间皮细胞分离:一种从人网膜组织标本中分离原代间皮细胞的技术

0 次观看4:36 分钟 • April 30th, 2023

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人类原代间皮细胞 (HPMC) 排列在许多内脏器官上,如大网膜或腹膜腔中存在的脂肪组织层。

要分离间皮细胞,首先将人网膜标本浸入合适的缓冲液中以去除多余的红细胞或红细胞。接下来,将大网膜放入玻璃盘中,切碎。这会解离组织,释放 HPMC 和污染的红细胞。

将碎片转移到锥形管中,让它们保持静止所需的时间。富含低密度脂肪的碎组织上升到顶部,而致密的细胞成分则沉降在底部。接下来,将底部含有 HPMC 和红细胞的液体吸入新鲜管中。

心以收集细胞。除去含有缓冲液的上清液。将沉淀重悬于间皮生长培养基中并孵育所需的持续时间。该培养基促进 HPMC 相对于红细胞的选择性生长。

使用光学显微镜观察细胞以确认长方体形人间皮细胞的生长。

采集手术人网膜标本后,立即将样品浸入室温PBS中。在浸泡后 2 小时内,将网膜转移到含有 20 毫升新鲜 PBS 的 50 毫升锥形管中。将含有原代人间皮细胞或HPMC和红细胞的剩余PBS洗涤液转移到新的50毫升锥形管中,并旋转细胞。

然后,将试管内容物倒入 10 厘米的无菌培养皿中,并使用两把手术刀将组织切碎成 5 立方毫米的碎片。要分离原代人间皮细胞或HPMC,请将网膜碎片转移到50毫升锥形管中,并等待1分钟,使固体碎片漂浮到顶部。HPMC 将与红细胞一起沉降在管底部。

使用移液器将含有间皮细胞和红细胞的PBS洗涤液转移到含有沉淀细胞的试管中,并旋转细胞。然后,向大网膜中加入20毫升新鲜PBS,并像刚刚对原始沉淀细胞所示,再收集3次含有PBS的HPMC和RBC。

最后一次旋转后,将细胞接种在75平方厘米的烧瓶中,放入15毫升的完全生长培养基中。要从网膜样品中分离出额外的HPMC,请在200 RPM和37摄氏度下摇动剩余的固体组织在20毫升PBS中。10分钟后,让样品静置1分钟,让实体组织上升到管的顶部。

然后,如刚才所示,从管底部收集HPMC和红细胞。现在,从二次洗涤中旋转细胞,并将它们接种在单独的 75 平方厘米烧瓶中,放入 15 毫升完全生长培养基中。要分离任何剩余的HPMC,请在PBS和10毫升胰蛋白酶-EDTA的混合物中再摇动组织10分钟,然后将这些HPMC和RBC接种在75平方厘米的烧瓶中。

然后,将培养物在37摄氏度和5%二氧化碳的加湿环境中孵育。在第 3 天和第 5 天用 15 毫升新鲜的完全生长培养基喂养铺板细胞,而不去除用过的培养基。HPMC 可以通过其长方体形状以及细胞角蛋白 8 和波形蛋白的表达来识别。

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最后更新:1 八月 2026