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前列腺上皮主要包括基底上皮细胞和管腔上皮细胞。单层基底细胞形成腺体的外层并支持管腔细胞存活。相反，管腔细胞排列在管腔上并分泌前列腺特异性蛋白质。
要研究离体前列腺上皮分化，首先悬浮基底前列腺上皮细胞。将悬浮液与冷却的基底膜基质以所需比例混合。将这种混合物移液到细胞驱虫剂培养板内壁底部旁边。旋转混合物的板，使其沿孔的圆周形成一个环。
孵育板以使基质凝固。用首选培养基补充培养物。培养基中的生长因子支持基底上皮细胞的增殖。同时，培养皿的细胞驱避性质可防止任何细胞附着，鼓励细胞在基质内形成 3D 球体。
随着时间的推移，球体会形成与多层上皮接壤的管腔。管腔内衬基底上皮细胞最终分化并形成分泌管腔细胞，产生 3D 腺体结构。
按照文本方案中所述，从制备小鼠基底和管腔前列腺上皮细胞开始此过程。在500微升小鼠类器官培养基中洗涤细胞沉淀。然后，以每微升 1,000 个细胞的细胞密度重悬沉淀。要制备预混液，请将悬浮在小鼠类器官培养基中的上皮细胞与基质凝胶混合，以生成含有 25% 培养基细胞和 75% 基质凝胶的最终混合物。根据下游应用，基底细胞通常以每 80 微升 100 至 2,000 个细胞的浓度接种，而管腔细胞的接种浓度为每 80 微升 2,000 至 10,000 个细胞。
对于每种细胞混合物，每孔 24 孔板添加 80 微升基质凝胶。将液滴移液到孔壁的下半部分，同时避免直接接触聚 HEMA 涂层。加入基质凝胶后，旋转板，使基质凝胶细胞混合物在孔边缘周围形成一个环。将 24 孔板放入 37 摄氏度的 5% CO2 培养箱中，正面朝上，放置 10 分钟，以使基质凝胶部分硬化。
孵育10分钟后，将24孔板倒置并再孵育50分钟，使基质凝胶完全硬化。然后，将 350 微升预热的小鼠类器官培养基滴滴到每个孔的中心。添加培养基后，将 24 孔板放回培养箱中。
要补充小鼠类器官培养基，请将 24 孔板倾斜 45 度角，并使用 P1000 移液器轻轻地从每个孔的中心去除现有培养基，同时避开基质凝胶环。像以前一样加入350微升预热的小鼠类器官培养基。建议在培养超过五天的类器官中添加大量培养基，以防止关键营养素和生长因子快速耗尽。
