近端共培养系统：一种用于研究细胞间旁分泌信号传导的体外培养技术

在旁分泌信号传导中，细胞产生并分泌信号分子，从而诱导邻近细胞产生反应。为了模拟旁分泌信号传导，首先在适当的培养基中制备卵巢癌细胞和间皮细胞的单细胞悬液。

接下来，取一个倒置的多孔膜插入物放入无菌培养皿中。将癌细胞悬液用移液器滴加到插入物膜的底面，形成液滴穹顶状。孵育以使细胞沉降并贴附于膜上。

倒置小室以沥干培养基。将小室转移至含有新鲜培养基的新培养皿中，以滋养贴附在膜底面的癌细胞。随后，将间皮细胞悬液加入小室孔中。孵育使细胞贴附于膜的另一侧，从而避免两种细胞类型之间的直接接触。

在培养过程中，两种细胞均会分泌信号因子。这些分子通过多孔膜扩散至邻近细胞，与特异性细胞受体结合，并在两种细胞中诱导复杂的信号转导级联反应。

首先，用1毫升0.25%胰蛋白酶处理80%融合的卵巢癌细胞，作用40至60秒，随后加入6毫升完全培养基中和反应。通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于5毫升新鲜的完全培养基中。

计数后，将细胞稀释至每毫升完全培养基中含100,000个卵巢癌细胞，并在适当大小的无菌组织培养皿中，为每个实验条件放置三个倒置的、孔径为0.4微米、经组织培养处理的聚碳酸酯膜细胞培养小室。根据实验条件标记小室，然后小心地用移液器将癌细胞以同心圆方式从膜中央向外逐层加入每个小室的底部，形成800微升的液滴穹顶结构。

将细胞接种到插入物底部表面时需格外小心，确保含有细胞的培养基液滴在孵育过程中不会从插入物边缘流走。

当所有插入物均接种完毕后，盖上培养皿，并小心地将插入物放入细胞培养箱中。约4小时后，用2毫升0.25%胰蛋白酶处理HPMC细胞1至2分钟，随后加入12毫升完全培养基以中和反应。

通过离心收集 HPMC，并将沉淀重悬于 10 毫升完全生长培养基中进行计数。用完全生长培养基将细胞稀释至每毫升含 300,000 个 HPMC，并向 6 孔培养板的每孔中加入 2.5 毫升新鲜完全生长培养基。

使用无菌镊子将每个小室插入片正面朝上放入6孔板的每个孔中，确保下层卵巢癌细胞附着面浸没于培养基中。随后，向每个小室插入片的孔中接种1.5毫升HPMC，并将培养板置于细胞培养箱中孵育72小时。