂”，在癌症进展过程中会发生显著的结构和功能改变。

为分离线粒体，取洁净的癌组织置于玻璃皿中，并将其切碎成小块。将组织碎块转移至含有线粒体分离缓冲液的离心管中。对样品进行匀浆处理，以破坏细胞并释放其内容物，包括细胞器。

将混合物以低速离心。这会使较重的组分（如细胞核、组织碎片和任何完整的细胞）沉淀，而较轻的组分（如线粒体、微粒体、过氧化物酶体和溶酶体）则保留在上清液中。收集上清液，并以高速离心。由于微粒体相对较轻，仍保留在上清液中，而含有粗线粒体的组分则在底部形成沉淀。

弃去上清液，并将沉淀重悬于适当的密度梯度介质中。通过将粗线粒体组分依次叠加于不同密度的介质中，形成从底部到顶部密度递减的不连续密度梯度。以极高速度离心。细胞器在离心管中分离，并根据其相对密度达到平衡位置。收集在密度介质界面处形成的线粒体组分，其中含有过氧化物酶体和溶酶体。

开始此操作前，按照文本方案配制 250 毫升线粒体分离缓冲液。将约 1.5 克卵巢癌组织置于洁净的玻璃培养皿中。加入 2 毫升预冷的线粒体分离缓冲液，轻轻冲洗组织表面的血液。重复此洗涤步骤三次。

然后，使用洁净的眼科剪将组织充分剪碎至约一立方毫米大小，并将剪碎的组织转移至一个50毫升离心管中。加入13.5毫升含有浓度为0.2毫克/毫升蛋白酶（nagarse）的线粒体分离缓冲液。使用电动匀浆器在4摄氏度条件下匀浆剪碎的组织，持续两分钟。

此后，向组织匀浆中再加入 3 毫升线粒体分离缓冲液，通过移液充分混匀。将制备好的组织匀浆在 4 摄氏度下以 1,300 ×g 离心 10 分钟。弃去沉淀，保留上清液。

接下来，在 4 摄氏度条件下，以 10,000 × g 离心上清液 10 分钟。移去含有微粒体的上清液，保留沉淀。加入 2 毫升线粒体分离缓冲液，通过轻柔吹打充分重悬沉淀。

将此沉淀悬浮液在 7,000 × g、4 摄氏度条件下离心 10 分钟。弃去上清液，保留含有粗线粒体的沉淀。加入 12 毫升 25% 密度梯度介质，重悬提取的粗线粒体。按照文本方案所述，制备含有重悬粗线粒体的不连续密度梯度，并在 52,000 × g、4 摄氏度条件下离心 90 分钟。

使用一支长而钝头的注射器，从25%与30%梯度介质之间的界面处收集纯化的线粒体，并转移至一个洁净的离心管中。加入线粒体分离缓冲液，将收集的线粒体稀释至原体积的三倍。在4摄氏度下以15,000 × g 离心20分钟。弃去上清液，保留沉淀。收集最终的沉淀物（其中含有纯化的线粒体），并于-20摄氏度保存。