0 次观看 • 3:34 分钟 • April 30th, 2023
腹膜是衬于腹腔内壁的膜，由一层纤维血管结缔组织支持的腹膜间皮细胞构成。转移性卵巢癌细胞会黏附于该腹膜内层，并增殖形成癌性病灶。
为了模拟卵巢癌的转移过程，首先将人成纤维细胞置于锥形管中，并与胶原蛋白（一种细胞外基质蛋白）混合。将该悬液接种到培养皿中。孵育以促进胶原基质凝固，从而包埋成纤维细胞，并模拟腹膜的结缔组织结构。
接下来，将间皮细胞悬液接种到成纤维细胞-胶原层上方。孵育培养板，使间皮细胞贴附并在成纤维细胞-胶原层表面形成单层。该三维类器官培养体系现已模拟了体内腹膜衬层的组成与结构。
最后，将卵巢癌细胞接种至该类器官培养体系中，并在所需时间内进行培养。卵巢癌细胞会释放某些信号分子，改变间皮层，从而增强癌细胞的黏附与侵袭能力，模拟体内转移条件。
为从培养物中分离正常大网膜成纤维细胞，先用10毫升PBS冲洗培养瓶，随后加入3毫升胰蛋白酶，作用时间不超过5分钟。当细胞脱落后，用至少三倍体积的完全生长培养基中和胰蛋白酶，并将细胞转移至50毫升锥形管中。离心收集细胞，将沉淀重悬于5毫升完全生长培养基中。随后对细胞进行计数，并将其稀释至每100微升完全生长培养基中含有2×10³至4×10³个成纤维细胞的浓度。
接下来，向细胞中加入每100 µL含0.5 µg的鼠尾胶原I，将每孔100 µL的细胞悬液接种至黑色透明底的96孔板中。然后将该板转移至细胞培养孵育箱中，孵育至少4小时，或直至细胞贴附于板表面。在正常大网膜成纤维细胞沉降的同时，将HPMC从其培养瓶中消化下来，并用完全生长培养基将这些细胞稀释至每50 µL含1至2 × 10⁴个HPMC。
然后，向已贴壁的正常大网膜成纤维细胞中每孔加入 50 µL HPMC，并将培养板放回细胞培养箱中孵育至少 18 小时，之后用于实验。次日，从融合度为 80% 至 90% 的培养物中，按下游实验所需适当稀释比例，将表达 GFP 的卵巢癌细胞接种至 3D 类器官共培养体系中。